חקירת הפלסטיות הסינפטית לטווח ארוך בהיפוקמפוס הCA1 על ידי אלקטרופיזיולוגיה הקלטת שדה

השתמשנו והקליט אלקטרודות של היפוקמאל פרוסות המוח האורך ו longitudinally הקלטה ואלקטרודות גירוי ההיפוקמפוס הראש ב vivo לעורר את הפוטנציאל המיטיות בפוטנציאלים והפגינו הפלסטיות הסינפטית ארוכת הטווח לאורך CA1 האורך האורכי.

המחקר של הפלסטיות הסינפטית בהיפוקמפוס התמקד בשימוש ברשת CA3-CA1 לאמצ'יני. פחות תשומת לב נגבתה על-ידי רשת CA1-CA1 האורכי. עם זאת, לאחרונה הוצג קשר בין הקשרים בין CA1-CA1 הנוירונים. לכן, יש צורך לחקור אם האורך interlamellar-CA1 רשת של ההיפוקמפוס תומך הפלסטיות הסינפטית.

עיצבנו פרוטוקול כדי לחקור את הנוכחות או העדר של הפלסטיות הסינפטית ארוכת טווח ברשת ההיפוקלבית CA1 היפוקלצ'יני באמצעות הקלטות השדה אלקטרופיזיולוגי הן בvivo והן בתחום החוץ. עבור in vivo הקלטות השדה, ההקלטה והגירוי הונחו בציר הזמני septal של ההיפוקמפוס החצי בזווית האורך, כדי לעורר את הפוטנציאל העירור של התחום הפוסט-סינפטית. לקבלת הקלטות שדות בתחום החוץ, פרוסות האורך של ההיפוקמאל מקבילות למישור הזמני של הseptal. אלקטרודות הקלטה וגירוי הונחו בתוך הרובד (S. O) ואת הרובד רדיואטום (S. R) של ההיפוקמפוס לאורך ציר האורך. זה איפשר לנו לחקור את הכיוון ואת ספציפיות השכבה של הפוטנציאל הפוסינפטיות מעורר. פרוטוקולים מבוססים כבר שימשו כדי לגרום הפוטנציאל לטווח ארוך (LTP) ודיכאון לטווח ארוך (בע מ) הן בvivo והן בתוך מבחנה. התוצאות שלנו הראו כי רשת האורך interlamellar משולבת תומך N-מתיל-D-aspartate (NMDA) קולטן לטווח ארוך הפוטנציאל (LTP) ללא ספציפיות כיווניות או שכבה. אולם, בניגוד לרשת הלצ'יני הרוחבי, לא הופיע עם דיכאון ארוך טווח משמעותי (בע מ).

ההיפוקמפוס כבר בשימוש נרחב במחקרים קוגניטיביים^1,2,3. רשת ההיפוקמפוס בציר הרוחבי יוצרת את המעגלים התלת-סינפטיים העשויים מCA3 ומCA1. רשת הלצ'יני נחשבת ליחידה מקבילה ועצמאית^4,5. נקודת המבט הלצ'יני הזו השפיעה על השימוש בכיוון רוחבי ובפרוסות רוחבי הן בvivo והן במחקרים אלקטרולוגיים של ההיפוקמפוס. לאור המחקר המתעוררים, ההשערה הלצ'יני הוא להיות הוערך מחדש⁶ ותשומת לב גם ניתנת לרשת האינטרלצ'יני של ההיפוקמפוס. בנוגע לרשת ההיפוקמפוס האינטרלצ'יני, אזור CA3 כבר מזמן נחקר^7,8,9,¹⁰, אולם הCA1 האורך היפוקמאל באזור קיבל מעט תשומת לב יחסית עד לאחרונה. ביחס לרשת האינטרלצ'יני CA1, המאפיינים הסינפטיים לטווח קצר לאורך ההיפוקמאל האורך דורסובנאל CA1 ציר של חולדות הוכחו להשתנות¹¹. כמו כן, אשכולות של תאים היפוקמאל להגיב לשלב ואת המקום נמצאו להיות מסודרים בשיטתיות לאורך ציר האורך של ההיפוקמפוס בחולדות, שעברו לטווח קצר משימה זיכרון¹². גם, התקף אפילפסיה הפעילות נמצאו מסונכרנים לאורך ההיפוקמפוס כולו לאורך ציר האורך¹³.

רוב המחקרים של אזור CA1 היפוקאמאל עם זאת, יש מנוצל קלט מCA3 לאזורים CA1^11,14,15. באמצעות פרוטוקול ייחודי לעשות פרוסות המוח האורכי, העבודה הקודמת שלנו הוכיחה את הקישוריות האסוצינלית של CA1 הנוירונים ביניים לאורך ציר האורך ומעורב היכולת לעבד איתות עצבי ביעילות¹⁶. עם זאת, יש צורך לקבוע אם CA1 הנוירונים באמצע הדרך לאורך ציר האורך ללא קלט רוחבי יכול לתמוך פלסטיות לטווח ארוך הסינפטית. ממצא זה יכול להוסיף זווית נוספת לחקירות של סוגיות נוירולוגיות הנוגעות ההיפוקמפוס.

