אנו מודים אנדרו קרול, מוארת Chaibang, Purbasha Sarkar (אנרגיה Biosciences המכון, ברקלי), בהרם פרווין (המעבדה הלאומית לורנס ברקלי) ווינסנט ל צ&#39;אנג (צפון קרוליינה סטייט) על שיתוף הפעולה הפורה ודיונים מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי אנרגיה Biosciences המכון. העבודה בבית היציקה מולקולרית נתמך על ידי משרד המדע, משרד האנרגיה של יסוד מדעי, של משרד האנרגיה של ארה&quot;ב תחת חוזה מס &#39;DE-AC02-05CH1123.

1. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מדגם צמח התייבשות, למשל גזע עץ צפצפה או גזע thaliana ארבידופסיס, ב microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים חלקים דקים (בדרך כלל 20 מיקרומטר עבה) מרקמות הילידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת בסעיף צמח לשקופית מיקרוסקופ זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את סעיף צמח ב D 2 O ומכסים להחליק זכוכית לכסות, אשר חתום לשקופית מיקרוסקופ כדי למנוע אידוי של D 2 O. החלק צמח מוכן כעת הדמיה או שזה יכול להיות מאוחסן לשימוש עתידי. </li></ol> 2. לדוגמה מדידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל שמן טבילה למטרה מיקרוסקופ ו / או להחליק לכסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום ומאובטח השקופית מיקרוסקופ על הבמה סריקה פיזואלקטריים של המיקרוסקופ, עם תלוש את הכיסוי מול המטרה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה המדגם דרך להחליק את מכסה באמצעות טבילה גבוהה מספרי הצמצם אובייקטיבי מיקרוסקופ (100x, NA = 1.40) ולאתר את שטח מדגם של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידות microspectroscopic לאחר לכבות כל שאר מעבדה מיקרוסקופ מקורות אור, עמדת נפתרה מבוצעים על ידי התמקדות bandpass סינון אור ירוק מונוכרומטי (λ = 532 ננומטר) של CW-לייזר על המדגם עם כוח טיפוסי של mW 10-30 ( ראה איור 1 עבור סכמטי של ההתקנה). Autofluorescence יכול להתרחש כמה דוגמאות, אשר עשוי לאסור מדידות שימושי, שבו עירור המקרה עם אור לייזר באורך גל ארוך יותר עשוי להיות מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האור האחורי מפוזרים ראמאן סטוקס-מוזז נאסף על ידי המטרה מיקרוסקופ, עובר דרך מראה dichroic, חריר, המשמש כמסנן המרחבית בהגדרת confocal, ומסנן longpass, והוא ממוקד לתוך החריץ של סבכת ספקטרומטר, שם את האור מתפזר spectrally ו זוהה על ידי מצלמת CCD מקורר, נותן ספקטרום ראמאן. ספקטרום ראמאן של עץ צפצפה מוצג באיור 2, עם להקות ליגנין אופייני באזור ספקטרלי בין 1600 ו - 1700 -1 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור דימות כימי ויזואליזציה של התפלגות מרחבית ליגנין, מפה דו מימדי ספקטרלי היא נרכשה על ידי סריקה סריקה המדגם דרך ההתמקדות לייזר עם שלב הסריקה פיזואלקטריים הקלטה ספקטרום ראמאן לכל תפקיד המדגם. תלת ממדי מפות ספקטרלי עשוי להיות שנוצר על ידי הערמה דו מימדי מפות עבורו מוקד לייזר היה צעד ברציפות לאורך בכיוון-z. </li></ol> 