In vivo טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים לחשיפת דפוסי פעילות המושרים על ידי גירוי מוחי עמוק בחולדות

אנו מתארים שיטה ניסיונית פרה-קלינית להערכת נוירומודולציה מטבולית המושרה על-ידי גירוי מוחי עמוק חריף באמצעות in vivo FDG-PET. כתב יד זה כולל את כל השלבים הניסיוניים, החל מניתוח סטריאוטקסי ועד ליישום הטיפול בגירוי ורכישה, עיבוד וניתוח של תמונות PET.

גירוי מוחי עמוק (DBS) היא טכניקה נוירוכירורגית פולשנית המבוססת על יישום פולסים חשמליים למבנים מוחיים המעורבים בפתופיזיולוגיה של המטופל. למרות ההיסטוריה הארוכה של DBS, מנגנון הפעולה והפרוטוקולים המתאימים שלו עדיין אינם ברורים, ומדגישים את הצורך במחקר שמטרתו לפתור את החידות הללו. במובן זה, הערכת ההשפעות in vivo של DBS באמצעות טכניקות הדמיה תפקודית מייצגת אסטרטגיה רבת עוצמה כדי לקבוע את ההשפעה של גירוי על הדינמיקה במוח. כאן מתואר פרוטוקול ניסיוני למודלים פרה-קליניים (חולדות Wistar), בשילוב עם מחקר אורך [¹⁸F]-פלואורודוקסיקלוקוז טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (FDG-PET), כדי להעריך את ההשלכות החריפות של DBS על חילוף החומרים במוח. ראשית, בעלי חיים עברו ניתוח סטריאוטקטי להשתלה דו-צדדית של אלקטרודות בקליפת המוח הקדם-מצחית. סריקת טומוגרפיה ממוחשבת (CT) לאחר ניתוח של כל חיה נרכשה כדי לאמת את מיקום האלקטרודות. לאחר שבוע של התאוששות, נרכש FDG-PET סטטי ראשון של כל חיה שנותחה ללא גירוי (D1), ויומיים לאחר מכן (D2), נרכש FDG-PET שני בזמן שבעלי החיים היו מגורה. לשם כך, האלקטרודות חוברו לממריץ מבודד לאחר מתן FDG לבעלי החיים. לפיכך, בעלי חיים היו מגורה במהלך תקופת ספיגת FDG (45 דקות), רישום ההשפעות החריפות של DBS על חילוף החומרים במוח. בהתחשב באופי החקרני של מחקר זה, תמונות FDG-PET נותחו על ידי גישה חכמה של ווקסל המבוססת על מבחן T זוגי בין מחקרי D1 ו- D2. באופן כללי, השילוב של DBS ומחקרי הדמיה מאפשר לתאר את ההשלכות של נוירומודולציה על רשתות עצביות, ובסופו של דבר עוזר לפענח את הבלבול סביב DBS.

המונח גירוי עצבי מקיף מספר טכניקות שונות שמטרתן לעורר את מערכת העצבים עם מטרה טיפולית¹. ביניהם, גירוי מוחי עמוק (DBS) בולט כאחת האסטרטגיות הנפוצות ביותר לגירוי עצבי בקליניקה. DBS מורכב מגירוי של גרעיני מוח עמוקים עם פולסים חשמליים המועברים על ידי נוירוסטימולטור, המושתלים ישירות לגוף המטופל, באמצעות אלקטרודות הממוקמות לתוך המטרה המוחית כדי להיות מווסת על ידי ניתוח סטריאוטקטי. מספר המאמרים המעריכים את ההיתכנות של יישום DBS בהפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות שונות גדל בהתמדה², אם כי רק חלקם אושרו על ידי איגוד המזון והתרופות (FDA) (כלומר, רעד חיוני, מחלת פרקינסון, דיסטוניה, הפרעה אובססיבית-קומפולסיבית ואפילפסיה עקשן מבחינה רפואית)³ . יתר על כן, מספר רב של מטרות מוחיות ופרוטוקולי גירוי נמצאים תחת מחקר לטיפול DBS בהרבה יותר פתולוגיות ממה שאושר רשמית, אך אף אחת מהן אינה נחשבת סופית. חוסר עקביות זה במחקר DBS ובהליכים קליניים עשוי לנבוע בחלקו מחוסר הבנה מלאה של מנגנון הפעולה שלו⁴. לכן, נעשים מאמצים אדירים לפענח את השפעות ה-in vivo של DBS על הדינמיקה של המוח, שכן כל התקדמות, קטנה ככל שתהיה, תסייע לשכלל את פרוטוקולי ה-DBS להצלחה טיפולית גדולה יותר.

בהקשר זה, טכניקות הדמיה מולקולרית פותחות חלון ישיר להתבוננות בהשפעות נוירומודולטוריות in vivo של DBS. גישות אלה מספקות הזדמנות לא רק לקבוע את ההשפעה של DBS בזמן שהוא מיושם, אלא גם לפענח את אופי ההשלכות שלו, למנוע תופעות לוואי לא רצויות ושיפור קליני, ואף להתאים פרמטרים של גירוי לצרכי המטופל⁵. בין שיטות אלה, טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) באמצעות 2-deoxy-2-[¹⁸F]fluoro-D-glucose (FDG) מעניינת במיוחד מכיוון שהיא מספקת מידע ספציפי ובזמן אמת על מצב ההפעלה של אזורי מוח שונים⁶. באופן ספציפי, הדמיית FDG-PET מספקת הערכה עקיפה של הפעלה עצבית המבוססת על העיקרון הפיזיולוגי של צימוד מטבולי בין נוירונים לתאי גליה⁶. במובן זה, מספר מחקרים קליניים דיווחו על דפוסי פעילות מוחית מווסתת DBS באמצעות FDG-PET (ראו^{סקירה 3} ). עם זאת, למחקרים קליניים יש בקלות מספר חסרונות כאשר הם מתמקדים בחולים, כגון הטרוגניות או קשיי גיוס, המגבילים מאוד את פוטנציאל המחקר שלהם⁶. הקשר זה מוביל חוקרים להשתמש במודלים של בעלי חיים של מצבים אנושיים כדי להעריך גישות ביו-רפואיות לפני התרגום הקליני שלהן, או, אם כבר מיושם בפועל קליני, כדי להסביר את המקור הפיזיולוגי של יתרונות טיפוליים או תופעות לוואי. לפיכך, למרות המרחקים הגדולים בין הפתולוגיה האנושית לבין המצב המעוצב בחיות מעבדה, גישות פרה-קליניות אלה חיוניות למעבר בטוח ויעיל לפרקטיקה קלינית.

