We thank Dr. M. Rosenberg for her advice and help with anatomical sectioning. We also thank D. Eisler for his technical assistance. This research was supported by grants from FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09), and Israel Science Foundation (ISF; 592/13).

1. Pflanzenwachstum <ol><li> Oberflächen sterilisieren Samen. <ol><li> Sterilisieren Samen (bis zu 30 mg) durch Nass- oder Trockenverfahren. Als Beispiel für die Trockensterilisationsverfahren, 1 ml glazialen HCl 37% in 50 ml Bleichmittel, in einem Becherglas in einem geschlossenen Exsikkator für mindestens 4 Stunden und bis über Nacht. Führen Sie diesen Schritt in einer chemischen Haube. </li></ol></li><li> Verbreiten Sie die sterilen Samen auf Platten mit 0,8% Plant Agar in 0.5x Murashige &amp; Skoog (MS) Medium. Wrap-Platten mit Parafilm oder porösen Band und mit Alufolie abdecken. </li><li> Lagern Sie die Platten bei 4 ° C für 1 - 4 days einheitliche Keimung zu fördern. </li><li> Übertragen , um die Platten in eine Wachstumskammer geeignet für den Anbau Arabidopsis Keimlingen. Legen Sie die Platten vertikal Wurzelwachstum auf dem Agar-Medium zu erhalten und das Eindringen zu verhindern. </li><li> Transfer-Setzlinge zu Fixiermittel 7 Tage nach der Keimung (DAG). </li></ol> 2. Fixation <ol><li> Bereiten Sie 50 ml Richardson Solution von gleichen Volumina von 1% Borax (Puffermittel), 1% Methylenblau und 1% Azure (histologische Farbstoffe) in doppelt destilliertem Wasser kombiniert. Filter durch eine Spritze Driven 0,22 um PVDF-Filtereinheit vor dem Gebrauch. </li><li> Vorbereitung 50 ml Fixierlösung: 1,25% Glutaraldehyd in 0,05 M Natriumcacodylat (Puffermittel). Anmerkung: Diese Materialien sind toxisch und müssen in einer chemischen Haube verarbeitet werden. </li><li> 100 l Richardson Lösung (siehe 2.1) auf die Fixierungslösung (siehe 2.2), um die endgültige Fixierung Lösung zu erhalten. </li><li> Markieren Sie jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit dem entsprechenden Beispielnamen. </li><li> Platz 2 - 3 ml endgültige Fixierung Lösung (siehe 2.3) in die Vertiefungen, so dass die Sämlinge, einmal übertragen, wird vollständig in Flüssigkeit bedeckt sein. </li><li> Sorgfältig übertragen, Pinzette, zu jeder Vertiefung bis zu 10 Sämlinge. Verschließen Sie die Platten mit Parafilm. Lagerung bei 4 ° C, in der Finsternis, für mindestens eine Nacht, und bis zu einer Woche. </li></ol> 3. Dehydration <ol> &lt;li&gt; Entwässern Sämlinge. Übertragen sie zwischen Vertiefungen neue Platten mit 6 Vertiefungen, enthaltend Konzentrationen von Ethanol zu, wie hier aufgeführt: 10% Ethanol für 15 min; 30% Ethanol für 15 min; 50% Ethanol für 15 min; 70% Ethanol für 15 min; 85% Ethanol für 15 min; 95% Ethanol für 15 min; 95% Ethanol bei 4 ° C, über Nacht bei Minimum. Griff Sämlinge indem man sie vorsichtig in ihren Kotyledonen, bevorzugt mit Kunststoff-Pinzette greifen. </li></ol> 4. Infiltrations <ol><li> Bereiten Sie Infiltrationsmedium. Mischen Sie den Inhalt von 1 Beutel des Historesin Kit-Aktivator mit 50 ml Basisharzflüssigkeit Kit in einer kleinen Glasflasche. Rühren mit Magnet für 20 min. Infiltrationsmedium kann bei 4 ° C für ein paar Wochen aufbewahrt werden. </li><li> Markieren Sie jede Vertiefung einer neuen 6-Well-Platte mit dem entsprechenden Beispielnamen und füllen mit 2 - 3 ml Infiltrationsmedium. </li><li> Übertragen Sie die Sämlinge aus der 95% igen Ethanollösung zu dem Infiltrationsmedium mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, die Sämlinge sind fully vom Medium bedeckt. </li><li> Lagerung bei 4 ° C für mindestens 4 Tage, maximales Eindringen in die Pflanzengewebe zu gewährleisten. </li></ol> 5. Satzvorbereitung <ol><li> Legen Sie kleine Etiketten, Bleistift-markiert mit Beispielnamen, innerhalb jeder Vertiefung Einbettschälchen. </li><li> Bereiten Sie Einbettmedium durch Zugabe von 1 ml Härter 15 ml Infiltrationsmedium (siehe 4.1). Versuchen Sie nicht, ein Volumen von weniger als 15 ml herzustellen, Polymerisation Probleme zu