היכולת של נוירונים להתאים את היעילות של העברת מידע ידועה בשם הפלסטיות הסינפטית. הפלסטיות הסינפטית מעורב כמנגנון הבסיסי לתהליכים קוגניטיביים כגון למידה וזיכרון^17,18,19,20. הפלסטיות הסינפטית לטווח ארוך מוצג כפוטנציאל לטווח ארוך (LTP), המייצג את התחזקות התגובה העצבית, או דיכאון לטווח הארוך (בע מ), המייצג את היחלשות התגובה העצבית. הפלסטיות הסינפטית לטווח ארוך נחקר בציר הרוחבי של ההיפוקמפוס. עם זאת, זהו המחקר הראשון להפגין הפלסטיות הסינפטית ארוכת טווח בציר האורך היפוקמאל של CA1 הנוירונים.

בניין מפרוטוקול המשמש את יאנג ואח '¹⁶, עיצבנו את הפרוטוקול כדי להדגים ltp ו-LTD בציר האורך של היפוקמאנאל CA1 הנוירונים. השתמשנו C57BL6 עכברים זכרים עם הגילאים בין 5-9 הישן שבועות עבור ניסויים מבחנה ו 6-12 שבועות הישן עבור ניסויים vivo. מאמר מפורט זה מראה כמה פרוסות המוח האורך היפוקמאל מן העכברים הושגו עבור הקלטות חוץ גופית ואיך בהקלטות vivo נרשמו בציר האורך. עבור הקלטות חוץ גופית, חקרנו ספציפיות כיווניות של הCA1 האורכי הפלסטיות הסינפטית על ידי התמקדות מחיצה ואת הקצה הזמני של ההיפוקמפוס. בדקנו גם את השכבה ספציפיות של הפלסטיות הסינפטית CA1 האורך על ידי הקלטה של הרובד האורידים ושכבה רדיואטום של ההיפוקמפוס. עבור בהקלטות vivo, חקרנו את הזוויות המתאימות ביותר לכיוון האורך של ההיפוקמפוס.

שימוש הן ב-vivo ו הקלטות מחוץ לתחום מתורבת, הבחנו כי הlongitudinally מחוברים CA1 הנוירונים בעלי מידות הציג עם LTP, לא בע מ. האוריינטציה לרוחב מעורבים הן CA3 ו CA1 נוירונים, עם זאת, תומך הן LTP וגם בע מ. ההבחנה ביכולות סינפטיות בין רוחבי לבין הכיוון האורכי של ההיפוקמפוס יכול למבט מסמלים את ההבדלים בקישוריות הפונקציונלית שלהם. ניסויים נוספים נחוצים כדי לפענח את ההבדלים ביכולות הסינפטית שלהם.

כל החיות טופלו בהתאם להנחיות ולתקנות מתוך טיפול בעלי חיים ושימוש במעבדה של המכון הלאומי לבריאות. כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת סיטי של הונג קונג והאוניברסיטה הלאומית של אינצ'ון.