כתב יד זה מתאר פרוטוקול DBS ניסיוני למודלים של מורין, בשילוב עם מחקר אורך FDG-PET, על מנת להעריך את ההשלכות החריפות של DBS על חילוף החומרים במוח. התוצאות המתקבלות עם פרוטוקול זה עשויות לעזור לפענח את דפוסי המודולציה המורכבים המושרים על פעילות המוח על ידי DBS. לכן, ניתנת אסטרטגיה ניסיונית מתאימה לבחינת השלכות הגירוי in vivo , המאפשרת לקלינאים לצפות השפעות טיפוליות בנסיבות ספציפיות ולאחר מכן להתאים פרמטרים של גירוי לצרכי המטופל.

הליכים ניסיוניים בבעלי חיים נערכו על פי הנחיית מועצת הקהילות האירופית 2010/63/EU, ואושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של בית החולים גרגוריו מראניון. סיכום גרפי של פרוטוקול הניסוי מוצג באיור 1A.

1. לוקליזציה של מטרות המוח על ידי הדמיה מוחית in vivo

1. הכנת בעלי חיים
   הערה: חולדות Wistar זכרים של ~ 300 גרם שימשו.
   1. הכניסו את החיה לקופסת אינדוקציה להרדמה ואטמו את החלק העליון.
   2. הפעל את מאדה sevoflurane (5% עבור אינדוקציה ב 100% O₂). כאשר החולדה מורדמת, העבירו את זרימת הגז לאף. אשר את מצב ההרדמה על ידי צביטה של כף החולדה.
   3. הנח את החיה על מיטת ה- CT, תוך שמירה על הרדמה sevoflurane (3% לתחזוקה ב 100% O₂).
2. הדמיית CT
   הערה: בחירת האמפר, המתח, מספר ההקרנות, מספר היריות ורזולוציית הווקסל תלויה בסורק ה-CT. כאן^{נעשה שימוש} בפרמטרים הבאים: 340 mA, 40 KV, 360 הקרנות, 8 יריות ורזולוציה של 200 מיקרומטר ^7,8,9.
   1. הדקו את מסכת הפנים או את חרוט האף לחולדה.
   2. אבטחו את גוף החולדה בראש, בכתפיים, בירכיים ובזנב בעזרת סרט משי כדי לספק מספיק איפוק ללא נזק.
   3. עקבו אחר החולדה באופן רציף.
   4. אתר את הראש במרכז שדה הראייה של סורק ה- CT.
   5. המשך לרכוש את תמונת ה- CT באמצעות פרמטרי רכישה בהתאם למפרטי הסורק.
   6. לאחר 10 דקות, כאשר סריקת ה-in vivo CT הושלמה, עצרו את זרימת ה-sevoflurane והכניסו את החולדה לסורק ה-MRI.
3. הדמיית MR
   הערה: מפרטי רכישת הסריקה משתנים בין סורקים, כולל מערכות תוכנה שונות וחשוב מכך, שאלת המחקר הספציפית. כאן נעשה שימוש בסורק 7 טסלה. נעשה שימוש ברצף ספין-הד משוקלל T2 7,8,9 עם TE = 33 ms, TR = 3732 ms^, ועובי פרוסה של ^0.8 מ"מ (34 פרוסות), גודל מטריצה של 256 x 256 פיקסלים עם FOV של 3.5 x 3.5 ס"מ² שימש.
   1. הניחו את שכיבה של החיה על מיטת ה-MRI, תוך שמירה על הרדמה של sevoflurane (3% לתחזוקה ב-100% O₂).
   2. הצמידו את הראש למסגרת סטריאוטקטית הממוקמת על מיטת הסורק כדי למנוע תנועות ראש במהלך רכישת MRI. כמו כן, לאבטח את שאר הגוף חולדה עם סרט משי.
   3. מקם את הראש במרכז שדה הראייה של סורק ה- MRI.
   4. לאחר שהעמדה נכונה, המשך לרכוש את תמונת ה- MRI.
   5. בסיום סריקת ה-MRI in vivo, עצרו את זרימת ה-sevoflurane והכניסו את החולדה לכלוב שלה.
   6. אתרו מנורת חימום ליד הכלוב מכיוון שחולדות בדרך כלל מורידות את טמפרטורת הגוף שלהן במהלך הסריקה.
   7. עקוב אחר החולדה עד להתאוששות מההרדמה.
4. חישוב לוקליזציה משותפת של אטלס וקואורדינטות יעד
   1. לאחר שתמונות CT ו-MRI נרכשות ומשוחזרות בהתאם להמלצות הסורק, רשום במשותף את תמונות ה-CT וה-MRI.
   2. השתמש בתוכנת עיבוד הדמיה כדי לנרמל מרחבית CT ו- MRI באמצעות אלגוריתם רישום קשיח אוטומטי המבוסס על מידע הדדי¹⁰.
   3. מקם את קו Bregma בתמונה הרשומה במשותף, ומדוד את המרחק בציר הקדמי/אחורי (AP: +3.5 מ"מ), קו האמצע/לרוחב (ML: +0.6 מ"מ) והדורסו-בנטרלי (DV: -3.4 מ"מ) מברגמה למטרה (כלומר, קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית, mPFC), על פי אטלס המוח של חולדות פקסינוס ווטסון¹¹.
      הערה: הקואורדינטות מברגמה ליעד עשויות להיות שונות בין חולדות כאשר המשקל, הגודל, המין והגזע שונים.

2. ניתוח סטריאוטקסי

התראה: יש להשתמש ב-Autoclave בכל החומרים הכירורגיים, השתלים והיחידות הסטריאוטקסיות לפני השימוש, ולחטא את אזור הניתוח כדי למנוע זיהומים וסיבוכים שעלולים להשפיע על רווחת בעלי החיים. השתמש בכפפות כירורגיות סטריליות וכסה את החיה בווילונות דביקים כדי למנוע זיהום.

