We thank Dr. M. Rosenberg for her advice and help with anatomical sectioning. We also thank D. Eisler for his technical assistance. This research was supported by grants from FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09), and Israel Science Foundation (ISF; 592/13).

1. Crecimiento de las Plantas <ol><li> Superficie esterilizar semillas. <ol><li> Esterilizar semillas (hasta 30 mg) por el método húmedo o seco. Como ejemplo, para el método de esterilización en seco, añadir 1 ml glacial HCl 37% en 50 ml de lejía, en un vaso de vidrio en un desecador cerrado durante al menos 4 horas y hasta durante la noche. Realice este paso en una campana química. </li></ol></li><li> Esparcir las semillas estériles en placas con agar planta de 0,8% en 0.5x Murashige y Skoog (MS). Envolver las placas con Parafilm o cinta porosa y cubrir con papel de aluminio. </li><li> Almacenar las placas a 4 ° C durante 1 - 4 días para promover la germinación uniforme. </li><li> La transferencia de las placas a una cámara de crecimiento adecuado para el cultivo de plantas de semillero de Arabidopsis. Colocar las placas verticalmente para mantener el crecimiento de la raíz en la parte superior del medio de agar y para evitar la penetración. </li><li> plántulas de transferencia de fijador de 7 días después de la germinación (DAG). </li></ol> 2. Fijación <ol><li> Preparar 50 ml Richardson Solution combinando volúmenes iguales de bórax al 1% (agente tampón), 1% y azul de metileno al 1% Azure (colorantes histológicos) en agua doblemente destilada. Se filtra a través de una jeringa Driven 0,22 micras Unidad de PVDF filtro antes de su uso. </li><li> Preparar 50 ml de fijador: 1,25% de glutaraldehído en cacodilato de sodio 0,05 M (agente tampón). Nota: Estos materiales son tóxicos y deben manejarse en una campana química. </li><li> Añadir 100 l de solución de Richardson (véase 2.1) a la solución de fijación (véase 2.2) para obtener la solución de fijación final. </li><li> Marque cada pocillo de una placa de 6 pocillos con el nombre de la muestra correspondiente. </li><li> Coloque 2 - 3 ml de solución de fijación final (véase 2.3) en los pocillos, de modo que las plantas de semillero, una vez transferidos, serán íntegramente en el líquido. </li><li> Transferir cuidadosamente, utilizando pinzas, hasta 10 plantas de semillero a cada pocillo. Sellar las placas utilizando Parafilm. Almacenar a 4 ° C, en la oscuridad, por lo menos durante una noche, y hasta una semana. </li></ol> 3. La deshidratación <ol> &lt;li&gt; Deshidratar plántulas. Transferirlos entre pozos de nuevas placas de 6 pocillos, que contiene concentraciones crecientes de etanol, que se enumeran aquí: 10% de etanol durante 15 min; 30% de etanol durante 15 min; 50% de etanol durante 15 min; 70% de etanol durante 15 min; 85% de etanol durante 15 min; 95% de etanol durante 15 min; 95% de etanol a 4 ° C, durante la noche, como mínimo. Manejar plántulas agarrando cuidadosamente por sus cotiledones, preferible con unas pinzas de plástico. </li></ol> 4. infiltración <ol><li> Preparar medio de infiltración. Mezclar el contenido de la bolsa 1 del activador del kit Historesin con 50 kit líquido de resina básica ml en una pequeña botella de vidrio. Agitar con el imán durante 20 minutos. medio de la infiltración puede mantenerse a 4 ° C durante unas semanas. </li><li> Marcar cada pocillo de una nueva placa de 6 pocillos con el nombre de la muestra correspondiente y se llenan de 2 - 3 ml de medio de infiltración. </li><li> Transferencia de las plántulas de la solución de etanol al 95% al ​​medio de infiltración usando fórceps. Asegúrese de que las plántulas son fuLLY cubierto por el medio. </li><li> Almacenar a 4 ° C durante al menos 4 días, para asegurar la máxima penetración en los tejidos de la planta. </li></ol> 5. Bloque de Preparación <ol><li> Coloque pequeñas etiquetas, lápiz, marcado con el nombre de la muestra, dentro de cada pocillo de la incrustación de moldes. </li><li> Preparar el medio de inclusión mediante la adición de endurecedor 1 ml a 15 ml de medio de infiltración (véase 4.1). No intente preparar un menor volumen de 15 ml, para evitar problemas de polimerización. </li><li> Llene la mitad de cada pocillo en el molde con 200 l medio de inclusión y cubrir con una pieza de película encima de la cabeza de corte a la forma del molde, pero a un tamaño de 1 mm más grande en cada lado. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 2 horas, para permitir la polimerización. No exceda de 5 horas. </li><li> Preparar un lote adicional de medio de inclusión (véase 5.2) y mantener en hielo, para evitar la polimerización mientras puntas de las raíces están dispuestos en el molde. </li><li> Cortar cada punta de la raíz bajo un microscopio de disección usando bisturí y posicionar con mucho cuidado it: verticalmente para las secciones transversales u horizontalmente para la sección longitudinal, en alrededor de 2 - 3 mm desde la periferia del molde. Llenar el molde por completo con la solución y la tapa de bloqueo con una película por encima. Tenga en cuenta que la solución de bloqueo se reducirá ligeramente una vez que se polimeriza. </li><li> Mantener a temperatura ambiente durante 2 horas, como mínimo. </li><li> Para secar los bloques, colocar en una caja con gel de sílice seca y dejar a temperatura ambiente durante la noche, como mínimo. </li></ol> 6. Seccionamiento <ol><li> Preparar cuchillas de vidrio a partir de varillas de vidrio con un fabricante de cuchillos. Utilice las cuchillas de vidrio para seccionar los tejidos. Cortar la varilla de vidrio en un cuadrado y luego se corta en diagonal la plaza para producir dos cuchillos, utilizando una herramienta de puntuación de diamantes. </li><li> Bloqueo de los tramos en 2 - 3 micras rodajas de ancho, utilizando una máquina de corte. Coloque las rebanadas sobre un portaobjetos de vidrio, en la parte superior de las gotas de agua destilada y colocar la placa en un bloque de calor ajustado a fuego lento (50 - 60 ° C), hasta que el agua se evapora. </li></ol><ol><li> Diluir solución Richardson (ver 2.1) a 0.2% de la solución original y el uso de 1 ml de la misma para cubrir las rebanadas. Colocar en el bloque de calor durante 5 segundos y luego lavar con agua destilada. </li><li> Secar el portaobjetos en una placa caliente. Observe bajo un microscopio de disección y marcar la parte de atrás de la corredera con un marcador, para indicar la posición de las rebanadas de interés, para facilitar su posterior identificación en el microscopio. </li><li> Añadir 100 l de medio de montaje y cubierta con una hoja de la cubierta. </li></ol> 8. Adquisición de imágenes <ol><li> Colocar el portaobjetos cubierto que contiene las secciones de raíces bajo un microscopio de luz equipado con sistema de Polscope adecuado para obtener información de retardancia y un filtro polarizador / interferencia óptica (Figura 1 AD). </li><li> Seleccionar ampliación que permite una visualización clara de toda la muestra (por ejemplo, 40X en este estudio) y enfocar la microscope en un campo vacío que contiene sección de bloque, pero ninguna sección de la raíz. Tratar de encontrar una región limpia, sin manchas. Utilice esta región para establecer el fondo. </li><li> Ajuste el sistema de formación de imágenes y parámetros del software: Rango de Ajuste a 17 nm. Aplicar &quot;exposición automática&quot; y obtener una imagen de fondo del campo vacío (véase 8.2). Una imagen de fondo se utiliza por experimento. </li></ol> 9. Análisis Polscope de celulosa microfibrillas Orientación <ol><li> El análisis de secciones longitudinales. <ol><li> Colocar un portaobjetos que contiene secciones longitudinales bajo el microscopio y obtener una imagen de retardancia de la misma. Enfocar el microscopio en una sección de la raíz de interés. Proporcionar un nuevo nombre de archivo. </li><li> Capturar una imagen abrio (imagen con información de retraso) a través de la ventana &quot;Live Abrio&quot;. Asegúrese de capturar una sección que incluye la pared celular, que puede ser identificado por la celulosa manchada corriendo a lo largo de la periferia de la célula, como se muestra en la Figura 2C.