1. בהקלטת שדה vivo

1. הכנה לבעלי חיים
   1. הכנס את השטאן (0.06 גרם לכל 25 גרם משקל) intraperitoneally לעכבר מורדם. תוספת עם הזרקה שרירית של אטרופין (0.05 מ"ג/ק"ג). השאר את העכבר במקום שקט ואפל עד שהרדמה מלאה תיכנס לתוקף.
      התראה: לאורטאן יש פוטנציאל סרטני. טפל בו בזהירות והתלבש בגדי הגנה כדי למנוע מגע עם עור חשוף.
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש ב-isofלאנה כהרדמה.
   2. בדקו עומק של הרדמה לסירוגין עד מטוס ניתוח מלא של הרדמה לוקח להשפיע. בדוק לעומק של הרדמה על ידי ביצוע צביטה הבוהן, האוזן צביטה, צביטה הזנב בדיקות מגע הקרנית כדי להתבונן בתגובה של העכבר כדי גירויים פיזיים.
      הערה: אין להקפיד על תנועת רפלקס או התנדבות כאשר העכבר נמצא במישור ניתוחי הרדמה מלא.
   3. עבור בדיקת צביטה הבוהן, להאריך את האחוריות או זרוע של העכבר לצבוט בחוזקה עם זוג של מלקחיים קהה או אצבעות. העכבר אינו מאושר להרדמה מלאה אם הוא נסוג את הרגל או מטלטל את הגוף, יש הנצפה קצב נשימתי מוגבר או עושה קולות קוליים.
   4. לבדיקת האוזניים, לצבוט את קצות הפינה עם זוג מלקחיים קהה או אצבעות בחוזקה. הרדמה מלאה אינה מאושרת אם העכבר מזיז את השפם קדימה, מנענע את ראשו, משמיע קולות קוליים או שיעור הנשימה הנצפה מוגבר.
   5. עבור בדיקת צביטה זנב, להחזיק את הזנב של העכבר בעדינות לצבוט בחוזקה עם כוח או אצבע קהה. אין לעקוב אחר תנועת הזנב, קול קולי או להגדיל את הגידול בקצב הנשימה, כאשר מורדם לחלוטין עבור הליכים כירורגיים.
   6. עבור בדיקת מגע הקרנית, לגעת הקרנית של העכבר בעדינות, עם פתיל כותנה. ללא תנועת עפעפיים, העברת התנועה או העלייה הנצפים בקצב הנשימה יש לצפות כאשר מורדם לחלוטין לניתוח.
   7. לגלח את השיער על הצוואר והגולגולת של העכבר.
   8. מניחים את העכבר מורדם לחלוטין על כרית חימום להגדיר 37 ° c ולהכניס את הבדיקה טמפרטורה פי הטבעת ברקטום. זה מאפשר את החום המיוצר על ידי משטח החימום כדי להתאים בתגובה לשינויים של טמפרטורת הגוף של העכבר.
   9. להחיל ג'ל העין כדי להרטיב את העיניים של העכבר.
   10. משוך את הלשון אל הצד של השפתיים בעדינות באמצעות מלקחיים ולתקן את שתי השיניים הקדמיות לתוך החור השני או השלישי של כלי הסטרטקטיקה. לתקן את הגולגולת של העכבר בחוזקה באמצעות מלחציים העין.
       הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במלחציים באוזן סטריאוטקטיקה.
   11. התבוננות תחת מיקרוסקופ, להפריד את הרקמה התת עורית ואת השרירים בסוף העצם הבינקודקודית של העכבר עם אזמל לחשוף את cisterna מגנה. מלבד השכבה היבשה מייבשים את האבן בספוגית כותנה.
   12. נקב בעדינות את cisterna מגנה על ידי ביצוע חתך רדוד עם להב אזמל חד מחודד כדי לנקז את הנוזל השדרתי (שדרתי). לחבר מספוגית כותנה כדי להמשיך. לרוקן את השדרתי
2. פתיחת גולגולת
   1. מחזיק את העור על הקרקפת עם מלקחיים, לחתוך ולהסיר את העור עם זוג מספריים כירורגי. חותכים מספיק עור כדי לחשוף את הברגמה ואת סימני למדא על הקרקפת. שמרו על האזור החשוף יבש.
   2. כוונן את הגולגולת המיומנת של העכבר כדי לאפשר את התאמת נקודות הברק ולמדא ברמה אופקית של גובה דומה. הימנע הטיית הראש בתנוחה הקדמית או האחוריים או המצב הצדדי האמצעי.
   3. סמן את הנקודות המתאימות לאזור ההיפוקמאל באמצעות הסיוע של caliper. השתמש במוח העכבר בספר קואורדינטות סטריאוטקטיקה כהתייחסות כדי לקבוע את הקואורדינטות המדויקות.
      הערה: המיקום לסמן לחיתוך ההיפוקמפוס הם 1 מ"מ x 3 מ"מ על קו האמצע המכונה האחורי הקדמי (AP) באמצעות bregma כנקודת התייחסות, ו 3 מ"מ x 3 מ"מ בניצב לקו האמצע (ML) כדי לחבר את הנקודות על קו האמצע. הקואורדינטות סטריאוטקטיקה ניתנות כ (AP: 1, 3 ו-ML: 3, 3).
   4. לעשות חתך בגולגולת מעל האזור החלק העליון של ההיפוקמפוס לאורך הנקודות המסומנות באמצעות אזמל או מקדחה במהירות גבוהה תוך התבוננות תחת מיקרוסקופ.
      הערה: פתיחה בצורת מלבני עם גודל של 2 מ"מ x 3 מ"מ יש להשיג לאחר החיתוך. לשמור על האזור חשוף נקי כדי למנוע פציעה במוח.
   5. בזהירות להוציא את הגולגולת רופף עם מלקחיים כדי לחשוף את מאטר דורא ולהשתמש מזרק או טפטפת בעדינות להחיל פתרון מלוחים פיסיולוגיים כדי לשמור על פני השטח לח.
   6. הסר את מאטר דורא בזהירות עם מחט או מלקחיים קצה מחודד חדה.
      הערה: היזהרו לא לגרום נזק לרקמת המוח במהלך פתיחת הגולגולת. זה יוביל לנפיחות של המוח וישפיע על התוצאות.
   7. לשמור על רקמת המוח חשוף לחות על ידי החלת מלוחים פיסיולוגיים או שמן אדיש באמצעות טפטפת או מזרק.
3. בהקלטה vivo