vermeiden. </li><li> Füllen Sie die Hälfte jeder Vertiefung in der Form mit 200 ul Einbettungsmedium und Abdeckung mit einem Overhead-Folienstück auf die Form Form geschnitten, sondern zu einer Größe von 1 mm größer auf jeder Seite. Inkubieren bei Raumtemperatur mindestens 2 h für die Polymerisation zu ermöglichen. Nicht 5 Stunden nicht überschreiten. </li><li> Bereiten Sie eine zusätzliche Charge von Einbettmedium (siehe 5.2) und auf Eis halten, Polymerisation zu vermeiden, während der Wurzelspitzen in der Form angeordnet werden. </li><li> Schneiden Sie jede Wurzelspitze unter einem Binokular Skalpell und sehr sorgfältig positionieren it: senkrecht zur Querschnitte oder horizontal für Längsschnitt, bei etwa 2 - 3 mm von der Formperipherie. Füllen Sie die Form vollständig mit Blocking-Lösung und die Abdeckung mit einem Overhead-Folie. Beachten Sie, dass die Blockierungslösung leicht schrumpfen wird, wenn es polymerisiert wird. </li><li> Halten Sie bei Raumtemperatur für 2 Stunden, bei Minimum. </li><li> Um die Blöcke trocknen, legen Sie in einem Kasten mit trockenem Kieselgel und lassen bei Raumtemperatur bei mindestens über Nacht. </li></ol> 6. Sectioning <ol><li> Bereiten Glasmesser aus Glasstäben mit einem Messer ausgestattet. Verwenden Sie die Glasmesser für Gewebe Schnitte. Schneiden Sie den Glasstab in ein Quadrat und dann schneiden Sie das Quadrat diagonal zwei Messer zu produzieren, ein Diamant-Scoring-Tool. </li><li> Die Sperrung der Abschnitte in 2 - 3 &amp; mgr; m Breite Scheiben, mit schneidender Maschine. Die Scheiben auf einem Glasträger, auf destilliertes Wassertröpfchen und den Objektträger auf einem Wärmeblock zu geringe Wärme gesetzt (50 - 60 ° C), bis das Wasser verdunstet. </li></ol><ol><li> Verdünnte Richardson-Lösung (siehe 2.1) auf 0,2% der ursprünglichen Lösung und mit 1 ml davon die Scheiben zu bedecken. Legen Sie auf dem Wärmeblock für 5 Sekunden und dann mit destilliertem Wasser waschen. </li><li> Trocknen Sie die Folie auf einer heißen Platte. Beachten Sie unter einem Binokular und die Rückseite der Folie mit einer Markierung zu markieren, um die Position der Scheiben von Interesse zeigen, ihre spätere Identifizierung unter dem Mikroskop zu erleichtern. </li><li> 100 l Eindeckmediums und Abdeckung mit einem Deckglas. </li></ol> 8. Image Acquisition <ol><li> Legen Sie die bedeckte Schlitten die Wurzelabschnitte unter einem Lichtmikroskop ausgestattet mit PolScope System , das geeignet ist, um Retardierung Informationen und einen Polarisator / Interferenzoptikfilter (Abbildung 1 AD) erhalten. </li><li> Wählen Sie Vergrößerung , die klare Visualisierung der gesamten Probe erlaubt (zB 40X in dieser Studie) und konzentrieren sich die microscope auf einem leeren Feld, das Blockabschnitt aber keine Wurzel Abschnitt enthält. Versuchen Sie, eine saubere Region ohne Makel zu finden. Verwenden Sie diese Region den Hintergrund zu setzen. </li><li> Stellen Sie die Abbildungssystem und Software-Parameter: Stellen Sie Bereich bis 17 nm. Übernehmen &quot;Auto Exposure&quot; und Hintergrundbild aus dem leeren Feld erhalten (siehe 8.2). Einem Hintergrundbild wird pro Experiment verwendet. </li></ol> 9. PolScope Analyse von Cellulose Mikrofibrillen Orientierung <ol><li> Analyse von Längsschnitten. <ol><li> Legen Sie eine Folie mit Längsschnitten unter dem Mikroskop und erhalten eine Retardierung Bild davon. Konzentrieren Sie das Mikroskop auf einem Wurzelabschnitt von Interesse. Geben Sie einen neuen Dateinamen. </li><li> Aufnehmen eines Abrio Bild (Bild mit Verzögerung Informationen) durch die &quot;Live Abrio&quot; Fenster. Sicher sein , einen Abschnitt zu erfassen , die die Zellwand enthält, die von der gefärbten Cellulose identifiziert werden können , die entlang des Umfangs der Zelle ausgeführt wird , wie in 2C gezeigt.