</li></ol></li><li> Análisis de imagen. <ol><li> Haga doble clic en la imagen correspondiente en la pila de imagen. Seleccione &quot;Color de Orientación Pseudo&quot; en la pestaña &quot;Configuración de pantalla&quot;. </li><li> Para estimar el ángulo de microfibrillas de celulosa, juego con el color correspondiente de la pared celular a la de la rueda de color. NOTA: La rueda de color en la figura 2C refleja el eje lento de la luz situada a lo largo del microfibrillas que indica la dirección a lo largo del eje longitudinal de las microfibrillas. El ángulo de microfibrillas de celulosa es el ángulo indicado por el color y el eje longitudinal de la célula. Por ejemplo, la célula de alargamiento en el recuadro muestra de color cian, inclinado aproximadamente 90 ° con respecto al eje longitudinal de las células. </li><li> Para cuantificar el ángulo medio de microfibrillas en la pared celular, utilizar la herramienta de &quot;retardo de acimut y sello&quot; de la barra de herramientas del software. Durante la selección de la herramienta, apuntar y hacer clic en la región de interés en la imagen obtenida. NOTA: Este Will resultado en la pantalla de los ángulos (azimut) en grados (Figura 2C). </li><li> En un acceso abierto y el software de análisis de imágenes de luz polarizada alternativa, el almuerzo plug-in &quot;Pol-Analizador&quot; en el menú de plugins. En la nueva ventana que se abre, seleccione la ficha &quot;birrefringencia&quot; y abra y guarde el archivo de fondo y el archivo de imagen. </li><li> En la ventana de la imagen, seleccione &quot;Especificaciones&quot;. y ajustar el &quot;tamaño de píxel de ROI (uso de 5 píxeles para este estudio). En el &quot;Especificaciones&quot;. ventana, seleccione &quot;valores muestran en Tabla de resultados&quot;. </li><li> Usar la herramienta Polígono para marcar la región de interés en la ventana de imagen. Seleccione &quot;líneas de orientación&quot; para obtener la orientación de la microfibrillas de celulosa. NOTA: Esto dará lugar a la visualización de los ángulos (azimut) en grados. NOTA: El ángulo promedio calculado por uno de los dos métodos se debe entonces normalizó a la colocación de la sección de la raíz a lo largo de la corredera. Para corregir la desviación deel posicionamiento horizontal de toda la sección de la raíz a lo largo de la corredera, cuantificar el ángulo medio de microfibrillas de la pared celular que flanquean la célula a lo largo de su eje largo (es decir, perpendicular a la sección y a lo largo del eje de crecimiento de la raíz, la Figura 2C). Este ángulo es de 180 °, cuando la sección de la raíz se posiciona con precisión a lo largo de la corredera. Para el cálculo del ángulo de microfibrillas, restar el ángulo de microfibrillas medio medido de la pared celular de flanqueo a partir de 180 °. Añadir la diferencia dado lugar al ángulo de microfibrillas media medida de la pared celular que se encuentra plana en la diapositiva. </li></ol></li></ol> 10. Análisis Polscope de celulosa cristalina Acumulación <ol><li> Utilice las secciones transversales (cross). Tenga en cuenta que la acumulación de celulosa cristalina sólo puede compararse entre las células cuando sus microfibrillas de celulosa están alineados en un ángulo similar (como se determina en 9). </li><li> Haga doble clic en la imagen correspondiente en la pila de imagen. Seleccione &quot;PSeudo de color &quot;en la pestaña&quot; Configuración de pantalla &quot;. </li><li> Para medir el retardo de la. Zoom en la imagen. Seleccione &quot;Región&quot; y marcar todas las regiones de interés. Mover a la pestaña &quot;medidas&quot; y &quot;Copiar al portapapeles&quot; todos los valores. <ol><li> Transferir los datos a Excel y extraer la información requerida (media de retraso de la región). Normalizar los datos. NOTA: Para tener en cuenta las diferencias de espesor entre las rebanadas, expresa los valores relativos a un borde de la pared celular específico en la diapositiva. Para normalizar, dividir el retardo de la media correspondiente a la pared de célula de interés por el retardo de la media de una pared celular diferente en la misma imagen. Por ejemplo, la pared celular epidérmica exterior se normalizó a la pared celular cortical interior en nuestro estudio. </li></ol></li><li> Repetir las mediciones para al menos 3 secciones por la raíz, con un mínimo de 3 raíces por muestra. </li></ol>