   1. לתקן ולמקם את הגירוי וההקלטה האלקטרודות בחוזקה במחזיק סטריאוטקטיקה. כוונן את כלי הסטריאוטקטיקה בהתאם למיקום של קואורדינטות AP ו-ML המתאימות לגירוי ולרישום של אלקטרודות מעל ההיפוקמפוס CA1.
      הערה: השתמשו במוח העכבר בקואורדינטות סטריאוטקטיקה כהנחיה באיתור נקודות הציון של אזור CA1 ההיפוקאמאל האורכי. לדוגמה, קואורדינטות סטריאוטקטיקה לאזור CA1 היפוקאמאל (AP 1.5, ML 1.0) לאלקטרודות ההקלטה ו (AP 1.7, ML 1.5) עבור האלקטרודה הגירוי.
   2. לאתר את האלקטרודה מגרה לרוחב לתוך האלקטרודות ההקלטה בכיוון האורך.
      הערה: ודא שאלקטרודות הגירוי וההקלטה נקיות לפני השימוש. זה מונע את המבוא של רעש בעת הקלטה.
   3. עבור הקלטות, השתמש באלקטרודות רב-ערוצי. ראשית, אתר את נקודות הציון של הסטריאוטקטיקה עבור האזור CA1 היפוקאמאל באמצעות הערוץ הראשון. הצב את האלקטרודות הנותרות כך שזווית הגירוי וכלי ההקלטה נמצאות בטווח של 30 ° עד 60 ° ביחס לקו האמצע מנקודת ברסגמה.
      הערה: זווית זו מקבילה לכיוון האורך של האזור CA1 היפוקמאל.
   4. כפקד, לאתר את האלקטרודות ההקלטה מעל אזור CA1 ואת האלקטרודה גירוי מעל האזור CA3 של ההיפוקמפוס הגבי. לדוגמה, שימוש במוח העכבר בקואורדינטות סטריאוטקטיקה כמדריך, קואורדינטות סטריאוטקטיקה עבור CA1-CA3 היפוקמאל באזור יהיה (AP 1.8, ML 1.0) עבור אלקטרודה ההקלטה (AP 1.5, ML 1.5) עבור האלקטרודה גירוי.
      הערה: שלב זה הוא בקרה חלופית ויש לעשות אותו בניסוי נפרד.
   5. מניחים את האלקטרודות בחלק המרוחק של אזור המוח החשוף או מתחת לעור העכבר.
   6. . תדליק את מערכת ההקלטה
   7. פתח את התוכנה עבור הקלטה ורכישת נתונים.
      הערה: למעבדות שונות יש תוכנות מועדפות להקלטה ולרכישת נתונים.
   8. התבוננות מתחת למיקרוסקופ, הנמך את הצריבה והגירוי באיטיות באמצעות המיקרומניפולציה עד שהוא נוגע במשטח המוח. סמן את הנקודה כנקודת האפס כדי להתחיל לחשב את העומק המדויק לאזור ההיפוקמאל.
      הערה: ניתן להשתמש במיקרומניפולציה כדי לפקח על העומק שבו האלקטרודה מוכנסת בכל זמן נתון. להתבונן להגדיל את העכבה רק כאשר האלקטרודה נוגעת במשטח המוח.
   9. הנמך באיטיות את האלקטרודות לעומק המשוער התואם לקואורדינטות הסטרטקטיקה שנבחרה להיפוקמפוס CA1.
      הערה: השתמש במוח העכבר בקואורדינטות סטריאוטקטיקה כמדריך להשגת העומק המשוער המתאים לקואורדינטות הסטרטקטיקה שנבחרו.
   10. תן גירוי (100 μs המשך, חוזר על 30 s מרווחי) ולהתאים את עומק האלקטרודה בשלבים של 50 יקרומטר או פחות עד מעורר יציבה השדה הגירוי הפוטנציאלי הפוסט (fepsp) הוא נצפתה.
       הערה: גירוי של 20 μA הוא בדרך כלל מספיק כדי לעורר תגובה הנצפה.
   11. ודא fEPSP יציבה כבר עורר על ידי שינוי עוצמת גירוי. עלייה בולטת במדרון או משרעת של fEPSP צריך להיות נצפתה עם כל עוצמת גירוי מוגבר. פעולה זו נקראת כעקומת פלט הקלט. יצירת עקומת קלט (I-O) כדי לזהות עוצמת גירוי מקסימלית שבו אין עלייה יותר במדרון של fEPSP מעורר (איור 6).
       הערה: התעלם מנתונים ושנה את מיקום האלקטרודה אם מטח הסיבים ייעלם במהלך הניסוי.
   12. השתמש בעקומת פלט הקלט כדי לקבוע את עוצמת הבסיס ל-40-50% מהמקסימום. השתמש בעוצמת הגירוי המתאימה להקלטה בסיסית.
   13. הקלט את פוטנציאל השדה המקומי כבסיס עבור 20-30 דקות.
   14. השתמש באותה עקומת פלט-קלט כדי לקבוע את עוצמת הגירוי לעירור גירוי בתדר גבוה (HFS) או טטנוס כדי 75% של העוצמה המקסימלית. לחילופין, כאשר ממריץ דיכאון לטווח ארוך, לשמור על עוצמת גירוי זהה המשמש להקלטת הבסיס בעת המרצת גירוי בתדר נמוך (LFS).
   15. החל גירוי הטטאית של 100 פולסים Hz 4 פעמים עם מרווח של 10 s כדי לגרום LTP.
       הערה: השתמש בפרוטוקול זה רק בעת עבודה על ניסוי הפוטנציאל לטווח ארוך.
   16. החל גירוי בתדר נמוך של 5 Hz (900 גירויים במהלך 3 דקות), 1 Hz LFS (900 גירויים במהלך 15 דקות), או 1 הרץ לזווג-פולס (50 ms לזווג מרווח זמן, 900 זוגות של גירויים במהלך 15 דקות) כדי לגרום בע מ על פי פרוטוקולים מבוססים כבר.
       הערה: השתמש בפרוטוקולים אלה רק כאשר אתה עובד על ניסוי לטווח ארוך של דיכאון.
   17. הקלט את הפוטנציאל של השדה המקומי עבור 1 h לאחר HFS או LFS, לחילופין.
   18. יצא נתונים ונתח באמצעות התוכנה.
   19. לאמת את מיקומו של ההקלטה והאלקטרודה הגירוי על ידי מתן גירוי של 10 μA הנוכחי עבור 30 לנגע באזורים מוקלטים. מבשם העכבר עם 4% פאראמפורמלדהיד וקציר המוח לחיתוך וכתמים עם Cresyl ויולט בהתאם.
   20. המתת חסד העכבר על ידי פריקה צוואר הרחם או הזרקה של מינון קטלני להרדמה לאחר הניסוי.

