التحقيق في اللدونة متشابك على المدى الطويل في Interlamellar Hippocampus CA1 عن طريق تسجيل المجال الكهرولوجيسي

استخدمنا الأقطاب الكهربائية للتسجيل والتحفيز في شرائح الدماغ فرس النهر الطولية وأقطاب التسجيل والتحفيز ذات الوضع الطولي في الحصين الظهري في الجسم الحي لاستحضار الإمكانات خارج الخلية وتثبت اللدونة متشابك على المدى الطويل على طول INTERlamellar طولية CA1.

وقد ركزت دراسة اللدونة متشابك في الحصين على استخدام شبكة CA3-CA1 lamellar. وقد أولي اهتمام أقل لشبكة INTERlamellar CA1-CA1 الطولية. في الآونة الأخيرة ومع ذلك، تم عرض اتصال اقتراني بين الخلايا العصبية الهرمية CA1-CA1. لذلك، هناك حاجة للتحقيق في ما إذا كانت شبكة interlamellar طولية CA1-CA1 من الحصين يدعم اللدونة متشابك.

قمنا بتصميم بروتوكول للتحقيق في وجود أو عدم وجود اللدونة متشابك على المدى الطويل في شبكة CA1 فرس النهر interlamellar باستخدام التسجيلات الميدانية الكهرولوجية على حد سواء في الجسم الحي وفي المختبر. لفي التسجيلات الميدانية خارج الخلية الحية، تم وضع أقطاب التسجيل والتحفيز في محور الحاجز الزمني للالحصين الظهري في زاوية طولية، لاستحضار الإمكانات الميدانية المحفزة. أما بالنسبة للتسجيلات الميدانية خارج الخلية في المختبر، فقد تم قطع الشرائح الطولية في فرس النهر بالتوازي مع المستوى الحاجز الزمني. تم وضع أقطاب التسجيل والتحفيز في الطبقة oriens (S.O) وطبقة الراديوتوم (S.R) من الحصين على طول المحور الطولي. وقد مكننا ذلك من التحقيق في خصوصية الاتجاه والطبقة للإمكانات المحفزة التي تثيرها. وقد استُخدمت البروتوكولات المنشأة بالفعل للحث على التقوية على المدى الطويل والاكتئاب الطويل الأجل في كل من الجسم الحي والمختبر. أظهرت نتائجنا أن شبكة INTERlamellar CA1 الطولية تدعم N-methyl-D-aspartate (NMDA) تعتمد على مستقبلات التقوية على المدى الطويل (LTP) مع عدم وجود تحديد الاتجاه أو طبقة. غير أن شبكة إنترلاميلار، على النقيض من شبكة لاميلار العرضية، لم تكن موجودة مع أي اكتئاب كبير طويل الأجل (LTD).

وقد استخدمت على نطاق واسع الحصين في الدراسات المعرفية^1,2,3. تشكل شبكة لاميلار فرس النهر في المحور المستعرض الدوائر ثلاثية المشبك التي تتكون من مناطق الكُرس وCA3 وCA1. وتعتبر شبكة lamellar لتكون وحدة موازية ومستقلة^4،5. وقد أثرت وجهة نظر لاميلار هذه على استخدام الاتجاه العرضي والشرائح العرضية لكل من الدراسات الكهرولوجية في المختبر في الحصين. في ضوء البحوث الناشئة، يتم إعادة تقييم فرضية lamellar⁶ ويتم إيلاء الاهتمام أيضا لشبكة interlamellar من الحصين. فيما يتعلق بشبكة فرس النهر interlamellar، وقد تم التحقيقمنذ فترة طويلة منطقة CA3 7،^8،9،10،ولكن المنطقة الطولية CA1 فرس النهر تلقت اهتمام قليل نسبيا حتى وقت قريب. وفيما يتعلق بشبكة CA1 interlamellar، وقد تبين أن خصائص متشابك على المدى القصير على طول محور فرس النهر الطولي دورسوفينال CA1 من الفئران تختلف¹¹. أيضا، تم العثور على مجموعات من خلايا فرس النهر الاستجابة للمرحلة والمكان ليتم ترتيبها بشكل منهجي على طول المحور الطولي من الحصين في الفئران، وتمر مهمة الذاكرة على المدى القصير¹². أيضا، تم العثور على أنشطة النوبات الصرعية لتكون متزامنة على طول الحصين كله على طول المحور الطولي¹³.