3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור דימות כימי ויזואליזציה ליגנין, הנתונים שנאספו מנותח באמצעות MATLAB (MathWorks, גרסה 7.7). הנתונים מסודרים קוביה תלת מימדי היפרספקטראלית, המורכבת משני ממדים מרחביים מימד שלישי עבור אותות ספקטרליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח ליגנין, באזור ספקטרלי בין 1550 ו - 1700 -1 ס&quot;מ נחשב (ראה איור 2). הפריסה המרחבית של ליגנין הוא מדמיין על ידי שילוב העוצמה של 1,550 עד 1,700 -1 ס&quot;מ של ספקטרה הבסיס, תיקן (ראה איור 3). כחלופה תיקון הבסיס, נגזרת שנייה ספקטרום עשוי להיות מחושב ואת השנייה נגזרת פסגות משמש לצורך ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוקליזציה ליגנין וכימיה, במיוחד בכל הנוגע coniferaldehyde ו moieties coniferyl אלכוהול, יכול להיות מנותח עוד יותר על ידי הערכת השטח מתחת מצויד פסגות גאוס של שלוש להקות נמצא בין 1600 ו - 1700 -1 ס&quot;מ (ראה איור 2 הבלעה של השופטים ו 15. - 17). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נורמליזציה אינטנסיביות בין מפות שונות ספקטרלית מבוצע באמצעות כהתייחסות את גובה השיא של הלהקה OD חיצוני מתיחות סביב 2,500 -1 ס&quot;מ בספקטרום לומן בממוצע, אשר מתקבלים על ידי k-אמצעי סיווג באשכולות. זה קריטי ומאפשר להשוות עוצמות ליגנין אות בין המדידות, רקמות שונות, דגימות ומינים. </li></ol> 4. נציג תוצאות ספקטרום ראמאן נציג של עץ (Populus angustifolia) גזע צפצפה מוצג באיור 2. להקות ליגנין מאפיין נמצאים באזור ספקטרלי בין 1600 ו - 1700 -1 ס&quot;מ. כדוגמה, הפצה המרחבי של ליגנין בתוך חתך עץ צפצפה מוצג באיור 3. לעומת התמונה לעין, להבדיל מורפולוגית קיר התא אזורים הפכו להבחין בבירור בשל עוצמת האות ליגנין שונים. עוצמת אות גבוהה ליגנין הוא ציין בפינות התא (CC) ו, קצת פחות, ב lamellae מתחם באמצע (CML). כמויות נמוכות, אך לא ממשית, של ליגנין נשמרים בתוך שכבת הקיר S2 של הסיבים. השתנות של עוצמת האות ליגנין מצוי במידה מסוימת בתוך CC, CML ו S2, במיוחד סיבים סיבים. ברזולוציה מרחבית לרוחב במדידות שלנו ~ 300 ננומטר. איכות נתונים משאיל את עצמו היטב להשוות בין lignificationדגימות כדי להמשיך לנתח ליגנין כימיה 15. <img src="/files/ftp_upload/2064/2064fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: סכימטי של הגדרת תפקיד BP:. Bandpass מסנן: DM: המראה dichroic, PH: חריר, LP: longpass הסינון. <img src="/files/ftp_upload/2064/2064fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: ספקטרום ראמאן נציג של עץ (Populus angustifolia) גזע צפצפה נרשם D 2 O. אזור ספקטרלי מודגשות (גם לראות את הבלעה) מסמן את האזור רפאים לאחר שלוש פסגות לייחס ספציפית ליגנין. <img src="/files/ftp_upload/2064/2064fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3: ראמאן תמונה ליגנין (התחתון) של חתך עץ צפצפה (למעלה: תמונת גלוי), שהושג על ידי שילוב של עוצמת האות ראמאן מ 1550 ל 1700 cm -1.