1. הכנת בעלי חיים והרדמה
   1. בעלי חיים קיבלו 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין באופן תוך-צפקי יום לפני הניתוח. הכניסו את החיה לתא תיבת הרדמה ואטמו את החלק העליון.
   2. הפעל את מאדה sevoflurane (5% עבור אינדוקציה ב 100% O₂).
   3. כאשר החולדה משכבת, כבו את מכשיר האידוי sevoflurane והוציאו את החולדה מתא הקופסה.
   4. באופן תוך-צפק יש לתת תערובת של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) כדי להרדים את החיה.
   5. המתן עד שהחיה מורדמת לחלוטין. בדוק את רמת ההרדמה על ידי צביטה של האזור הבין-דיגיטלי.
   6. לגלח את האזור שבין האוזניים לעיניים.
2. מיקום במסגרת הסטריאוטקטית וקרניוטומיה
   1. הניחו את בעל החיים בתנוחה נוטה על המסגרת הסטריאוטקטית והשתמשו במתאם החזקת הראש לחולדות כדי לשמור על בעל החיים בתנוחה הנכונה במהלך הניתוח.
   2. הקפידו על חוסר תנועה של הראש על ידי שימוש במוטות האוזניים של החולדה. היזהר עם החדרת מוטות האוזניים, שכן החדרה עמוקה מדי עלולה להזיק לעור התוף.
   3. החל ג'ל סיכה עיניים על העיניים כדי למנוע יובש במהלך הניתוח, ולכסות אותם עם גזה סטרילית.
   4. כסו את בעל החיים באמצעות וילונות דביקים כדי למנוע זיהום.
   5. החל פתרון יודופובידון על האזור המגולח ונקה אותו עם גזה סטרילית.
   6. יש למרוח mepivacaine בג'ל על האזור המגולח כדי להרדים את האזור המקומי.
   7. עושים חתך אורכי בעור מעל הגולגולת בין האוזניים, ומשתרעים 1.5-2 ס"מ מלמבדה לברגמה (כלומר, מהקודקוד הגולגולתי לכיוון העיניים).
   8. חשוף את הגולגולת בעזרת 2 או 3 מלחציים. הסר את periosteum עם צמר גפן ולנקות את הדם עם תמיסת מלח כדי לחשוף Bregma ואת התפרים sagittal. הסר את תמיסת מלח עודף עם גזה.
   9. לגרד את פני הגולגולת עם אזמל כדי לשפר את הידבקות מלט שיניים. נקו את האזור עם צמר גפן ספוג במי חמצן.
3. מיקום אלקטרודות וקיבוע לגולגולת
   1. יישרו את האלקטרודות בפינצטה פלסטית כדי להבטיח מיקום נכון במהלך הניתוח.
      הערה: אלקטרודות פלטינום-אירידיום דו-קוטביות קונצנטריות עם הקרקע משמשות בפרוטוקול זה.
   2. אתר אלקטרודה אחת על מחזיק הזרוע הימנית של המסגרת הסטריאוטקטית.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את המחזיק לאלקטרודה כדי לתקן אותה טוב יותר (ראו איור 1B). ודא שהאלקטרודה מקבילה לציר המחזיק.
   3. הזיזו את הזרוע הימנית המחזיקה את האלקטרודה דרך המסגרת הסטריאוטקסית והניחו את קצה האלקטרודה בדיוק מעל ברגמה. נסו להביא את קצה האלקטרודה קרוב ככל האפשר לגולגולת אך מבלי לגעת בה כדי למנוע עיוות של האלקטרודה, ושימו לב לקואורדינטות המתקבלות עבור ברגמה המסופקות על ידי המסגרת הסטריאוטקסית. לעשות סימן על הגולגולת המציין את המיקום הראשוני של האלקטרודה עם עט כירורגי.
   4. העבר את המחזיק לקואורדינטות AP ו- ML המתקבלות בשלב 1.4.3 ועשה סימן על הגולגולת עם עט כירורגי המציין את מיקום מטרת האלקטרודה.
   5. הסר את הזרוע הימנית של המסגרת הסטריאוטקטית המחזיקה את האלקטרודה. היזהר לא לגעת בשום דבר עם האלקטרודה.
   6. השתמש במקדחה חשמלית קטנה כדי ליצור חור דרך הגולגולת (בערך 1-1.5 מ"מ קוטר) במצב המטרה עד שהדורה נראית לעין. עצור כל דימום באמצעות צמר גפן.
   7. קדחו 4 חורים לאורך הגולגולת לאיתור 4 ברגים (רצוי ברגים מנירוסטה באורך 2-3 מ"מ) להגדלת שטח הפנים של המלט הדנטלי ולאיתור הקרקע. חבר את 4 הברגים.
   8. אתר את הזרוע הימנית של המסגרת הסטריאוטקטית עם האלקטרודה הימנית. הזז את הזרוע למצב המחושב, אשר אמור לעלות בקנה אחד עם החור. לאחר מכן, הנמיכו את האלקטרודה עד שהיא נוגעת בדורה מאטר. עמדה זו תשמש כרמה 0 בכיוון DV.
   9. הכנס את קצה האלקטרודה לכיוון DV, באמצעות מיקום DV בשלב 1.4.3. נקו את הדם ואת הנוזל השדרתי סביב אזור האלקטרודה עם צמר גפן.
   10. חברו את הקרקע לאחד הברגים הקרובים ביותר לאלקטרודה.
   11. יש למרוח מלט דנטלי סביב האלקטרודה והברגים תוך הקפדה על עיצוב המלט הדנטלי תוך הימנעות מקצוות חדים, שעלולים לפגוע בבעל החיים. מלט דנטלי מוחל בשכבה למניעת התחממות יתר/פגיעה תרמית ברקמה/גולגולת. שכבות עבות דורשות יותר זמן לריפוי לפני הוספת שכבות נוספות. ודא שהמלט הדנטלי מוקשה לחלוטין לפני הסרת האלקטרודה מהמחזיק.
       אזהרה: הכנת המלט הדנטלי מייצרת פליטת אדים רעילים מהתערובת, המסתיימת בהתמצקות המלט. לכן, יש לעטות מסכת הגנה יעילה נגד גזים כימיים מנקודה זו ועד סוף הניתוח.
   12. חזור על אותו הליך משלבים 2.3.2-2.3.11 עבור ההמיספרה השנייה של המוח.
   13. יש למרוח יותר מלט דנטלי ליצירת מכסה מבלי לכסות את האלקטרודה. חכו עד שהוא יתקשה.
   14. השתמש בתפר משי טבעי קלוע שאינו נספג 1/0, עם מחט משולשת, כדי לתפור מלפנים ומאחורי הכובע. במידת הצורך, הסר את התפרים שאינם נספגים בזמן מסוים בהתאם לאזור הגוף שבו הם נמצאים. השתמש בפתרון יודופובידון לחיטוי אזור הניתוח.
   15. הסר את החולדה מהמסגרת הסטריאוטקטית.
4. הדמיית CT לאישור מיקום אלקטרודות
   1. בצע את שלבים 1.2.4-1.2.5 וראה איור 1C.
   2. לאחר השלמת סריקת ה-in vivo CT, הכניסו את החולדה לכלוב שלה.
   3. בצע את השלבים 1.3.6. ו-1.3.7.
5. טיפול לאחר הניתוח
   1. מתן אנטיביוטיקה (ceftriaxone, 100 מ"ג / ק"ג, תת עורית) במשך 5 ימים ומשכך כאבים (buprenorphine, 0.1 מ"ג / ק"ג, intraperitoneal) במשך 3 ימים כטיפול לאחר הניתוח. משטר אנטיביוטי זה עשוי להיות מוארך במשך 5 ימים אם כל סימני זיהום (אדמומיות, נפיחות, exudate) הם נצפו סביב הכובע.
   2. בצע בדיקה חזותית של כל בעל חיים מדי יום, מחפש סימנים של כאב או מצוקה, ולנקות את הכובע עם פתרון יודופובידון.
   3. מתן טיפול נמרץ עד שבוע לאחר הניתוח.