معظم الدراسات من منطقة فرس النهر CA1 الطولية ومع ذلك، وقد استخدمت المدخلات من CA3 إلى المناطق CA1^11،14،15. باستخدام بروتوكول فريد من نوعه لجعل شرائح الدماغ الطولية، أظهر عملنا السابق الاتصال الارتباطي للخلايا العصبية الهرمية CA1 على طول المحور الطولي وتورط في قدرته على معالجة الإشارات العصبية بشكل فعال¹⁶. ومع ذلك، هناك حاجة لتحديد ما إذا كانت الخلايا العصبية الهرمية CA1 على طول المحور الطولي دون مدخلات عرضية يمكن أن تدعم اللدونة متشابك على المدى الطويل. هذا الاستنتاج يمكن أن تضيف زاوية أخرى في التحقيقات في القضايا العصبية المتعلقة الحصين.

ومن المعروف قدرة الخلايا العصبية على تكييف فعالية نقل المعلومات كما اللدونة متشابك. اللدونة متشابك متورط كآلية أساسية للعمليات المعرفية مثل التعلم والذاكرة^{17،18،19،20}. يتم إثبات اللدونة متشابك على المدى الطويل إما التقوية على المدى الطويل (LTP)، والذي يمثل تعزيز استجابة الخلايا العصبية، أو الاكتئاب على المدى الطويل (LTD)، والذي يمثل ضعف استجابة الخلايا العصبية. وقد درست اللدونة متشابك على المدى الطويل في المحور العرضي للالحصين. ومع ذلك، هذه هي الدراسة الأولى لإظهار اللدونة متشابك على المدى الطويل في محور طولي فرس النهر من الخلايا العصبية الهرمية CA1.

بناء من بروتوكول المستخدمة من قبل يانغ وآخرون¹⁶، قمنا بتصميم البروتوكول لإظهار LTP وLTD في محور طولي فرس النهر من الخلايا العصبية الهرمية CA1. استخدمنا الفئران الذكور C57BL6 مع أعمار تتراوح بين 5-9 أسابيع من العمر للتجارب في المختبر و 6-12 أسابيع من العمر لفي تجارب الجسم الحي. تُظهر هذه المقالة التفصيلية كيف تم الحصول على شرائح الدماغ الطولي من الفئران للتسجيلات المختبرية وكيف تم تسجيل التسجيلات في الجسم الحي في المحور الطولي. بالنسبة للتسجيلات في المختبر، قمنا بالتحقيق في الخصوصية الاتجاهية للدونة المتشابكة لـ CA1 الطولية من خلال استهداف الطرف الحاجز والزمني لالحصين. كما قمنا بالتحقيق في خصوصية طبقة اللدونة المتشابكة CA1 الطولية عن طريق التسجيل من الطبقة oriens وطبقة الراديوتوم من الحصين. لفي تسجيلات الجسم الحي، قمنا بالتحقيق في الزوايا التي تتوافق على أفضل وجه مع الاتجاه الطولي للالحصين.

باستخدام كل من في الجسم الحي وفي المختبر التسجيلات الميدانية خارج الخلية، لاحظنا أن الخلايا العصبية الهرمية CA1 المتصلة طوليا المقدمة مع LTP، وليس المحدودة. التوجه العرضية التي تنطوي على كل من CA3 وCA1 الخلايا العصبية، ومع ذلك، يدعم كل من LTP وLTD. التمييز في القدرات متشابك بين عرضية والتوجه الطولي من الحصين يمكن أن يدل على المضاربة الاختلافات في الاتصال الوظيفي. وهناك حاجة إلى مزيد من التجارب لفك رموز الاختلافات في قدراتها متشابك.

وقد عولجت جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الصادرة عن معهد الصحة الوطني للعناية بالحيوان واستخدام مختبر هـذا المختبر. تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة مدينة هونغ كونغ وجامعة إنتشون الوطنية.