</li></ol></li><li> Die Bildanalyse. <ol><li> Doppelklicken Sie auf das entsprechende Bild im Bildstapel. Wählen Sie &quot;Ausrichtung Pseudo Farbe&quot; im &quot;Display Settings&quot;. </li><li> Um die Zellulose microfibril Winkel abschätzen zu können, passen Sie die entsprechenden Schatten der Zellwand, das dem in dem Farbrad. HINWEIS: Das Farbrad in Figur 2C zeigt die langsame Achse des Lichts entlang der Mikrofibrillen liegen , die der Richtung entlang der langen Achse der Mikrofibrillen zeigt. Der Winkel der Cellulose-Mikrofibrillen ist der Winkel zwischen der Farbe und der langen Achse der Zelle angezeigt. Zum Beispiel zeigt die elongating Zelle in der eingesetzten Farbe Zyan, um etwa 90 ° zur langen Achse der Zellen verkippt. </li><li> Um die durchschnittliche microfibril Winkel in der Zellwand zu quantifizieren, verwenden Sie &quot;Hemmung und Azimuth Stamp&quot; aus der Werkzeugleiste der Software. Während das Werkzeug, Punkt auswählen und in dem erhaltenen Bild auf dem Gebiet von Interesse klicken. HINWEIS: Diese will Ergebnis in der Anzeige der Winkel (Azimut) in Grad (Figur 2C). </li><li> In einer alternativen Open-Access-polarisierten Lichtbildanalyse-Software, Mittagessen &quot;Pol-Analyzer&quot; Plugin aus dem Plugin-Menü. Im neu geöffneten Fenster wählen Sie die &quot;Doppelbrechungs&quot; und öffnen Sie dann die Hintergrunddatei und die Bilddatei speichern. </li><li> Im Bildfenster, wählen Sie &quot;Specs.&quot; und stellen Sie die &quot;ROI Pixelgröße&quot; (Einsatz 5 Pixel für diese Studie). Im &quot;Specs.&quot; Wählen Sie im Fenster &quot;zeigen Werte in Ergebnistabelle&quot;. </li><li> Verwenden Sie das Polygon-Werkzeug, um die Region von Interesse im Bildfenster zu markieren. Wählen Sie &quot;Orientierungslinien&quot;, um die Ausrichtung der Cellulose Mikrofibrillen erhalten. ANMERKUNG: Diese in der Anzeige der Winkel führen (Azimut) in Grad. HINWEIS: Der Durchschnittswinkel berechnet, indem einer der beiden Methoden, dann entlang der Rutsche zur Positionierung des Fußabschnitts normalisiert werden sollte. Zur Korrektur für die Abweichung vondie horizontale Positionierung des gesamten Wurzelabschnitt entlang der Rutsche, quantifizieren die durchschnittliche microfibril Winkel der Zellwand der Zelle entlang ihrer langen Achse flankieren (dh, senkrecht zu dem Abschnitt und entlang der Achse des Wurzelwachstums, 2C). Dieser Winkel 180 ° beträgt, wenn der Wurzelabschnitt genau entlang der Rutsche positioniert ist. Für den microfibril Winkel zu berechnen, subtrahieren den Mittelwert gemessen microfibril Winkel der flankierenden Zellwand von 180 °. Fügen Sie den ergab Unterschied zu den durchschnittlichen gemessenen microfibril Winkel der Zellwand, die auf der Folie flach liegt. </li></ol></li></ol> 10. PolScope Analyse der kristallinen Cellulose Accumulation <ol><li> Verwenden Sie die Quer (Kreuz) Abschnitte. Man beachte, dass kristalline Cellulose Akkumulation kann nur zwischen den Zellen verglichen werden, wenn die Cellulose-Mikrofibrillen in einem ähnlichen Winkel ausgerichtet sind (wie in 9 bestimmt). </li><li> Doppelklicken Sie auf das entsprechende Bild im Bildstapel. Wählen Sie &quot;Pseudonym Farbe &quot;im&quot; Display Settings &quot;. </li><li> Zur Messung der Retardierung. Zoom-in auf das Bild. Wählen Sie &quot;Region&quot; und alle Regionen von Interesse zu markieren. Umzug in die &quot;Messungen&quot; klicken und alle Werte &quot;In Zwischenablage kopieren&quot;. <ol><li> Übertragen Sie die Daten in Excel und extrahieren erforderlichen Informationen (mittlere Region Retardierung). Normalisieren der Daten. HINWEIS: Um Unterschiede in der Dicke zwischen den Schichten ausmachen, drücken die Werte relativ zu einer bestimmten Zellwandkante in der Folie. Zu normalisieren, teilen die durchschnittliche Verzögerung an die Zellwand von Interesse durch die durchschnittliche Verzögerung von einer anderen Zellenwand in der gleichen Bild entspricht. So wurde beispielsweise die äußere epidermale Zellwand zu der inneren kortikalen Zellwand in unserer Studie normalisiert. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Messungen für mindestens 3 Abschnitte pro Wurzel, mit einem Minimum von 3 Wurzeln pro Probe. </li></ol>