<ol>
	<li>Herrera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bonkers+about+biofuels.">Bonkers about biofuels.</a> Nat Biotechnol. 24, 755-760 (2006).</li><li>Himmel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomass+recalcitrance:+Engineering+plants+and+enzymes+for+biofuels+production.">Biomass recalcitrance: Engineering plants and enzymes for biofuels production.</a> Science. 315, 804-807 (2007).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels.">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54, 559-568 (2008).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+metabolism+'Tear+down+this+wall.">Physiology and metabolism 'Tear down this wall.</a> Curr Opin Plant Biol. 11, 233-235 (2008).</li><li>Ragauskas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+forward+for+biofuels+and+biomaterials.">The path forward for biofuels and biomaterials.</a> Science. 311, 484-489 (2006).</li><li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofuels.">Biofuels.</a> Curr Biol. 17, R115-R119 (2007).</li><li>Ralph, J., Brunow, G., Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lignins in Encyclopedia of Life Sciences. , (2007).</li><li>Chiang, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+rags+to+riches.">From rags to riches.</a> Nat Biotechnol. 20, 557-558 (2002).</li><li>Atalla, R. H., Agarwal, U. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+microprobe+evidence+for+lignin+orientation+in+the+cell+walls+of+native+woody+tissue.">Raman microprobe evidence for lignin orientation in the cell walls of native woody tissue.</a> Science. 227, 636-638 (1985).</li><li>Atalla, R. H., Agarwal, U. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+Raman+spectra+from+plant+cell+walls.">Recording Raman spectra from plant cell walls.</a> J Raman Spectrosc. 17, 229-231 (1986).</li><li>Fukushima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+syringyl+to+guaiacyl+ratio+in+lignin+biosynthesis.">Regulation of syringyl to guaiacyl ratio in lignin biosynthesis.</a> J Plant Res. 114, 499-508 (2001).</li><li>Agarwal, U. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+imaging+to+investigate+ultrastructure+and+composition+of+plant+cell+walls:+distribution+of+lignin+and+cellulose+in+black+spruce+wood+(Picea+mariana).">Raman imaging to investigate ultrastructure and composition of plant cell walls: distribution of lignin and cellulose in black spruce wood (Picea mariana).</a> Planta. 224, 1141-1153 (2006).</li><li>Gierlinger, N., Schwanninger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+imaging+of+poplar+wood+cell+walls+by+confocal+Raman+microscopy.">Chemical imaging of poplar wood cell walls by confocal Raman microscopy.</a> Plant Physiol. 140, 1246-1254 (2006).</li><li>Gierlinger, N., Schwanninger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+Raman+microscopy+and+Raman+imaging+in+plant+research.">The potential of Raman microscopy and Raman imaging in plant research.</a> Spectrosc Int J. 21, 69-89 (2007).</li><li>Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+situ+imaging+of+lignification+in+the+cell+wall+of+low+lignin+transgenic+Populus+trichocarpa.">Label-free in situ imaging of lignification in the cell wall of low lignin transgenic Populus trichocarpa.</a> Planta. 230, 589-597 (2009).</li><li>Agarwal, U. P., Argyropoulos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Overview+of+Raman+Spectroscopy+as+Applied+to+Lignocellulosic+Materials.">An Overview of Raman Spectroscopy as Applied to Lignocellulosic Materials.</a> Advances in Lignocellulosics Characterization. , 201-225 (1999).</li><li>Agarwal, U. P., Ralph, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+ethylenic+residues+in+wood+and+TMP+of+spruce+by+FT-Raman+spectroscopy.">Determination of ethylenic residues in wood and TMP of spruce by FT-Raman spectroscopy.</a> Holzforschung. 62, 667-675 (2008).</li><li>Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+imaging+of+cell+wall+polymers+in+Arabidopsis+thaliana.">Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana.</a> Biochem Biophys Res Comm. 395, 521-523 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