3. רכישת הדמיית PET/CT

הערה: כל חיה עוברת שני מחקרי PET/CT (כלומר, בהיעדר ובמהלך מתן DBS) בהרדמה בשאיפה כדי להעריך את ההשפעות החריפות הנגרמות על ידי הגירוי החשמלי. שתי הבדיקות עוקבות אחר אותו פרוטוקול רכישת הדמיה, ומבוצעות שבוע לאחר הניתוח (D1, ללא גירוי) ויומיים לאחר מכן (D2, במהלך DBS).

1. הכנת בעלי חיים והרדמה
   1. הרץ את החולדה במשך 8-12 שעות לפני כל סריקת PET כדי לאפשר ספיגה גבוהה יותר של FDG במוח, ולשפר את יחס האות לרעש¹².
   2. הכניסו את החיה לקופסת אינדוקציה להרדמה ואטמו את החלק העליון.
   3. הפעל את מאדה sevoflurane (5% עבור אינדוקציה ב 100% O₂).
   4. כאשר החולדה מורדמת, החליפו את שטף הגז לאף.
2. הזרקת FDG ותקופת ספיגה
   אזהרה: FDG הוא מכשיר רדיו-טראקר, לכן שקול אמצעי הגנה מפני רדיו כדי להימנע מחשיפה לרדיואקטיביות. אשר כי למוסד יש את כל ההרשאה לעבוד עם תרכובות רדיואקטיביות.
   1. יש לשמור את בקבוקון FDG בתוך ארון מרופד בעופרת עד לשימוש כדי למנוע חשיפה לא רצויה לרדיואקטיביות.
   2. מלא מזרק מד קטן (~27G) ב~37 MBq של תמיסת FDG בנפח הפחות אפשרי, כפי שנמדד במפעיל מטר.
   3. הניחו כרית חימום מתחת לזנב החיה או השתמשו באור אינפרא-אדום כדי להרחיב את ורידי הזנב.
   4. ברגע שהוורידים הצדדיים ניכרים בשיא הזנב, נקו את האזור באלכוהול סניטרי (96%).
   5. להזריק את תמיסת FDG דרך אחד הוורידים זנב לרוחב, מתקרב לווריד עם מזרק מקביל למסלול שלה עם השיפוע של המחט פונה כלפי מעלה.
   6. כבו את ההרדמה והחזירו את החיה לכלוב שלה כדי להתאושש לחלוטין תחת מנורת חימום.
   7. אפשר 45 דקות של קליטת radiotracer לפני תחילת הפעלת רכישת התמונה. במהלך תקופה זו, לשמור על החיה ערה בתוך תא מוגן עופרת.
   8. במקרה של מחקר D2, ספק DBS כפי שמוסבר להלן בסעיף 4 (ניהול גירוי חשמלי) במהלך תקופת ספיגת FDG.
3. רכישה ושחזור הדמיה של PET
   הערה: מפרטי רכישת תמונות PET תלויים בסורק ובזמן הסריקה. עבור פרוטוקול זה, תמונת PET סטטית נרכשה למשך 45 דקות עם סורק PET/CT של בעלי חיים קטנים, באמצעות חלון אנרגיה של 400-700 keV ^7,8,9. סקור את המפרטים של ציוד PET/CT לפני תכנון פרוטוקול הרכישה.
   1. 45 דקות לאחר הזרקת FDG, הכניסו את החיה לתיבת אינדוקציה להרדמה ואטמו את החלק העליון.
   2. הפעל את מאדה sevoflurane (5% עבור אינדוקציה ב 100% O₂).
   3. מעבירים את בעל החיים למיטת PET/CT ומניחים אותו במצב שכיבה, תוך הצמדת האף לחרוט האף בהרדמה ושמירה על הרדמה סבופלורנית (3% לתחזוקה ב-100% O₂). אשר את מצב ההרדמה על ידי צביטה של כף החולדה.
   4. חזור על שלבים 1.2.2 ו- 1.2.3.
   5. מקם את הראש במרכז שדה הראייה של סורק PET.
   6. רכוש את תמונת ה- PET הסטטית באמצעות פרמטרי רכישה בהתאם למפרטי הסורק.
   7. המשך לשחזר את התמונה באמצעות 2D-OSEM (אלגוריתם מקסום ציפיות תת-קבוצה מסודרת) והחל תיקוני דעיכה וזמן מת ^7,8,9.
   8. לאחר השלמת סריקת ה- in vivo PET, שמור על זרימת ה- sevoflurane לחולדה על מנת להמשיך לאחר מכן לרכישת ה- CT מבלי לעקור את מיקום הראש של החיה על מיטת הסורק.
4. רכישת CT
   1. מבלי לשנות את עמדת בעל החיים ביחס לרכישה הקודמת של PET, המשך לרכוש את תמונת ה- CT.
   2. חזור על שלבים 1.2.3-1.2.5.
   3. לאחר השלמת סריקת ה-in vivo CT, עצרו את זרימת ה-sevoflurane והכניסו את החולדה לכלוב המתאים לה לצורך התאוששות.
   4. בצע את השלבים 1.3.6. ו-1.3.7.
   5. החזיקו את החיה בתא מוגן עופרת עד לריקבון רדיואקטיבי מוחלט.