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+plant+cell+wall.">Growth of the plant cell wall.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 850-861 (2005).</li><li>Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control+and+cell+wall+signaling+in+plants.">Growth control and cell wall signaling in plants.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).</li><li>Mazeau, K., Heux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Dynamics+Simulations+of+Bulk+Native+Crystalline+and+Amorphous+Structures+of+Cellulose.">Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose.</a> J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cellulose+fiber+structure+by+SEM,+XRD,+NMR+and+acid+hydrolysis.">Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis.</a> Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+microtubules+optimize+cell-wall+crystallinity+to+drive+unidirectional+growth+in+Arabidopsis.">Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis.</a> Plant J. 66, 915-928 (2011).</li><li>Peng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractional+separation+and+structural+features+of+hemicelluloses+from+sweet+sorghum+leaves.">Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves.</a> Bioresources. 7, (2012).</li><li>Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+leucine-rich+repeat+receptor+kinases+mediate+signaling,+linking+cell+wall+biosynthesis+and+ACC+synthase+in+Arabidopsis.">Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).</li><li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Cellulose+Reorientation+during+Cell+Wall+Expansion+in+Arabidopsis+Roots.">Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots.</a> Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).</li><li>Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganization+of+cortical+microtubules+stimulates+tangential+expansion+and+reduces+the+uniformity+of+cellulose+microfibril+alignment+among+cells+in+the+root+of+Arabidopsis.">Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).</li><li>Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birefringence+of+native+cellulosic+fibers.+I.+Untreated+cotton+and+ramie.">Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie.</a> J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).</li><li>Abraham, Y., Elbaum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+microfibril+angle+in+secondary+cell+walls+at+subcellular+resolution+by+means+of+polarized+light+microscopy.">Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy.</a> New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).</li><li>Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Arabidopsis+root+development.">Control of Arabidopsis root development.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 563-590 (2012).</li><li>Vanstraelen, M., Benkova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+Interactions+in+the+Regulation+of+Plant+Development.">Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).</li><li>Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control:+brassinosteroid+activity+gets+context.">Growth control: brassinosteroid activity gets context.</a> J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).</li><li>Fridman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+growth+is+modulated+by+differential+hormonal+sensitivity+in+neighboring+cells.">Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells.</a> Genes Dev. 28, 912-920 (2014).</li><li>Vragovic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translatome+analyses+capture+of+opposing+tissue-specific+brassinosteroid+signals+orchestrating+root+meristem+differentiation.">Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).</li><li>Hacham, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brassinosteroid+perception+in+the+epidermis+controls+root+meristem+size.">Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size.</a> Development. 138, 839-848 (2011).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cellulose+synthase-associated+protein+required+for+cellulose+biosynthesis.">Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).</li><li>Fendrych, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+controlled+by+ANAC033/SOMBRERO+determines+root+cap+organ+size+in+Arabidopsis.">Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 24, 931-940 (2014).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest.