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The authors have no conflicts of interest.

A continuación, presentamos un método para la determinación de la acumulación de celulosa cristalina en los diferentes tejidos que componen las raíces de Arabidopsis, mientras que el mantenimiento de información anatómica. Como tal, proporciona un paso adicional hacia la comprensión de los procesos de crecimiento de las plantas con resolución celular. Este método también se puede aplicar para el estudio de especies y órganos de las plantas adicionales. Un número de puntos debe ser considerado cuando se aplica el método. En primer lugar, la acumulación de celulosa cristalina en una sección de raíz dado puede compararse entre los tejidos, entre secciones de diferentes genotipos y entre los tratamientos, si la orientación de sus microfibrillas de celulosa es similar. Orientación microfibrillas de celulosa se ​​determina en la sección longitudinal que contiene una cara de la pared de la célula 18. Por lo tanto, la serie de secciones longitudinales, que cubre los tejidos distintos de las raíces, desde el exterior a los interiores la mayoría de los, permiten analyses de la orientación microfibrillas de celulosa en los diferentes tejidos, en una etapa de desarrollo dado. En el ejemplo que se muestra aquí, las células meristemáticas de la epidermis tienen una amplia gama de microfibrillas de celulosa orientaciones con un ángulo medio microfibrillas de celulosa de 140 °, mientras que las células alargándose de la epidermis tienen una estructura más organizada, con un ángulo medio microfibrillas de celulosa de 120 °. Estas mediciones fueron similares entre los de tipo salvaje y el mutante de interés, lo que permite una comparación seguros de su acumulación celulosa cristalina relativa, en los tipos de células correspondientes y de la zona de desarrollo. En segundo lugar, la variabilidad en la anchura de las diferentes secciones puede afectar los niveles de retardo de la luz medida. Esto se evita aquí por la normalización de las mediciones de retardo de primas del tejido de interés (células de la epidermis) para la medición de retardo de la de un tejido diferente (células de la corteza). Los valores normalizados are comparó entonces (Ver Figura 2E-G). Por último, las secciones transversales a lo largo de la raíz, captan diferentes zonas de desarrollo. La identificación de estas zonas en la sección transversal es importante para la interpretación de los datos. La pérdida de la capa de células tapa raíz lateral más externa en la sección comprenden un marcador de zona de sencillo. En general, las células comienzan su expansión rápida cuando la célula más antigua de la tapa de la raíz lateral somete a la muerte celular programada, después de lo cual, la epidermis no protegidos se convierte en el tejido más exterior 19. Actualmente, los métodos que proporcionan una medida de la resolución celular de la relación entre el cristalino frente a los dominios celulosa amorfa se carece. De hecho, esta es también una limitación del método que aquí se presenta. Sin embargo, su capacidad de comunicar la acumulación de celulosa cristalina per se es un avance significativo, ya que los altos niveles relativos de celulosa cristalina probable rinde un máspared celular robusto con una mayor resistencia a la tracción. Desarrollo de herramientas de alta resolución para determinar con precisión la composición de la pared celular, junto con sus propiedades mecánicas sigue siendo un reto de futuro.