2. בהקלטת שדה מבחנה

1. הכנת פרוסות חמצן ותמיסות מלאכותיות בעלי שדרה מלאכותית (ACSF)
   1. עבור 2 L של חיתוך הפתרון, להוסיף כ 1 L של מים מזוקקים כפול בבקבוקון נפחי ומערבבים במרץ על צלחת שטירר.
   2. הוסף את רכיבי פתרון הפרוסות הבאות (ב-mM): 87.0, 2.5 KCl, 1.3 נה₂PO₄, 25.0 נחקו₃, 25.0 גלוקוז, 75.0 סוכרוז, 7.0 mgcl 2.6H₂o ו 0.5 cacl₂∙ 2h₂o (טבלה 1).
      הערה: לחילופין, MgCl₂∙ 6h₂o ו-cacl₂∙ 2h₂o יכול להיות נשלל בשלב זה והוסיף בהמשך מוכן להשתמש בנפח.
   3. למעלה עד 2 L עם מים מזוקקים כפול תוך ערבוב במרץ.
   4. עבור 2 L של ACSF, להוסיף כ 1 L של מים מזוקקים כפול ב בקבוקון נפחי ומערבבים במרץ על צלחת שטירר.
   5. הוסף את הרכיבים הבאים ACSF פתרון (ב מ): 125.0, 2.5 KCl, 1.3 נה₂PO₄, 25.0 נחקו₃, 25 גלוקוז, 1.0 mgcl₂∙ 6h₂o ו 2.0 cacl₂∙ 2h₂o (טבלה 1).
      הערה: לחילופין, MgCl₂. 6h₂o ו-cacl₂∙ 2h₂o יכול להיות נשלל בשלב זה והוסיף בהמשך מוכן להשתמש בנפח.
   6. למעלה עד 2 L עם מים מזוקקים כפול תוך ערבוב במרץ.
2. הקמה וחיתוך מוח
   1. יוצקים 400 mL של פתרון מוכן כבר פרוסות לתוך בקבוקון נפרד חמצן (95% O₂/5% CO₂) עבור כ 20 דקות.
   2. אחסן את שאר התמיסה 1.6 L במקרר של 4 ° c. שמור על פתרון עד שבוע אחד לאחר שהוא חייב להיות מושלך אם לא משמש כדי למנוע צמיחה פטרייתי.
   3. יוצקים 200 mL של הפתרון לחתוך חמצון בבקבוקון, לכסות עם parafilm ולהעביר עד מקפיא ° c-80 במשך כ 20 דקות כדי להפוך את הרפש.
   4. יוצקים את שאר 200 mL של הפתרון לחתוך במוח נתח מחזיק החדר ולשמור באמבטיה 32 ° c מים עם בעבוע רציפה.
   5. . הכן את הספסל לחיתוך מניחים מגבות נייר וכלי כירורגי על גבי ספסל. סדר את כלי הניתוח כדי להקל על תהליך מהיר ויעיל (איור 7).
   6. קחו את התמיסה מקורר מהמקפיא ויוצקים כ 50 מ ל בגביע. יוצקים כ 10 מ ל בצלחת פטרי המכילה נייר סינון כדי להרטיב אותו. . שים אותם על קרח ליד אזור הניתוח
   7. שופכים את שאר התמיסה של הפרוסות לתוך תא הפרוסות ומסדרים אותו על הרטט.
   8. באמצעות הנחיות ותקנות על טיפול בעלי חיים ושימוש במעבדה של המכון הלאומי לבריאות, ושיטות מאושרות של השימוש בעלי חיים מוסדיים וועדת הטיפול של אוניברסיטת סיטי של הונג קונג ואינצ'ון הלאומי אוניברסיטת.
   9. . ומניחים את הראש על נייר טישו חותכים את העור מכסה את הגולגולת של העכבר וחותכים את השרירים עורית עם מספריים. חותכים את לוחיות הגולגולת לאורך קו האמצע. לעצם העורף בעזרת מספריים כירורגיים
   10. פתח את הגולגולת עם מלקחיים. בוטים כדי לחשוף את המוח בעדינות להוציא את המוח עם מרית ומקום בתמיסה לחיתוך מקורר בספל. . חכה בסביבות ה -30
   11. קחו את המוח בעזרת הכף והניחו אותו בזהירות על נייר הסינון הקודם בצלחת פטרי.
   12. הפרד בין שתי אונות המוח. לאורך קו האמצע עם להב אזמל בודד את ההיפוקמפוס על ידי ניתוק בעדינות מקליפת המוח עם מרית ומניחים אותו בזהירות על נייר הסינון ההרטיב. חותכים את המחיצה ואת הקצה הזמני של ההיפוקמפוס מבודד באמצעות אזמל.
   13. להרים את ההיפוקמפוס מבודד באמצעות מרית קהה ומברשת. לקשור בעדינות את המרית על נייר טישו כדי להסיר את המים העודפים.
   14. החל כמות קטנה של דבק על צלחת הפריסה של הרטט.
   15. עבור פרוסה CA1 היפוקאמאל האורך, לצרף את האזור CA3 של ההיפוקמפוס לצלחת חותך עם הדבק. במהירות, אך הניחו אותו בזהירות בחדר הפרוסות של הרטט הכולל את הפתרון לחיתוך החמצן הצונן.
   16. עבור פרוסה רוחבי שתשמש כפקד, לצרף את הקצה הגחוני של ההיפוקמפוס כדי לחתוך את הצלחת של הרטט. מהר, אך הניחו אותו בזהירות בחדר הפרוסות המכיל את פתרון הניתוח החמצן הצונן.
       הערה: שלב זה הוא חלופה לשלב שלעיל ויש לבצעו בנפרד.
   17. הצב את זווית הלהב ל-90 °. הגדר את הפרמטרים הרטט למהירות של 0.05 מ"מ/s, משרעת של 1.20 מ"מ ועובי פרוסה של 400 μm.
   18. פורסים את ההיפוקמפוס המצורף עם הרטט.
       הערה: פרוסת המוח CA1 האורך טובה יהיה שכבה אחת של CA1 ו 2 שכבות של הג. מקסימום של 2 פרוסות היפוקמאל טוב ניתן להשיג. לחילופין, נתח מוח היפוקמאל הרוחבי יהיה לקבל את gyrus, CA3 ו CA1 אזורים שלמים.