Hier stellen wir ein Verfahren zur Bestimmung der Anreicherung von kristalliner Cellulose in den verschiedenen Geweben , die Arabidopsis Wurzeln Komponieren, während anatomische Information erhalten bleibt. Als solches bietet es einen zusätzlichen Schritt in Richtung Wachstum zu verstehen Prozesse in Pflanzen auf zellulärer Auflösung. Dieses Verfahren kann auch für die Untersuchung der zusätzlichen Pflanzenarten und Organe angewendet werden. Eine Reihe von Punkten berücksicht...

Die Pflanzenzellwand ist eine dynamische Struktur. Wachsende Zellen werden durch eine primäre Zellwand umgeben ist, zu erweitern die Organisation, der ermöglicht Zellen. Zellen, die Kaution zu wachsen, um eine steifere Sekundärwand aufhören, die die mechanische Unterstützung der Anlage verbessert. Beide Zellwände bestehen aus Cellulose - Mikrofibrillen zusammengesetzt in einer Matrix aus Polysacchariden verschiedener Strukturen eingebettet (beispielsweise Hemicellulose und Pektin), die über die verschiedenen Entwicklungsstadien variieren und Geweben 1,2. Cellulose wird synthetisiert, wie Ketten (1,4) -β-D-Glucan, die eng ausgerichtet sind, die Mikrofibrillen einer kristallinen Struktur zu bilden. Amorpher Cellulose bezieht sich auf die Regionen, in denen die Glucan-Ketten weniger geordnet. Das Verhältnis zwischen dem kristallinen und dem amorphen Domänen ist ein Parameter gedacht , um die mechanischen Eigenschaften der Zellwand beeinflussen, durch die mechanische Festigkeit und viskoelastische Eigenschaft Bereitstellen bzw. 3. Verschiedene Verfahren wurdenentwickelt , um die zwei Formen von Cellulose Anordnung zu detektieren und zu quantifizieren, darunter Röntgenbeugung und Kreuzpolarisation / Magic Angle NMR Solid-State - Spinnen 4. Röntgenbeugung kann verwendet werden , um den Anteil an kristallinen gegenüber amorpher Cellulose Domänen in der Probe 5 zu bestimmen. Eine alternative Methode verwendet Fraktionierung von Zellwand-Gehalt in säureunlösliche und säurelösliches Material, zwischen dem kristallinen und amorphen Cellulose oder anderen Polymeren zu unterscheiden, respectively. Bei diesem Ansatz Einbau markierter Glukose ([14 C] Glucose) wird verwendet , um die Cellulose 6,7 zu quantifizieren. Diese Verfahren erfordern große Mengen von Pflanzenmaterial für ganze Organ Analysen allenfalls und daher sind unzureichend empfindlich auf gewebespezifische Variation in der Zellwandstruktur. Visualisierung von Zellulosemikrofibrillen auf zellulärer Auflösung kann in Live - Imaging - Studien mit Fluoreszenzfarbstoffen 8,9 kombiniert erreicht werden, dass Änderungen erkennen können,die Orientierung der Cellulosemikrofasern. Jedoch werden diese Farbstoffe nicht zur Quantifizierung verwendet, sie sind nicht spezifisch Cellulose kristallin und kann mit der normalen Struktur der Zellwand 8 stören. PolScope ist ein bildgebendes Verfahren , das auf der Fähigkeit von kristalliner Cellulose beruht Lichtstrahlen zu teilen und einen Teil des Lichts 10 zu verzögern. Licht Retardierung ist am stärksten für Mikrofibrillen, die senkrecht zur Richtung der Lichtausbreitung liegen. Für Mikrofibrillen mit ähnlicher Orientierung, desto höher ist der Grad der Kristallinität ist , desto größer der Lichtverzögerung 11. Daher wird PolScope verwendet zu untersuchen, sowohl die relativen Niveaus und der Orientierung der Cellulosemikrofasern. Wurzeln aufweisen lineares Wachstum, bei der Zellen an der Stammzellnische Ursprung an der Spitze der Wurzel, durchlaufen eine Reihe von Zellteilungen, bevor sie schnell 12 erweitern. Die Zellen, die das Wurzel erweitern in einer unidirektionalen (anisotroper)Art und Weise, wie durch kleine Molekül Signalisierungs Hormone diktiert, die die Eigenschaften der Zellwand 13 auswirken. Differential Reaktionen auf Hormone, in Zeit und Raum, ein Mittel zur Gewährleistung einer ausgewogenen Organwachstum 14. Daher können