1. في تسجيل حقل فيفو

1. إعداد الحيوانات
   1. حقن اليوريثان (0.06 غرام لكل 25 غرام من الوزن) داخل الجنة لالتخدير الماوس. الملحق مع حقن العضل من الأتروبين (0.05 ملغ / كغ). إبقاء الماوس في بقعة هادئة مظلمة حتى التخدير الكامل نافذة المفعول.
      تحذير: اليوريثان لديه إمكانات مسرطنة. التعامل معها بعناية وارتداء الملابس الواقية لتجنب الاتصال مع الجلد المعرضة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام الأيسوفلوران كتخدير.
   2. تحقق من عمق التخدير بشكل متقطع حتى تصبح الطائرة الجراحية الكاملة للتخدير نافذة المفعول. تحقق من عمق التخدير عن طريق إجراء قرصة اصبع القدم، قرصة الأذن، قرصة الذيل واختبارات لمسة القرنية لمراقبة استجابة الماوس للمحفزات البدنية.
      ملاحظة: لا ينبغي ملاحظة حركة رد الفعل أو الطوعية عندما يكون الماوس في مستوى جراحي كامل من التخدير.
   3. لاختبار قرصة اصبع القدم، تمديد إما الخلفية أو الأمامية للماوس وقرصة بحزم مع زوج من ملقط حادة أو الأصابع. لا يتم تأكيد الماوس للتخدير الكامل إذا كان يسحب الساق أو يهز الجسم، لديه معدل زيادة الجهاز التنفسي ملحوظ أو يجعل الأصوات الصوتية.
   4. لاختبار قرصة الأذن، قرصة نهايات بينا مع زوج من ملقط حادة أو الأصابع بحزم. لا يتم تأكيد التخدير الكامل إذا كان الماوس يتحرك شعيرات إلى الأمام، يهز رأسه، يجعل الأصوات الصوتية أو لديه معدل الجهاز التنفسي زيادة ملحوظة.
   5. لاختبار قرصة الذيل، عقد ذيل الماوس بلطف وقرصة بحزم مع قوة حادة أو إصبع. لا ينبغي ملاحظة أي حركة الذيل، والصوت الصوتي أو الزيادة الملحوظة في معدل الجهاز التنفسي عند التخدير الكامل للعمليات الجراحية.
   6. لاختبار لمسة القرنية، المس القرنية للماوس بلطف، مع فتيل القطن. لا ينبغي ملاحظة أي حركة الجفن، وحركة الشعيرات أو زيادة ملحوظة في معدل الجهاز التنفسي عند التخدير الكامل للجراحة.
   7. حلاقة الشعر على الرقبة والجمجمة من الماوس.
   8. ضع الماوس المُمسِّد بالكامل على لوحة تدفئة مُعدّة إلى 37 درجة مئوية وأدخل مسبار درجة حرارة المستقيم في المستقيم. وهذا يتيح الحرارة التي تنتجها لوحة التدفئة لضبط استجابة للتغيرات في درجة حرارة الجسم الماوس.
   9. تطبيق هلام العين لترطيب عيون الماوس.
   10. سحب اللسان إلى جانب الشفاه بلطف باستخدام ملقط وإصلاح الأسنان الأمامية اثنين في ثقب الأسنان الثاني أو الثالث من الصك مجسمة. إصلاح جمجمة الماوس بحزم باستخدام العين المشبك.
       ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن استخدام مشبك الأذن المجسمة.
   11. مراقبة تحت المجهر، فصل الأنسجة تحت الجلد والعضلات في نهاية العظام بين البارية والقذالي من الماوس مع مشرط لفضح التريجا ماجنا. لطخة الأم دورا الجافة مع مسحة القطن.
   12. ثقب بلطف التريجا ماجنا عن طريق جعل قطع الضحلة مع شفرة مشرط حادة مدببة لاستنزاف السائل الدماغي الشوكي (CSF). إرفاق مسحة القطن للحفاظ على استنزاف CSF.
2. استئصال الجمجمة
   1. عقد الجلد على فروة الرأس مع ملقط، وقطع وإزالة الجلد مع زوج من مقص الجراحية. قطع ما يكفي من الجلد لفضح علامات بريجما ولامدا على فروة الرأس. الحفاظ على المنطقة المكشوفة الجافة.