La pared celular vegetal es una estructura dinámica. las células que crecen están rodeados por una pared celular primaria, la organización de la que permite que las células se expanden. Las células que dejan de crecer depósito una pared secundaria más rígido que mejora el soporte mecánico de la planta. Ambas paredes celulares están compuestas de microfibrillas de celulosa incrustadas en una matriz de polisacáridos de diferentes estructuras (por ejemplo, hemicelulosa y pectina) que varían en los diferentes tejidos etapa de desarrollo y 1,2. La celulosa se sintetiza como cadenas de (1,4) -β-D-glucano que están estrechamente alineadas para formar la microfibrillas de una estructura cristalina. celulosa amorfa se refiere a las regiones en las que las cadenas de glucano están menos ordenadas. La relación entre el cristalino y los dominios amorfos es un parámetro cree que afecta a las propiedades mecánicas de la pared celular, proporcionando resistencia mecánica y característica viscoelástica, respectivamente 3. Varios métodos han sidodesarrollado para detectar y cuantificar las dos formas de disposición de celulosa, entre ellos de difracción de rayos X y polarización cruzada / ángulo mágico de giro de RMN de estado sólido 4. Difracción de rayos X se puede usar para determinar la proporción de cristalino frente a dominios celulosa amorfa en la muestra 5. Un método alternativo utiliza fraccionamiento del contenido de la pared celular en el material ácido insoluble y soluble en ácido, para distinguir entre el cristalino y celulosa amorfa u otros polímeros, respectivamente. En este enfoque, la incorporación de glucosa marcada ([14 C] glucosa) se utiliza para cuantificar el 6,7 celulosa. Estos métodos requieren grandes volúmenes de material de la planta para los análisis de órganos enteros, en el mejor, y por lo tanto, son insuficientemente sensibles a la variación específica de tejido en la estructura de la pared celular. Visualización de microfibrillas de celulosa en una resolución celular se puede lograr en los estudios de imagen en vivo en combinación con colorantes fluorescentes 8,9, que puede identificar cambios enla orientación de las microfibrillas de celulosa. Sin embargo, estos tintes no son utilizados para la cuantificación, que no son específicos de celulosa cristalina y pueden interferir con la estructura normal de la pared celular 8. Polscope es una técnica que se basa en la capacidad de celulosa cristalina para dividir los rayos de luz y retardar parte de la luz 10. retraso de luz es más fuerte para microfibrillas que se encuentran perpendicularmente a la dirección de propagación de la luz. Para microfibrillas con orientación similar, cuanto mayor sea el grado de cristalinidad, mayor será el retardo de la luz 11. Por lo tanto, polscope se utiliza para estudiar tanto los niveles relativos y la orientación de las microfibrillas de celulosa. Roots exhiben crecimiento lineal, durante el cual las células se origina en el nicho de células madre, en la punta de la raíz, someterse a una serie de divisiones celulares, antes de que rápidamente se expanden 12. Las células que comprenden la raíz se expanden en un unidireccional (anisotrópica)forma, según lo dictado por pequeñas moléculas de señalización de hormonas que afectan a las propiedades de la pared celular 13. Respuestas diferenciales a las hormonas, en tiempo y espacio, proporcionan un medio para asegurar el crecimiento equilibrado de órganos 14. Por lo tanto, el análisis de alta resolución de la estructura de la pared celular puede proporcionar información importante necesaria para entender mejor la conexión entre las respuestas de tipo específico de células para el crecimiento de órganos conjunto. Aquí, se presenta la implementación de polscope para estudiar la acumulación específica de tejido de celulosa cristalina en las raíces de Arabidopsis, como se observa en las secciones anatómicas de alta calidad. Este método no cubierto recientemente específica del tipo celular acumulación de celulosa cristalina en respuesta a la perturbación espacial de la actividad hormonal 15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog (MS)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>LOBA CHEMIE&#160;</td>
			<td>6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>861065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Driven 0.22mm PVDF Filter&#160;</td>
			<td>MILLEX-GV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica kit historesin&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>7022 18 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embedding molds</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>film 100&#181; P.P.C.&#160;</td>
			<td>www.Jolybar.com</td>
			<td></td>
			<td>overhead film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knivemaker</td>
			<td>LKB</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratome III</td>
			<td>LKB</td>
			<td>8800</td>
			<td>Ultratome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon immumount&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>9990402</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrio imaging system</td>
			<td>CRI</td>
			<td>Abrio imaging system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrio V2.2 software</td>
			<td>CRI</td>
			<td>Abrio V2.2 software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open access polarized light image analysis software &#160;</td>
			<td>OPS</td>
			<td>OpenPolScope</td>
			<td><a href="http://www.openpolscope.org/">http://www.openpolscope.org/</a></td>
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high resolution quantification of crystalline cellulose accumulation in arabidopsis roots to monitor tissue-specific cell wall modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