4. ניהול גירוי חשמלי

הערה: גירוי חשמלי מועבר במהלך תקופת ספיגת FDG בפגישת ההדמיה D2. עבור פרוטוקול זה, הגירוי הועבר עם מגרה מבודד, עם גירוי חשמלי בתדר גבוה (130 הרץ) במצב זרם קבוע, 150 μA, ורוחב פולס של 100 μs 7,13,14.

1. תצורת מגרה DBS
   1. הכינו את הגירוי המבודד ואת החוטים הנדרשים בחדר רחב ושקט, עם מספיק מקום לכלובים של בעלי החיים והשפעה מינימלית של גירויים שעלולים להטריד.
   2. חבר את חוטי הגירוי לסיבובים כדי לאפשר לבעלי חיים לנוע בחופשיות בתוך הכלובים שלהם ולמגרה.
   3. הגדר את פרמטרי הגירוי בהתאם לצרכי המחקר.
   4. השתמש באוסצילוסקופ כדי לבדוק את המצב הנוכחי, התדר ורוחב הפולס. אשרו את צורת הגל הדו-פאזית עם צורת פולס מלבנית (איור 1D).
2. משלוח DBS
   1. לאחר סשן ההדמיה של D1 ועד לרכישת D2, יש להכפיף את בעלי החיים לפרוטוקול הרגלה יומי (45 דקות ביום) כדי להרגיל אותם למערכת הגירוי ולטיפול המפעיל, תוך הימנעות מתגובות לחץ לא רצויות ב-D2. חבר את מערכת הגירוי לכל חיה, אך מבלי להפעיל את הגירוי.
   2. לאחר הגדרת הממריץ, והחיה הוזרקה עם FDG, חבר את הסיבוב לאלקטרודות והפעל את הממריץ.
   3. לאחר 45 דקות, כבה את הממריץ, נתק את החיה מהסיבוב והעבר אותה במהירות לתא אינדוקציה להרדמה כדי להתחיל בשלב 3.3.

איור 1: תכנון ניסוי . (א) סיכום שלבי הניסוי הבאים בפרוטוקול זה. (B) תמונות מייצגות של התאמת מחזיק לקיבוע טוב יותר של האלקטרודה, עם (משמאל) ובלי (מימין) אלקטרודה. (C) תמונה מתמזגת של MRI עם CT של חיה המופעלת, המראה את מיקום האלקטרודה הנכון בקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית (mPFC). (D) צילום מסך של מסך האוסצילוסקופ המציג את צורת הגל של הגירוי הדו-פאזי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

5. עיבוד וניתוח תמונה PET

הערה: בצע את אותו עיבוד תמונה בתמונות מ- D1 ו- D2 כדי לקבל נתונים דומים לניתוח סטטיסטי נוסף של ווקסל.

1. רישום מרחבי של תמונות PET
   1. השתמש בתוכנת עיבוד הדמיה מיוחדת. כל זרימת העבודה של הרישום מתוארת באיור 2.
   2. מרכוז וחתוך כל תמונת PET ו- CT לשדה הראייה. רשום את תמונת ה- PET ל- CT שלה באמצעות אלגוריתם רישום קשיח אוטומטי המבוסס על מידע הדדי¹⁵.
      הערה: שיטות רישום נוקשות מתאימות רק אם אין הבדלים משמעותיים במשקל הגוף או בגודל בין בעלי החיים. אחרת, שקול להשתמש בשיטות אלסטיות.
   3. רשום כל תמונת CT ל- CT ייחוס הרשום מרחבית לאטלס המוח של חולדות פקסינוס ווטסון¹¹ כמו בשלב 5.1.2. שמור את פרמטרי השינוי שהתקבלו.
   4. החל את פרמטרי ההמרה שהתקבלו בשלב 5.1.3. לכל תמונת PET רשומה המקבלת את תמונת ה- PET הרשומה לתמונת ה- CT המייחסת.
   5. שמור את כל תמונות ה- PET הסופיות בפורמט Nifti.
2. נורמליזציה והחלקה בעוצמה של תמונות PET
   הערה: נורמליזציה והחלקה של עוצמה מבוצעות עם סקריפטים פנימיים שונים המבוססים על משאבים הזמינים לציבור.
   1. החלק את תמונות ה- PET עם גרעין גאוס איזוטרופי של 2 מ"מ בחצי רוחב מלא (FWHM) כדי לתקן שגיאות רישום אפשריות.
      הערה: גודל מסנן ההחלקה יהיה תלוי ברזולוציה של רכישת PET, אך מומלץ להשתמש במסנן של פי 2-3 מגודל הווקסל של FWHM.
   2. נרמל את עוצמת ערכי הווקסל של PET באמצעות שיטת נורמליזציה מתאימה של אשכול ייחוס¹⁶.
   3. פלח מסכת מוח מ- MRI ייחוס הרשום בתמונת ה- CT הייחוס.
   4. החל את מסכת המוח על כל תמונת PET כדי להוציא ווקסלים מחוץ למוח מהניתוח מבחינת ווקסל.
3. ניתוח חכם של ווקסל
   הערה: הניתוח הסטטיסטי, המורכב מניתוח חכם של נתוני התמונה של PET, בוצע באמצעות תוכנת ניתוח הדמיה מיוחדת¹⁷.
   1. השווה בין תמונות D1 ו- D2 PET באמצעות מבחן T זוגי, תוך הגדרת ערכי סף משמעותיים סטטיסטית נאותים.
   2. שקול כתוצאות סופיות של הניתוח רק את האשכולות הגדולים מ-50 ווקסלים סמוכים כדי להפחית שגיאות מסוג I.
   3. מייצגים את התוצאות במפות T על גבי MRI T2, ומראים את השינויים בחילוף החומרים של גלוקוז במוח המושרים על-ידי DBS (צבעים קרים להפחתת FDG וצבעים חמים לתוספת FDG).