   2. ضبط الجمجمة فرضت من الماوس لتمكين نقاط bregma ولامدا أن تكون محاذاة في مستوى أفقي من ارتفاع مماثل. تجنب إمالة الرأس إما في الوضع الأمامي الخلفي أو في الوضع الجانبي الأوسط.
   3. وضع علامة على النقاط المقابلة لمنطقة فرس النهر باستخدام المعونة من الفرجار فيرنييه. استخدم دماغ الماوس في كتاب إحداثيات مجسمة كمرجع للمساعدة في تحديد الإحداثيات الدقيقة.
      ملاحظة: الموقع الذي سيتم وضع علامة على شق لالحصين هي 1 مم × 3 مم على خط الوسط المشار إليه باسم الخلفية الأمامية (AP) باستخدام البريما كنقطة مرجعية، و 3 مم × 3 مم عمودي على خط الوسط (ML) لربط النقاط على خط الوسط. وترد الإحداثيات المجسمة على النحو (AP: 1,3 وML: 3,3).
   4. قم بعمل شق في الجمجمة فوق المنطقة الظهرية في الحصين على طول النقاط المعلّمة باستخدام مشرط أو مثقاب عالي السرعة أثناء المراقبة تحت المجهر.
      ملاحظة: يجب الحصول على فتحة مستطيلة الشكل بحجم 2 مم × 3 مم بعد الشق. الحفاظ على المنطقة المكشوفة نظيفة لتجنب إصابة الدماغ.
   5. أخرج الجمجمة السائبة بعناية مع ملقط لفضح الأم دورا واستخدام حقنة أو قطرة لتطبيق بلطف محلول ملحي الفسيولوجية للحفاظ على سطح رطبة.
   6. إزالة الأم دورا بعناية مع إبرة أو حاد ملقط تلميح مدبب.
      ملاحظة: يجب الحرص على عدم التسبب في أي ضرر لأنسجة الدماغ أثناء استئصال الجمجمة. وهذا سيؤدي إلى تورم في الدماغ وسوف تؤثر على النتائج.
   7. الحفاظ على أنسجة الدماغ المكشوفة رطبة عن طريق تطبيق المالحة الفسيولوجية أو النفط الخامل باستخدام قطرة أو حقنة.
3. في تسجيل الجسم الحي
   1. إصلاح ووضع التحفيز وتسجيل القطب بحزم في حامل مجسمة. ضبط أداة مجسمة وفقا لموقف إحداثيات AP وML المقابلة لتحفيز وتسجيل الأقطاب فوق الحصين الظهري CA1.
      ملاحظة: استخدم دماغ الماوس في إحداثيات مجسمة كدليل في تحديد موقع الإحداثيات لمنطقة فرس النهر CA1 الطولية الظهرية. على سبيل المثال، سيكون الإحداثيات المجسمة لمنطقة فرس النهر CA1 (AP 1.5، ML 1.0) لأقطاب التسجيل و (AP 1.7، ML 1.5) لأقطاب التحفيز.
   2. حدد موقع القطب الكهربائي الجانبي المحفز إلى قطب التسجيل في اتجاه طولي.
      ملاحظة: تأكد من أن كل من الأقطاب الكهربائية التحفيز وتسجيل نظيفة قبل الاستخدام. وهذا يمنع إدخال الضوضاء عند التسجيل.
   3. للتسجيلات، استخدم أقطاب متعددة القنوات. أولاً، حدد موقع الإحداثيات المجسمة لمنطقة فرس النهر CA1 باستخدام القناة الأولى. وضع الأقطاب المتبقية بحيث زاوية التحفيز وتسجيل الأقطاب الكهربائية هي في نطاق 30 درجة إلى 60 درجة فيما يتعلق خط الوسط من نقطة بريجما.
      ملاحظة: تتوافق هذه الزاوية مع الاتجاه الطولي لمنطقة فرس النهر CA1.
   4. كعنصر تحكم، حدد موقع قطب التسجيل فوق منطقة CA1 وقطب التحفيز فوق منطقة CA3 من الحصين الظهري. على سبيل المثال، باستخدام دماغ الماوس في إحداثيات مجسمة كدليل، سيكون الإحداثيات المجسمة لمنطقة فرس النهر CA1-CA3 (AP 1.8، ML 1.0) لأقطاب التسجيل و(AP 1.5، ML 1.5) لأقطاب التحفيز.
      ملاحظة: هذه الخطوة عنصر تحكم بديل ويجب القيام به في تجربة منفصلة.
   5. ضع القطب المرجعي في جزء بعيد من منطقة الدماغ المكشوفة أو تحت جلد الماوس.
   6. قم بتشغيل نظام التسجيل.
   7. افتح البرنامج للتسجيل والحصول على البيانات.