   19. העבר את פרוסות המוח האורך של ההיפוקמאל מתוך הרטט עם פיפטה ומודטה אותו בתוך המוח מחזיק החדר באמבט מים.
   20. מודטה פרוסות באמבט מים 20 דקות בטמפרטורה של 32 ° c ומביאים לטמפרטורת החדר עבור 30 דקות של התאוששות.
       הערה: לחילופין, העבר את פרוסת המוח כאשר מחוץ לאמבט המים ומניחים אותו בעדינות בתא ההקלטה עם ACSF הזורם בטמפרטורה של 32 ° c עבור 30 דקות של התאוששות.
   21. בעוד הדגירה באמבט מים, יוצקים 400 mL של פתרון ACSF לתוך בקבוקון נפרד חמצן (95% O₂/5% CO₂) עבור כ 20-30 דקות לפני העברת פרוסת המוח לתוך חדר ההקלטה. מרעום ברציפות את ה-ACSF לתוך חדר ההקלטה במהירות של 2 מ"ל/min.
   22. הפעל את בקר הטמפרטורה כדי לחמם את ה-ACSF הזורם עד 32 ° c.
   23. אחסן את שאר התמיסה 1.6 L במקרר של 4 ° c. שמור את הפתרון עד שבוע לאחר שהוא חייב להיות מושלך אם לא משמש כדי למנוע צמיחה פטרייתי.
3. הקלטה באמצעות מבחנה
   1. הגדר מעטה הקלטה על-ידי הפעלת כל החומרה הדרושה.
   2. העבר את נתח המוח מחדר האחיזה הפרוסה אל חדר ההקלטה. התאימו את מיקום פרוסת המוח בעזרת מלקחיים קהה והחזיקו אותו במקום בנבל. אפשר ACSF לרוץ לפחות 20 דקות. הדבר מאפשר לנתח המוח להיות יציב לפני ההקלטה.
   3. ממלאים את הפיפטה ההקלטה עם ACSF כפתרון פנימי.
   4. בדוק את התנגדות הפיפטה להקלטה עם התוכנה המיועדת. ההתנגדות פיפטה ההקלטה צריכה להיות בטווח של 3-5 MΩ.
   5. הפעל את התוכנה עבור רכישת נתונים. תוכנה זו צריכה להיות בעלת תכונות דומות המאפשרות רכישת נתונים באופן דומה כמו ההקלטות הvivo המוצגות מוקדם יותר.
   6. תקן את ההקלטה ואת אלקטרודות הגירוי בחוזקה במחזיק הכלי של הסטריאוטקטיקה. מניחים את האלקטרודה ההפניה ב ACSF בתא ההקלטה.
   7. לפרוסות האורך, מקמו את הגירוי וההקלטה של האלקטרודות ברובד האורייינס (S.O.). שמרו על המרחק בין אלקטרודות ל-300 עד 500 μm. מניחים את האלקטרודה הגירוי על המחיצה או על הצד הזמני של פרוסת המוח והשיא מאותה שכבה (איור 8).
   8. לחלופין, מקמו את הגירוי וההקלטה אלקטרודה ברובד רדיואטום (S.R.). מניחים את האלקטרודה הגירוי על המחיצה או על הצד הזמני של פרוסת המוח.
   9. עבור פרוסות רוחבי כפקד, הצב את האלקטרודה המעוררת על אזור הCA3 (מסלול הכיוון הנלווה), ואת האלקטרודות להקלטה באזור CA1 (איור 9).
      הערה: זהו שלב בקרה חלופי ויש לבצעו בניסוי נפרד.
   10. הפעל את גנרטור גירוי מבודד ולתת גירוי (100 μs משך, חוזר במרווחי זמן של 30). להתאים את עומק ההקלטה הרישום ו/או מיקום עד מעורר יציב הפוטנציאל בשדה הסינפטיים הפוטנציאלי הוא נצפתה.
   11. ודא fEPSP יציבה כבר עורר על ידי שינוי עוצמת גירוי. שינוי בולט במדרון של fEPSP צריך להיות נצפתה עם כל שינוי של עוצמת הגירוי. פעולה זו נקראת כעקומת פלט הקלט. צור עקומת קלט-פלט (I-O) כדי לזהות עוצמת גירוי מקסימלית שבו אין עלייה נוספת במדרון של FEPSP (איור 6).
       הערה: התעלם מנתונים ושנה את מיקום האלקטרודה אם מטח הסיבים ייעלם במהלך הניסוי.
   12. השתמש עקומת פלט קלט להגדיר את עוצמת הגירוי עבור הקלטה בסיסית לעורר גירוי בתדר גבוה (HFS) או טטנוס כדי 30-40% של המרבי מעורר fEPSP.
   13. לחילופין, עבור ניסויים לגבי בע מ, השתמש עקומת קלט-פלט כדי להגדיר את עוצמת הבסיס עבור הקלטה בסיסית ולעורר גירוי בתדר נמוך (LFS) כדי 70% של המרבי המרצת fEPSP.
   14. הקלט את פוטנציאל השדה המקומי כקו הבסיס עבור 20-30 דקות.
   15. החל HFS של 100 הרץ פולסים פעמיים עם מרווח של 30 s כדי לגרום LTP.
   16. לחילופין, עבור ניסויים בע מ, להחיל גירוי בתדר נמוך של 5 הרץ (900 הגירוי במהלך 3 דקות) או 1 הרץ LFS (900 גירוי במהלך 15 דקות) או 1 הרץ לזווג הדופק (50 ms לזווג מרווח זמן, 900 זוגות של גירויים במהלך 15 דקות) כדי לגרום בע מ על פי כבר פרוטוקול מבוסס.
   17. הקלט את הפוטנציאל של השדה המקומי עבור 1 h לאחר HFS או LFS.
   18. יצא נתונים ונתח.