איור 2: זרימת עבודה של רישום הדמיה של מיקרו PET/CT. שלבים מפורטים של עיבוד נורמליזציה מרחבית של תמונת PET לניתוח נוסף מבחינת ווקסל עם תוכנת מיפוי פרמטרי סטטיסטי (SPM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

בעלי החיים הוקרבו באמצעות CO₂ בסוף המחקר או כאשר רווחת החיה נפגעה. דוגמה למחקר PET/CT מלא מבעל חיים שהופעל מוצגת באיור 3. לפיכך, ניתן לראות בבירור את האלקטרודה המוחדרת למוח החולדה בתמונת ה-CT המוצגת באיור 3A. שיטת הדמיה זו מספקת מידע אנטומי טוב ומקלה על הרישום של תמונות FDG-PET, בהתחשב בכך ששיטות פונקציונליות נוטות להיות מטושטשות יותר מתמונות מבניות (איורים 3A,B). בנוסף, תמונה ממוזגת של תמונות FDG-PET ו-CT של אותה חיה מוצגת באיור 3C.

איור 3: הדמיית מיקרו-PET/CT של מוח חולדה עם אלקטרודות DBS שהושתלו ב-mPFC . (A) מקטע סגיטלי של תמונת CT. (B) מקטע סגיטלי של תמונת FDG-PET של אותה חיה כמו ב-A. (C) תמונת PET/CT שהתמזגה נוצרה כתוצאה מכיסוי תמונות A ו-B הרשומות מרחבית באותו מרחב סטריאוטקסי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הניתוח מבחינת ווקסל שבוצע עם תוכנת SPM12 והובא כאן כדוגמה כלל בדיקת T זוגית בין D1 (היעדר DBS) ו- D2 (DBS במהלך ספיגת FDG), השייכים למעשה למחקר שפורסם בעבר⁸. לכן, איור 4 מראה את ההבדלים המטבוליים במוח בין שני מפגשי ה-PET כאשר מפות T מונחות על גבי פרוסות מוח בעובי 1 מ"מ רציף מ-MRI הרשום בתמונת ה-CT הייחוסית (CTref). הבדלים אלה כללו עליות וירידות בספיגת FDG שנראו כצבעים חמים וקרים, בהתאמה. כמו כן, סיכום מפורט של התוצאות הסטטיסטיות המתקבלות מהניתוח מוצג בלוח 1. כאן אנו מציינים את אזור המוח המאופנן, את ההמיספרה המוחית שבה נצפתה המודולציה, את הסטטיסטיקה T, את גודל האשכול במספר הווקסלים (k), את כיוון המודולציה (כלומר, שינויים היפרמטבוליים או היפומטבוליים), ואת ערכי ה-p המתקבלים ברמות השיא והאשכולות. סוג זה של טבלה משמש כתיאור מפורט של השינויים המווסתים שנצפו באיור שכבת הפרוסה.

איור 4: תוצאות בדיקת T משויכות. מפות T הנובעות מניתוח חכם של ווקסל על גבי MRI T2 הרשום באותו CTref, המראה את השינויים המטבוליים המושרים על ידי פרוטוקול DBS חריף (D2 לעומת D1). סרגלי הצבע בתחתית התמונה מייצגים ערכי T המתאימים לעליות אזוריות (צבעים חמים) ולהקטנות (צבעים קרים) של ספיגת FDG (p < 0.005; k > 50 ווקסלים). קיצור: AHiPM/AL - אזור אמיגדלוהיפוקמפוס חלק פוסטרומדיאלי/אנטרולטרלי, Au - קליפת המוח השמיעתית, Bstm - גזע המוח, מעבד - Caudate-putamen, HTh - היפותלמוס, L - המיספרה שמאלית, PMCo - גרעין אמיגדלואיד קליפת המוח פוסטרומדיאלי, R - חצי הכדור הימני, S1 - קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית. נתון זה שונה באישור Casquero-Veiga et ^al.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: שינויים בחילוף החומרים במוח לאחר DBS חריף ב-mPFC. D1 לעומת D2: אפקט גירוי. מבנים: AHiPM/AL: אזור אמיגדלוהיפוקמפלי חלק פוסטרומדיאלי/אנטרולטרלי, Au: קליפת המוח השמיעתית, Bstm: גזע המוח, CPu: Caudate-putamen, HTh: היפותלמוס, פיר: קליפת המוח הפיריפורמית, PMCo: גרעין אמיגדלואיד קליפת המוח הפוסטרומדיאלית, S1: קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית. החזר השקעה: אזור עניין. צד: ימין (R) ושמאל (L). T: ערך t, k: גודל אשכול. חילוף החומרים של גלוקוז: עלייה ((Boost) וירידה (Decrease) (↓). p: p-value, unc.: לא מתוקן, FWE: תיקון שגיאות חכם במשפחה. טבלה זו שונתה באישור Casquero-Veiga et ^al.8.

בהתחשב בהתקדמות בהבנת תפקוד המוח והרשתות העצביות המעורבות בפתופיזיולוגיה של הפרעות נוירופסיכיאטריות, יותר ויותר מחקרים מזהים את הפוטנציאל של DBS במגוון רחב של פתולוגיות מבוססות נוירולוגיה². עם זאת, מנגנון הפעולה של טיפול זה עדיין לא ברור. מספר תיאוריות ניסו להסביר את ההשפעות המתקבלות בנסיבות פתולוגיות וגירוי ספציפיות, אך ההטרוגניות של המחקרים המוצעים מקשה מאוד להגיע למסקנות סופיות⁴. לכן, למרות מאמצים גדולים, אין קונצנזוס אמיתי, אך מספר החולים העוברים התערבות DBS ממשיך לגדול¹⁸. לאחר מכן, הבנת ההשלכות של DBS במוח in vivo תאפשר לפענח אילו פרמטרים של גירוי ופרוטוקולים של גירוי מתאימים יותר לצרכים של כל מטופל, ומכאן להשיג שיעור הצלחה טוב יותר. בהקשר זה, שיטות דימות מוחי תפקודיות לא פולשניות, כגון FDG-PET, חיוניות כדי לשפוך אור על מה שבאמת מתרחש תחת השפעה ישירה של גירוי חשמלי במוח. לדוגמה, בפרוטוקול האורך המוסבר כאן, DBS מועבר במהלך תקופת קליטת הרדיו-טרייסר של תמונת D2 PET. לפיכך, השוואה בין מחקרי D2 (DBS-ON) ו-D1 (DBS-OFF) PET מאפשרת הדמיה של אזורי המוח המווסתים על ידי הגירוי החשמלי in vivo, שכן תכונות "ההשמנה המטבולית" של FDG מאפשרות לרשום את השינויים המצטברים המתרחשים ישירות במהלך הגירוי^13,19.

בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה אפשרית להערכת ההשלכות האקוטיות של DBS במוח in vivo, אך מגוון שילובי הפרמטרים והפרוטוקולים של DBS הזמינים הוא עצום (למשל, טיפולים רציפים לעומת לסירוגין 20, גירוי בתדר גבוה לעומת נמוך²¹), ואפילו ההשפעות של DBS עשויות להיות שונות יחד עם הטיפול עקב הסקת שינויים ישירים ברשת המוח תחת השפעת הגירוי²² . יתר על כן, מספר האפשרויות הופך גדול עוד יותר בהתחשב במספר ההולך וגדל של פתולוגיות שעבורן מומלץ DBS²³. לכן, מחקרי הדמיה מוחית אורכית שמטרתם לחשוף את דפוסי ההפעלה העצבית המאפשרים לחזות את התגובה הפוטנציאלית לטיפול DBS הם בעלי רלוונטיות קלינית מיוחדת^24,25. בהקשר זה, קיים מספר רחב של מחקרים קליניים ופרה-קליניים אשר העריכו את ההשפעות הטיפוליות של פרוטוקולי DBS שונים על ידי FDG-PET (ראה³ לסקירה). לפיכך, ישנן מספר דוגמאות שבהן פרוטוקול DBS שנחקר מנטרל את התבנית המטבולית במוח הקשורה לפתולוגיה המטופלת, גורם לשיפור בסימפטומים של המטופל ומוכיח את התועלת הקלינית של גישות DBS-PET. דוגמה לכך נמצאת בגירוי של אזור הסינגולייט התת-קלוסלי (SCC) לחולים עם דיכאון עמיד לטיפול. SCC הוא היפראקטיבי מטבולית בחולים לא רפואיים עם דיכאון²⁶, והיפראקטיבציה זו מנורמלת לאחר הפוגה של דיכאון על ידי טיפול פרמקולוגי, פסיכותרפויטי או DBS^27,28,29. חשיבות לכך, חילוף החומרים של SCC היה גבוה יותר באותם חולים שהגיבו ל-DBS לפני שהתחילו את הגירוי בהשוואה לאנשים שאינם מגיבים. מחקר זה הראה דיוק של 80% בחיזוי התגובה ל-SCC-DBS²⁹, והדגיש את החשיבות של הדמיה של סמנים ביולוגיים בבחירת מטופלים פוטנציאליים ל-DBS. לכן, ההקשר המוסבר משקף היסטוריה של הצלחה קלינית של מחקרי FDG-PET שמטרתם למפות את הדפוס המטבולי במוח של דיכאון עם התוצאות הטיפוליות המתקבלות עם SCC-DBS, אשר אמורות להניח את הבסיס לגישות דומות המתמקדות בהפרעות נוירופסיכיאטריות אחרות ובפרוטוקולי DBS בעתיד.

במובן זה, על מנת לבחון את ההשפעות הפיזיולוגיות של DBS באמצעות FDG-PET, רלוונטי במיוחד לשקול היטב את העיתוי הספציפי של פרוטוקול DBS לסריקה. לפיכך, למרות החלת אותם פרמטרים של DBS ואותו פרוטוקול, העיתוי לרכישת התמונה יקבע בבירור את מקור האפנון הנצפה, מה שעלול להוביל לאי הבנות פוטנציאליות בכך שלא ניקח בחשבון את כל הגורמים המעורבים בתגובה הסופית^{שהושגה 8}. לכן, בעוד שתכנון הניתוח הוא הקובע בהנחת הבסיס לטיפול הבא, תכנון פרוטוקול רכישת תמונה המתאים לתוצאות הגירוי הנחקר חיוני להבנה מלאה של המנגנון המולקולרי העומד בבסיס טיפול הגירוי המיושם. לאורך קווים אלה, מספר גורמים יכולים לשנות באופן דרסטי את התגובה לפרוטוקול DBS ספציפי (למשל, פרמטרים של גירוי, החדרת אלקטרודות, מבנה המוח ממוקד, פתולוגיה תחת טיפול, משך ותדירות של מפגשי DBS וכו '). ^7,8,30. התופעות המשתקפות מהנתונים שנאספו במחקר FDG-PET יהיו תלויות בזמן הספציפי במהלך הטיפול שבו התמונות נרכשות. לאחר מכן, כל הנקודות הללו פותחות הזדמנויות מחקר שונות לחקור אפנון המושרה על ידי DBS ולתרום להסבר המנגנונים העומדים בבסיס טיפול זה.

לכן, למרות ההבדלים הגדולים המפרידים בין מכרסמים למוחות אנושיים, יש ליישם פרקטיקות נאותות בכל הרמות, במטרה לפתח פרוטוקולים תרגומיים. במובן זה, אין להתעלם מכך ש- DBS דורש ניתוח פולשני ביותר המבוסס על קרניוטומיה כך שאלקטרודות יוכלו לגשת למבנים מוחיים עמוקים³¹. בשלב זה, ישנם שני מקורות חשובים של זיהום ותגובה דלקתית: מצד אחד, חשיפה ישירה של רקמת המוח במהלך הניתוח, ומצד שני, החדרת שני אלמנטים אקסוגניים לתוך איבר פנימי, יצירת צלקת החדרה על ידי המסלול שלהם לעבר יעד הגירוי³². לכן, עיקור של הציוד הכירורגי, שמירה על אזור ניתוח נקי, וטיפול הולם לאחר הניתוח המבוסס על טיפולים אנטיביוטיים ומשככי כאבים³³ חיוניים כדי להבטיח כי הנושא מקבל את התועלת הגדולה ביותר מן ההתערבות ובתנאים הבריאים ביותר. יתר על כן, זה רלוונטי במיוחד במחקרי הדמיה של FDG-PET, שכן התרחשות של סיבוכים לאחר ניתוח יכולה לשנות את דפוס קליטת הרדיו-טרקר בהתחשב בכך שתהליכים דלקתיים וזיהומיים נתפסים בבירור כאותות היפרמטבוליים³⁴, מה שעלול להוביל לתגובה שונה לטיפול או הערכת יתר של המודולציה המיוצרת על ידי DBS.