Se estudia el impacto de las respuestas específicas del tipo de células a los brasinoesteroides (BRS), el uso de la raíz de Arabidopsis como modelo de órganos 15-17. Cuando el receptor BRI1 BR está dirigido, en el fondo de mutante bri1, a un subconjunto de células de la epidermis llamadas células no pelo (Figura 2A, B), que inhibe la expansión de células unidireccional de células vecinas, y el crecimiento conjunto de la raíz 15. análisis Polscope se realizó para revelar el mecanismo que subyace a esta inhibición. Secciones longitudinales de la raíz obtenida de tipo salvaje y de las líneas que expresan BRI1 en células no pelo solamente, mostraron orientación similar de microfibrillas de celulosa (Figura 2C, D, y como se explica en 9.2.3), lo que permite la comparación de la acumulación relativa de cristalino celulosa en las células meristemáticas y alargándose, utilizando secciones transversales tomadas de estas zonas (Figura 2 e, F). Este análisis mostró una correlation entre la expresión BRI1 en células no pelo y acumulación local de celulosa cristalina. Seguimiento experimentos demostraron que la inhibición leve de celulosa sintasa por bajas concentraciones de isoxabén bajó el nivel de celulosa cristalina en estas células, que a su vez, restaurar parcialmente la inhibición del crecimiento, mediante la promoción de la expansión de células unidireccional y longitud de la raíz 15. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53707/53707fig1.jpg" /> Figura 1:. Polarizada sistema de microscopía de luz El sistema Polscope consiste en un microscopio de luz (A), equipado con una cámara digital CCD (B), analizador y un cristal líquido verde que se encuentra en la parte superior de su fuente de luz (C) (D). Abrio el software se utilizó para la adquisición y análisis de imágenes. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53707/53707fig1large.jpg" target="_blank">por favor, haga clic aquí t</a>o ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53707/53707fig2.jpg" /> Figura 2: Análisis Polscope de la pared celular composición. (A) Sección transversal de la raíz primaria de Arabidopsis que muestra la organización radial de sus tejidos constituyentes. De éstas, las células de la epidermis no pelo (N); células ciliadas (H) y la corteza (C) están marcados. Bar, 10 m. (B) Imágenes de microscopía confocal de las raíces que expresan BRI1-GFP dirigidos a células no pelo. Blanco, la tinción PI que marca las células, la verde, la expresión BRI1-GFP. Bar, 20 m. (C) Secciones longitudinales de las raíces obtenidas de tipo salvaje y de las plantas que expresan BRI1 en células no de pelo. El ángulo de microfibrillas de celulosa (es decir, el ángulo entre el color y el eje largo de células, lo que refleja el eje largo de la raíz) es similar entre las dos líneas. La pared celular de flanqueo de la célula a lo largo de su long eje es cercado; marca de ángulo representa la pared celular de la sombra, que se mide. Bar, 50 m. (D) Cuantificación de ángulo de microfibrillas de celulosa en las paredes celulares de la epidermis. Tenga en cuenta la alta variabilidad de los ángulos presentes en las células meristemáticas (es decir, la zona meristemática, MZ) en comparación con las células en la zona de transición (TZ), como se refleja en el gráfico de caja. El ángulo de microfibrillas de celulosa promedio similar entre el tipo silvestre y plantas que expresan BRI1 en células no permite la comparación del pelo de la acumulación de celulosa cristalina en las células de su zona de desarrollo correspondiente. El ángulo medio en cada muestra se indica mediante una línea roja. Secciones (EF) transversal de la raíz de estas mismas plantas fondos, que se muestran en el modo de retardo de la luz. Escala de colores representa retardo de la luz 0 - 17 Nm. Secciones correspondientes a los meristemas (E) y el alargamiento se muestran zonas (F). Bar, 50 micras. La pared celular epidérmica exterior e interiorpared de las células corticales están rodeados. (G) La cuantificación de los valores de retardo de la calculada a partir de las imágenes polscope. Los valores se expresan como la relación de retraso de entre la pared celular epidérmica exterior y la pared celular cortical interior. Tenga en cuenta que la alta deposición de celulosa cristalina en células no de pelo en las líneas que expresan BRI1 en sólo estas células. Media ± SE; 40 &lt;n &lt;600; (**) P &lt;0,01; (***) P &lt;0,001 en una prueba t de dos colas. Se adoptó la figura y modificado a partir de 15 años. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53707/53707fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

high-resolution-quantification-crystalline-cellulose-accumulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

8.1K vistas.  Technion-Israel Institute of Technology. Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Video: High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Las culturas de las células nerviosas de Aplysia para imágenes de alta resolución de los Conos de Crecimiento

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Investigación

Biología

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

La cuantificación de ADN de doble cadena con el Hitachi F-7000 espectrofotómetro de fluorescencia y Dye PicoGreen

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

A largo plazo, de alta resolución de imagen confocal Time Lapse de<em&gt; Cotiledones Arabidopsis</em&gt; Epidermis durante la germinación

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

El uso de escáneres planos para recopilar de alta resolución de duración transcurrido Imágenes de la gravitrópica Respuesta Arabidopsis Root

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

La tinción histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celda Secundaria Elements Pared

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

Una alta resolución Método de Seguimiento activación fosforilación dependiente de IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

De alto rendimiento CRISPR vector de la construcción y caracterización de las modificaciones del ADN mediante la generación de raíces peludas tomate

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

-Alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...