      ملاحظة: لدى مختبرات مختلفة برامجها المفضلة للتسجيل والحصول على البيانات.
   8. مراقبة تحت المجهر، وانخفاض تسجيل والتحفيز الأقطاب ببطء باستخدام micromanipulator حتى أنه يمس فقط سطح الدماغ. وضع علامة على النقطة كنقطة الصفر لبدء حساب العمق الدقيق لمنطقة فرس النهر.
      ملاحظة: يمكن استخدام المتلاعب الدقيق لمراقبة العمق الذي يتم إدخال القطب الكهربائي في أي وقت من الأوقات. لاحظ زيادة في المعاوقة فقط عندما يلمس القطب سطح الدماغ.
   9. خفض ببطء الأقطاب الكهربائية إلى العمق التقريبي المقابل للإحداثيات المجسمة المختارة لالحصين CA1.
      ملاحظة: استخدم دماغ الماوس في إحداثيات مجسمة كدليل للحصول على العمق التقريبي المقابل للإحداثيات المجسمة المختارة.
   10. إعطاء التحفيز (100 درجة مئوية المدة، وكرر في فترات 30 ثانية) وضبط عمق القطب الكهربائي في خطوات من 50 ميكرومتر أو أقل حتى يتم ملاحظة مستقرة أثار حقل الإثارة الإثارة المشاركات (fEPSP).
       ملاحظة: عادة ما يكون التحفيز 20 درجة مئوية كافية لاستحضار استجابة ملحوظة.
   11. تأكد من أن fEPSP مستقرة قد أثيرت من خلال تغيير كثافة التحفيز. وينبغي ملاحظة زيادة ملحوظة في المنحدر أو السعة من fEPSP مع كل زيادة كثافة التحفيز. ويسمى هذا منحنى الإدخال والإخراج. إنشاء منحنى الإدخال الإخراج (I-O) للكشف عن الحد الأقصى لكثافة التحفيز التي لا توجد فيها زيادة أخرى في منحدر fEPSP أثار (الشكل6).
       ملاحظة: تجاهل البيانات وتغيير موضع القطب الكهربائي إذا اختفت الطائرة الألياف أثناء التجربة.
   12. استخدم منحنى الإدخال والإخراج لتعيين كثافة الأساس إلى 40- 50% من الحد الأقصى. استخدم كثافة التحفيز المقابلة لتسجيل خط الأساس.
   13. تسجيل إمكانات الحقل المحلي كخط أساس لمدة 20-30 دقيقة.
   14. استخدم نفس منحنى الإدخال والإخراج لتعيين شدة التحفيز لاستحضار التحفيز العالي التردد (HFS) أو الكزاز إلى 75% من الحد الأقصى للكثافة. بدلامن ذلك، عند تحفيز الاكتئاب على المدى الطويل، والحفاظ على نفس كثافة التحفيز المستخدمة لتسجيل خط الأساس عند إثارة التحفيز التردد المنخفض (LFS).
   15. تطبيق التحفيز الكزازي من البقول 100 هرتز 4 مرات مع فاصل زمني 10 ثانية للحث LTP.
       ملاحظة: استخدم هذا البروتوكول فقط عند العمل على تجربة تقوية طويلة الأجل.
   16. تطبيق التحفيز التردد المنخفض من 5 هرتز (900 المحفزات خلال 3 دقائق)، 1 هرتز LFS (900 المحفزات خلال 15 دقيقة)، أو 1 هرتز النبض المقترن (50 مللي ثانية الفاصل الزمني النبض المقترن، 900 أزواج من المحفزات خلال 15 دقيقة) للحث LTD وفقا للبروتوكولات المعمول بها بالفعل.
       ملاحظة: استخدم هذه البروتوكولات فقط عند العمل على تجربة الاكتئاب على المدى الطويل.
   17. تسجيل إمكانات الحقل المحلي لمدة ساعة واحدة بعد HFS أو LFS، بدلاً من ذلك.
   18. تصدير البيانات وتحليلها باستخدام البرنامج.
   19. تحقق من موقف القطب التسجيل والتحفيز عن طريق إعطاء تحفيز 10 ميكروثانية الحالية لمدة 30 ثانية لآفة المناطق المسجلة. عبر cardially perfuse الماوس مع 4٪ paraformaldehyde وحصاد الدماغ لتقطيع وتلطيخ مع كريسل البنفسجي وفقا.
   20. قتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم أو حقن جرعة مخدرة قاتلة بعد التجربة.