עם זאת, מתודולוגיה ניסיונית זו נתונה לכמה מגבלות: ראשית, פרוטוקולי DBS הם בדרך כלל טיפולים ארוכי טווח, רציפים וכרוניים. כאן, פרוטוקול הדמיה מוחית מוצג כדי להעריך את ההשפעות האקוטיות של DBS בזמן אמת. לפיכך, התזמון המוצע למחקרי הדמיה מוחית לא יהיה מספיק כדי לקבל מידע על אפנון ארוך טווח המושרה על ידי DBS כמעט בזמן אמת. עם זאת, הוא עשוי להניח את היסודות לפיתוח גישות אורכיות שונות שישמשו ידע בסיסי להבנת תגובות הנגזרות מ-DBS. שנית, מכיוון שבעלי חיים בריאים שימשו להמחשת שיטה זו, יישום הטכניקות המוסברות לתנאים פתולוגיים שונים עשוי לדרוש את הסתגלותם כדי להבטיח תוצאות טובות יותר ותנאי רווחה אופטימליים. לבסוף, ניתוחים מבחינת ווקסל דורשים גודל מדגם גדול ו/או גורמי תיקון חזקים כדי להשיג תוצאות אמינות, מכיוון שהם תמיד מושפעים מבעיה של השוואות סטטיסטיות מרובות. עם זאת, הערכת ההשלכות של DBS על חילוף החומרים במוח באמצעות FDG-PET עם גישה חכמה ווקסל היא יתרון גדול בשל האופי החקרני הפנימי של שיטה זו, המאפשרת ניתוחים נרחבים של המוח כולו ללא צורך בהנחות מוקדמות כלשהן.

למרות החסרונות המוסברים של שילוב DBS ו- FDG-PET, גישות אלה מספקות חלון הזדמנויות גדול. לכן, קבלת מידע מטבולי במוח באופן לא פולשני הוא יתרון גדול במובן זה נתונים נוירופיזיולוגיים ניתן לאסוף מהנושא במהלך גירוי ובהזדמנויות רבות ושונות יחד עם טיפול DBS. יתר על כן, FDG-PET היא טכניקת הדמיה מוחית בסביבה הקלינית, המחזקת את הגישה התרגומית המניעה שיטה זו. כמו כן, השימוש ב- FDG-PET הוא חלופה מתאימה במיוחד, שכן בניגוד לשיטות הדמיה אחרות, האות המתקבל אינו מושפע מעיוותים משניים בשדות החשמליים או המגנטיים הנגזרים ממערכת הגירוי העצבי, מה שעלול לפגוע הן באיכות התמונה והן בביצועי המערכת²⁴. מאידך גיסא, עניין מחקרי בהערכת ההשלכות המודולטוריות של DBS אינו מוגבל ליתרונות טיפוליים. למעשה, מכיוון ש-DBS הוא טיפול מוקדי, מווסת ולא קבוע בגירוי עצבי, הוא עשוי גם לעזור לפענח את מסלולי הפעילות הנוירו-תפקודית המוערכים על ידי טכניקות הדמיה מולקולריות ובתגובה לגירויים חשמליים המסופקים על ידי syste³⁵. מידע זה יכול להיות בעל ערך רב במיוחד בפענוח חידות נוירופיזיולוגיות לא פתורות בתנאים בריאים ופתולוגיים. לבסוף, המתודולוגיה המוסברת בכתב יד זה מספקת את היכולת לבחון את ההשפעות של נוירומודולציה המושרה על ידי DBS in vivo, בהיותה אסטרטגיה רבת עוצמה כדי לקבוע את ההשפעה של גירוי במהלך היישום שלה. בקיצור, הבנת אפקט ה - in vivo של DBS תסייע להבין את ההשפעות הרצויות והלא רצויות של טיפול זה, לחזות שיפור קליני, ובסופו של דבר להתאים את פרוטוקולי הגירוי לצרכים של כל מטופל.

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים בקשר למאמר זה.

אנו מודים לפרופ' כריסטין וינטר, ג'וליה קליין, אלכסנדרה דה פרנסיסקו ויולנדה סיירה על תמיכתן שלא תסולא בפז באופטימיזציה של המתודולוגיה המתוארת כאן. ה-MLS נתמך על ידי המיניסטריו דה סיינסיה א אינובאסיון, מכון סאלוד קרלוס השלישי (מספר פרויקט PI17/01766 ומספר מענק BA21/0030) במימון משותף של הקרן האירופית לפיתוח אזורי (ERDF), "דרך להפוך את אירופה"; CIBERSAM (מספר פרויקט CB07/09/0031); Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (project number 2017/085); Fundación Mapfre; ופונדאסיון אלישיה קופלוביץ.  MCV נתמך על ידי Fundación טטיאנה פרז דה גוזמן אל בואנו כבעלת מלגה של מוסד זה, והתוכנית המשותפת של האיחוד האירופי - מחקר מחלות נוירודגנרטיביות (JPND). DRM נתמך על ידי Consejería de Educación e Investigación, Comunidad de Madrid, במימון משותף של הקרן החברתית האירופית "השקעה בעתיד שלך" (מענק מספר PEJD-2018-PRE/BMD-7899). NLR נתמך על ידי המכון להשקעות סניטריה גרגוריו מאראניון, "Programa Intramural de Impulso a la I+D+I 2019". עבודת MD נתמכה על ידי מיניסטריו דה סינסיה א אינובאסיון (MCIN) ומכון סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII) (PT20/00044). ה- CNIC נתמך על ידי מכון סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII), המיניסטריו דה סינסיה א אינובאסיון (MCIN) וקרן Pro CNIC, והוא מרכז מצוינות של סברו אוצ'ואה (SEV-2015-0505).