אנו חקרו לטווח ארוך הפלסטיות הסינפטית של CA1 האורך של הנוירונים בתוך ההיפוקמפוס באמצעות הקלטות השדה מסחטות הן בvivo והן בתחום החוץ. LTP ו-LTD הם היבטים של הפלסטיות הסינפטית ארוכת טווח אשר הוכחו בציר רוחבי של ההיפוקמפוס להיות חד כיווני.

הצגנו כאן כי באמצעות פרוסות המוח האורכי, יש LTP בציר האורך CA1 של ההיפוקמפוס. הכנו פרוסות האורך של ההיפוקמפוס לאורך ציר septotemporal, הניצב לפרוסות הרוחבי (איור 1). באמצעות הקלטות מהאזור CA1 של ההיפוקמפוס, הראינו את הנוכחות של LTP זה לא היה ספציפי כיוון. לא היו הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית בהקלטות של המחיצה או הזמני (איור 2) בצד של פיסת המוח האורך היפוקמאל. כמו כן הראינו נוכחות של LTP שלא היה ספציפי לשכבה; לפיכך, הקלטות משתי שכבה רדיואטום שכבה (איור 2) הראה בהצלחה ltp בחיתוך המוח האורכי. השתמשנו D-AP5, היריב NMDAR להדגים כי LTP המושרה היה תלוי בקולטנים NMDA (איור 3). מה שקורה במבחנה לא בהכרח משקף בתנאים vivo, אז חקרנו LTP בvivo. איור 4 a מראה דיאגרמה סכמטית של גירוי והקלטה אלקטרודה ממוקם ההיפוקמפוס הטייתי לאורך ציר האורך של אזור CA1 בvivo. מיקום האלקטרודות המשמשות להקלטה ולגירוי אומת על ידי סימני נגעים וכתמי קריסטל סגול (איור 4א). הדגמנו את הנוכחות של LTP בvivo באזור CA1 האורך (איור 4ב).

באמצעות פרוטוקולים מבוססים כבר על גרימת גורם בע מ, נכשלנו בהצלחה לגרום לבע מ הן בvivo והן בתוך מבחנה (איור 5).

איור 1 . ציור סכימטי של פרוסות מוח רוחבי ואורכי. דמות זו מותאמת ושונה מ Sun ואח '. 2018²¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2 . LTP בפרוסות אורך. תגובות סינפטית ב-S.R. (א) או S.O. (ב) בפרוסות האורך מקבילות מיד לאחר גירוי טטנוס עם כניסות הזמן והמחיצה (S.R./טמפורלית (n = 12, ג), S.R./septal (n = 12, ג), S.O./sepd (n = 10, ד), S.O./10:4 (n = 9, d).
N מייצג את מספר הפרוסות. קווי שגיאה מייצגים את SE. נתון זה מותאם ושונה מיום ראשון ואח '. 2018²¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3 . LTP NMDAR תלוי בפרוסות אורך. (א,ב) אינדוקציה ltp בכיוון הזמני ובכיוון מחיצה נחסם על-ידי 50 μm D-AP5 (זמן, n = 6, a) (מחיצה, n = 5, ב). (ג,ד) אינדוקציה ltp בכיוון הזמני ובכיוון מחיצה נחסם גם על ידי D-AP5. ה-n מייצג פרוסות. קווי שגיאה מייצגים את SE. נתון זה מותאם ושונה מיום ראשון ואח '. 2018²¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4 . ב vivo LTP ברשת האינטרלצ'יני. (א) רישום סכמטי של אלקטרודות הקלטה וגירוי בבעלי חיים מורדם. שאיפה של ההקלטה (על צד מחיצה של CA1) ואלקטרודות מגרה (בצד הזמני של CA1) זוהו על ידי סימני נגעים. (ב) ltp הוא המושרה בחיבור האינטרלצ'יני באמצעות 100 לגירוי בתדר גבוה של Hz (n = 10 עכברים). עקבות צבע: לפני (שחור) ואחרי (אדום) HFS. קווי שגיאה מייצגים את SE. נתון זה מותאם ושונה מיום ראשון ואח '. 2018²¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5 . העדר בvivo ובמערכת חוץ-גופית בע מ ברשת CA1 אינטרלצ'יני. (א) 1 הרץ-pp lfs אינו מזרז vivo בע מ (ב) 1 הרץ pp-ltp, (ג) 5 הרץ lfs, ו (ד) 1 hz lfs לא לייצר בע מ על הצדדים הזמני או מחיצה של פרוסת המוח האורכי. בעוד בע מ נגרמת על ידי 1 הרץ pp-lfs בפרוסות רוחבי: הזמני (n = 8), מחיצה (n = 11) ו רוחבי (n = 6) עם 1 הרץ pp-lfs; זמני (n = 3) ו-מחיצה (n = 3) עם 5 ממדי Hz; זמני (n = 3) ו-מחיצה (n = 3) עם 1 Hz lfs. ה-n מייצג פרוסות. קווי שגיאה מייצגים את SE. נתון זה מותאם ושונה מיום ראשון ואח '. 2018²¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6 . קלט-פלט עקומת הצגת מדרון fEPSP בתגובה להגדיל את התמריצים הגירוי בתוך פרוסת המוח היפוקמאל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7 . כלים כירורגיים המשמשים לבידוד היפוקמאל במהלך חיתוך מוח מתורבת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8 . . חיתוך מוח אורכי מוכן להקלטה אלקטרודה גירוי ופיפטה הקלטה מוכנסים לרובד רדיואטום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9 . . מוכנה להקלטה אלקטרודה גירוי מוכנס באזור CA3 הנלווה שייפר ו pi, ההקלטה מוכנס באזור CA1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: ריכוזי תרכובות בפרוסת המוח ופתרונות נוזלים מלאכותיים בשדרתי.