2. في المختبر تسجيل الحقل

1. إعداد حلول التقطيع المؤكّس والسائل النخاعي الاصطناعي (ACSF)
   1. بالنسبة لـ 2 لتر من محلول التقطيع، أضف حوالي 1 لتر من الماء المقطر المزدوج في قارورة حجمية وحرّك بقوة على طبق النمام.
   2. إضافة مكونات الحل التقطيع التالية (بالمليون): 87.0 حمض الكلس، 2.5 كيلو كل، 1.3 NaH₂PO_4،25.0 NaHCO_3،25.0 الجلوكوز، 75.0 السكروز، 7.0 ملغ كل 2.6H₂O و 0.5 CaCl₂∙2H₂O (الجدول1).
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن استبعاد MgCl₂∙6H₂O و CaCl₂∙2H₂O في هذه المرحلة وإضافتها لاحقًا في وحدة تخزين جاهزة للاستخدام.
   3. يُرفع المزيج إلى 2 لتر مع الماء المقطر المزدوج مع التحريك بقوة.
   4. بالنسبة لـ 2 لتر من ACSF، أضف حوالي 1 لتر من الماء المقطر المزدوج في قارورة حجمية وحرّك بقوة على طبق النمام.
   5. تضاف مكونات الحل التالية لـ ACSF (بالمليون): 125.0 حمض المتردد، 2.5 كيلو كل، 1.3 NaH₂PO_4،25.0 NaHCO_3،25 الجلوكوز، 1.0 ملغ كل 2∙6H₂O و 2.0 CaCl₂∙2H₂O (الجدول1).
      ملاحظة: بدلاً منذلك، يمكن استبعاد MgCl 2.6H₂O و CaCl₂∙2H₂O في هذه المرحلة وإضافتها لاحقًا في وحدة تخزين جاهزة للاستخدام.
   6. يُرفع المزيج إلى 2 لتر مع الماء المقطر المزدوج مع التحريك بقوة.
2. الإعداد وتقطيع الدماغ
   1. صب 400 مل من محلول التقطيع المعدة بالفعل في قارورة منفصلة والأكسجين (95٪ O₂/5٪ CO₂₎لمدة 20 دقيقة تقريبا.
   2. تخزين بقية الحل 1.6 لتر في ثلاجة 4 درجة مئوية. الحفاظ على حل تصل إلى 1 أسبوع بعد ذلك يجب التخلص منها إذا لم تستخدم لتجنب النمو الفطري.
   3. صب 200 مل من محلول التقطيع المؤكّص في القارورة، وغطيه بالبارافيلم ونقله إلى فريزر -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبًا لصنع طين.
   4. صب ما تبقى 200 مل من حل التقطيع في غرفة عقد شريحة الدماغ والحفاظ على حمام المياه 32 درجة مئوية مع محتدما المستمر.
   5. إعداد مقاعد البدلاء للتقطيع. وضع المناشف الورقية أسفل والأدوات الجراحية على رأس مقاعد البدلاء. ترتيب الأدوات الجراحية حسب الاستخدام لتسهيل عملية سريعة وفعالة (الشكل7).
   6. إخراج محلول التقطيع المبرد من الثلاجة وصب ما يقرب من 50 مل في كوب. صب ما يقرب من 10 مل في طبق بيتري يحتوي على ورقة فلتر لترطيبذلك. وضعها على الجليد من منطقة تشريح.
   7. صب بقية الحل التقطيع موحل في غرفة التقطيع وإصلاحه على الاهتزاز.