חומרים Lignocellulosic הם היררכי הטרוגנית מבחינת המבנה והן בהרכב. במשך מעמיק כלים אפיון אנליטי כי יש רגישות כימיים, ברזולוציה מרחבית, וכי לתת תובנות חומרים אלה בהקשר יליד רצויות. השיטה המתוארת מאפשרת ויזואליזציה של ליגנין והשוואה של lignification של ביומסה הצמח lignocellulosic עם רזולוציה מרחבית זה משנה מיקרומטר ללא כתמים או תיוג של דגימות קרוב למדינה המקורית. זה דורש הכנה מדגם מינימלי המדידות הן הרסניות ולא יקר יחסית. השיטה יכולה להיות שימושית בהערכת lignification קשורה למספר רב של אוכלוסיות הרבייה. בנוסף ליגנין, ספקטרום ראמאן מכילים גם טביעות אצבעות ספקטרלית של תאית ואת hemicelluloses, אשר יכול לכלול ניתוח מקיף.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>nail polish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>immersion oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>tweezers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pointed brush</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microtome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>confocal Raman microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

label-free in situ imaging of lignification in plant cell walls

פגישה דרישות האנרגיה הגוברת בבטחה וביעילות הוא אתגר עולמי הקשה. לכן, מחקר וייצור דלק ביולוגי, המבקשת למצוא פתרונות חסכונית וברת קיימא הפכה משימה אקטואלי וביקורתי. ביומסה Lignocellulosic צפוי להיות המקור העיקרי של ביומסה לגיור כדי דלקים נוזליים 1-6. עם זאת, סרבנות של חומרים אלה תא צמח קיר השפלה חסכונית ויעילה מהווה מכשול מרכזי עבור השימוש בהם לייצור דלקים וכימיקלים 4. בפרט, ליגנין, מורכב סדיר מרובה phenylpropanoid heteropolymer, הופך להיות בעייתי בפירוק postharvest של ביומסה lignocellulosic. לדוגמה בהמרת ביומסה דלק ביולוגי, זה מעכב saccharification תהליכים שמטרתם לייצר סוכרים פשוטים עבור תסיסה 7. שימוש יעיל של ביומסה הצמח למטרות תעשייה היא למעשה תלויה במידה רבה במידה שבה את דופן התא הצמח lignified. הסרת ליגנין הוא גורם יקר הגבלת 8 ו ליגנין ולכן יש להפוך לגידול הצמח מפתח יעד הנדסה גנטית כדי לשפר את ההמרה קיר התא. כלים אנליטיים המאפשרים אפיון מהיר ומדויק של lignification קירות תא הצמח הופך יותר ויותר חשוב להערכת מספר רב של אוכלוסיות הרבייה. נהלים עקורה עבור בידוד של מרכיבים מקומיים כגון ליגנין הרסניים באופן בלתי נמנע, להביא כימי משמעותי שינויים מבניים 9-11. שיטות כימיות אנליטיות באתרו ובכך הם כלי רב ערך עבור אפיון ההלחנה מבניים של חומרים lignocellulosic. מיקרוסקופיה ראמאן היא טכניקה מסתמכת על פיזור ראמאן קשיח או של אור מונוכרומטי, כזה מן לייזר, שבו שינוי אנרגיה של פוטונים לייזר קשורה תנודות מולקולריות מציג מהותי ללא תווית &quot;טביעת אצבע&quot; המולקולרי של המדגם . מיקרוסקופיה ראמאן יכול להרשות מדידות בלתי הרסניות וזול יחסית עם הכנה מדגם מינימלי, נותן תובנות לגבי ההרכב הכימי ואת המבנה המולקולרי קרוב למדינה המקורית. דימות באמצעות מיקרוסקופ כימית ראמאן confocal שימש בעבר עבור להדמיה של התפלגות מרחבית של תאית ליגנין בתא קירות עץ 12-14. בהתבסס על תוצאות אלו קודם לכן, אימצנו לאחרונה בשיטה זו כדי להשוות lignification בסוג בר ליגנין מחסר מהונדס Populus trichocarpa (שחור צפצפה) גזע עץ 15. ניתוח ראמאן להקות ליגנין 16,17 באזור ספקטרלי בין 1600 ו - 1700 -1 ס&quot;מ, עוצמת האות ליגנין ולוקליזציה מופו באתרם. הגישה שלנו דמיינו הבדלים בתוכן ליגנין, לוקליזציה, ואת ההרכב הכימי. לאחרונה, הראינו הדמיה ראמאן של פולימרים קיר התא thaliana ארבידופסיס עם רזולוציה לרוחב זה משנה 18 מיקרומטר. הנה, שיטה זו מוצגת והנותן להדמיה של ליגנין בדפנות תא הצמח והשוואת lignification ברקמות, מדגמים שונים או מינים ללא כתמים או תיוג של הרקמות.

Watch this Scientific Journal Video about Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls at JoVE.com

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

השיטה מבוססת על מיקרוסקופיה ראמאן confocal מוצג שמקנה ללא תווית להדמיה של ליגנין בדפנות תא הצמח והשוואת lignification ברקמות, מדגמים שונים או מין.

ללא תווית באתרו הדמיה של Lignification בתוך קירות התא הצמח

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

label-free-in-situ-imaging-of-lignification-in-plant-cell-walls

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

12.4K Views.  University of California, Berkeley. השיטה מבוססת על מיקרוסקופיה ראמאן confocal מוצג שמקנה ללא תווית להדמיה של ליגנין בדפנות תא הצמח והשוואת lignification ברקמות, מדגמים שונים או מין.

Video: Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

בתחום ההדמיה באתרו של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק א: ליגנין

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק II: פחמימות

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic beta-cell proliferation and islet growth is particularly challenging. We have developed a method to capture the distribution of beta-cells in the intact pancreas of transgenic mice with fluorescence-tagged beta-cells with a macro written for ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij/). Following pancreatic dissection and tissue clearing, the entire pancreas is captured as a virtual slice, after which the GFP-tagged beta-cells are examined. The analysis includes the quantification of total beta-cell area, islet number and size distribution with reference to specific parameters and locations for each islet and for small clusters of beta-cells. The entire distribution of islets can be plotted in three dimensions, and the information from the distribution on the size and shape of each islet allows a quantitative and qualitative comparison of changes in overall beta-cell area at a glance.

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

The following protocol outlines the process of pancreatic dissection for virtual slice imaging, and the subsequent quantification of all GFP-tagged beta-cells in the entire pancreas.

ב כימות באתרו של המיסה הלבלב בטא תא עכברים

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

-Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

זיהוי של הרגולטורים הרומן של דיות צמח על ידי הקרנת הדמיה תרמית בקנה מידה גדול בהליוציץ השנתי

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

ללא תווית באתרו הדמיה של Lignification בתוך קירות התא הצמח

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video