הפרוטוקול ממחיש את השיטה כדי לגרום לפלסטיות ארוכת טווח הסינפטית בvivo, כמו גם מתוך פרוסות מוח בציר CA1-CA1 האורך של ההיפוקמפוס בתוך מבחנה. השלבים מתוארים לתת מספיק פרטים עבור ניסויים כדי לחקור LTP ו-LTD בחיבור היפוקמאל CA1-CA1 האורך. התרגול צריך לחדד את הכישורים הדרושים כדי להקליט בהצלחה הפוטנציאל מרגש בשדה.

בנוסף לתרגול הצורך, קיימים מספר שלבים קריטיים הנחוצים להשגת תוצאות טובות. ראשון, זה הוכח בעבר כי את הזווית שבה המוח פרוסות נעשו יכול לחתוך או לשמר את התחזיות האורך של הנוירונים באמצע הפירמידה באזור CA1-CA1 של ההיפוקמפוס¹⁶. לאורך הנוירונים באמצע מיזם הנירמול נוירונים בזווית שהיא כמעט בניצב. כמו הנוירונים CA1 מופצים בזוויות מגוונות בתוך ההיפוקמפוס, את הקשר האורך בין אותם מניח לאורך הציר dorsoventral של ההיפוקמפוס. כך, עבור בהקלטה מחוץ למוח, הניסויים חייב לשמור על זה במדויק למקד את הנוירונים CA1-CA1 היפוקמאל לאורך ציר האורך על ידי גזירה של רקמת ההיפוקמפוס מבודדים לאורך הציר הגייתי-הגייתי. כמו כן, עבור בהקלטות vivo, את הזווית שבה הגירוי ואת אלקטרודות ההקלטה ממוקמים קובע אם התוצאות שהתקבלו הם נציג של ציר האורך או תערובת של הציר הרוחבי והאורך. חקירות נוספות ניצול CRISPR-Cas9 ניתן לעשות כדי לאשר אם התגובה המבוקר היא אך ורק מאזור CA1 מאז זה יכול להיות תערובת של תגובות הן CA1 ואת האזורים CA3.

שנית, עבור ניסויים במבחנה, הניסוי חייב להבטיח את הפתרון לחתוך את המוח, ACSF, ספסל העבודה וכל הציוד או המכשירים הנמצאים במגע עם המוח החלק הם ללא מזהמים. כל סוג של זיהום יוביל להידרדרות השלמות או המוות של נתח המוח. שמירה על משטח אלקטרודה נקי תבטיח הקלטות טובות ויציבות הן בתוך מבחנה והן בניסויים vivo.

הראינו כי הCA1 האורך היפוקמאל ברשת מוצגים LTPs תלויי NMDAR, אבל לא Ltps. המעגל הטריסינפטית, עם זאת, מציג עם ltp ו-^22,23. זה מרמז כי רשת CA1 האורך ואת המעגלים tri-סינפטית יש תכונות ייחודיות. הפרוטוקול שלנו עושה שימוש רק הקלטות אלקטרופיזיולוגיות ולכן מוגבל למצוא את ההבדל בין שתי רשתות אלה.

החיפוש אחר תרופה למחלות מוח כגון סכיזופרניה ממשיכה. התדרדרות או עיוות של אזורי משנה CA1 היפוקאמאל קושרו עם כמה תסמינים סכיזופרניים^24,25. היישום של הפרוטוקול שלנו, למרות בסיסי, הביא לאור יכולת סינפטית ייחודית של תת הCA1 האורך היפוקמאל. ידע זה שימושי בעיצוב ניסויים שיכולים עוד לחקור את מחלת המוח מתישה לאורך ציר CA1 האורך של ההיפוקמפוס.

. אין לנו מה לגלות

עבודה זו נתמכת על ידי האוניברסיטה הלאומית של האינצ (קואופרטיב בינלאומי) מענק מחקר. אנו רוצים להודות לגברת גונה צ'וי על סיוע באיסוף מידע מסוים.