hochauflösende Analyse der Zellwandstruktur wichtige Informationen, die notwendig sind, um besser die Verbindung zwischen Zelltyp-spezifische Antworten auf ganze Organwachstum zu verstehen. Hier berichten wir über die Umsetzung der PolScope gewebespezifische Anreicherung von kristalliner Cellulose in Arabidopsis Wurzeln zu untersuchen, wie es in hoher Qualität anatomischen Abschnitten beobachtet. Dieses Verfahren kürzlich zelltypspezifischen Anhäufung von kristalliner Cellulose in Reaktion auf räumliche Störung der hormonellen Aktivität 15 freigelegt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog (MS)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>LOBA CHEMIE&#160;</td>
			<td>6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>861065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Driven 0.22mm PVDF Filter&#160;</td>
			<td>MILLEX-GV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica kit historesin&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>7022 18 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embedding molds</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>film 100&#181; P.P.C.&#160;</td>
			<td>www.Jolybar.com</td>
			<td></td>
			<td>overhead film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knivemaker</td>
			<td>LKB</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratome III</td>
			<td>LKB</td>
			<td>8800</td>
			<td>Ultratome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon immumount&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>9990402</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrio imaging system</td>
			<td>CRI</td>
			<td>Abrio imaging system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrio V2.2 software</td>
			<td>CRI</td>
			<td>Abrio V2.2 software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open access polarized light image analysis software &#160;</td>
			<td>OPS</td>
			<td>OpenPolScope</td>
			<td><a href="http://www.openpolscope.org/">http://www.openpolscope.org/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high resolution quantification of crystalline cellulose accumulation in arabidopsis roots to monitor tissue-specific cell wall modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

Wir untersuchen die Auswirkungen der zelltypspezifische Reaktionen auf Brassinosteroiden (BRS), mit der Arabidopsis Wurzel als Modellorgan 15-17. Wenn der BR - Rezeptor BRI1 richtet, in dem Hintergrund BRI1 mutant, zu einer Untergruppe von Epidermiszellen nicht-Haarzellen (2A, B) genannt, es unidirektionalen Zellexpansion benachbarter Zellen hemmt und Vollwurzelwachstum 15. PolScope Analyse wurde durchgeführt, um den Mechanismus z...

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High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

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Research

JoVE Journal

Biology

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

8.1K Aufrufe.  Technion-Israel Institute of Technology. Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Serie: High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Neuronalen Zellkulturen von Aplysia für High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Forschung

Biologie

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Quantifizierung von dsDNA mit dem Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer und PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers mit Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

Mit Flachbett-Scanner mit hoher Auflösung zeitversetzt Bilder von der Arabidopsis-Wurzel gravitropen Antwort sammeln

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Histochemische Färbung von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundärzellwand-Elemente

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in

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