   8. تخدير الماوس مع isoflurane باستخدام المبادئ التوجيهية واللوائح بشأن رعاية الحيوان واستخدام مختبر المعهد الوطني للصحة، والأساليب المعتمدة من اللجنة المؤسسية لاستخدام ورعاية الحيوانات من جامعة مدينة هونغ كونغ وإنتشون الوطنية جامعه.
   9. قطع رأس الماوس التخدير مع زوج من مقص ووضع الرأس على ورقة الأنسجة. قطع الجلد الذي يغطي جمجمة الماوس وقطع من خلال العضلات الجلدية مع مقص. قطع لوحات الجمجمة على طول خط الوسط إلى العظام القذالي باستخدام مقص الجراحية.
   10. افتح الجمجمة بملقط حادة لفضح الدماغ. يُسكب الدماغ برفق مع ملعقة ومكان في محلول التقطيع المبرد في الكأس. انتظر حوالي 30 s.
   11. إخراج الدماغ باستخدام ملعقة ووضعها بعناية على ورقة فلتر مبللة سابقا في طبق بيتري.
   12. فصل نصفي الدماغ على طول خط الوسط مع شفرة مشرط. عزل الحصين عن طريق فصل بلطف من القشرة مع ملعقة ووضعها بعناية على ورقة مرشح مبللة. قطع الحاجز والطرف الزمني من الحصين معزولة باستخدام مشرط.
   13. التقط الحصين المعزول باستخدام ملعقة حادة وفرشاة. ضع ملعقة بلطف على ورقة الأنسجة لإزالة المياه الزائدة.
   14. تطبيق كمية صغيرة من الغراء على لوحة تقطيع الاهتزاز.
   15. للحصول على شريحة فرس النهر CA1 طولية، قم بإرفاق منطقة CA3 من الحصين بلوحة التقطيع مع الغراء. بسرعة ولكن بعناية وضعه في غرفة تشريح الاهتزاز التي تحتوي على محلول تشريح الأوكسجين المبردة.
   16. للشريحة العرضية التي سوف تكون بمثابة عنصر تحكم، إرفاق نهاية البطين من الحصين إلى لوحة تقطيع الاهتزاز. بسرعة ولكن بعناية وضعه في غرفة تشريح تحتوي على محلول تشريح الأوكسجين المبردة.
       ملاحظة: هذه الخطوة بديل للخطوة أعلاه ويجب تنفيذ بشكل منفصل.
   17. ضع زاوية النصل إلى 90 درجة. تعيين المعلمات الاهتزاز إلى سرعة 0.05 مم / ثانية، سعة 1.20 ملم وسمك شريحة من 400 درجة مئوية.
   18. شريحة الحصين المرفقة مع الاهتزاز.
       ملاحظة: شريحة الدماغ فرس النهر CA1 طولية جيدة سيكون لها طبقة واحدة من CA1 و 2 طبقات من سايروس dentate. يمكن الحصول على 2 شرائح فرس النهر جيدة كحد أقصى. بدلا ً من ذلك، فإن شريحة الدماغ فرس النهر عرضية يكون لها سايروس dentate، CA3 وCA1 المناطق سليمة.
   19. نقل شرائح الدماغ فرس النهر طولية من الاهتزاز مع ماصة واحتضانه في غرفة عقد شريحة الدماغ في حمام الماء.
   20. تحضن شرائح في حمام الماء لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 32 درجة مئوية وتخرج إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة من الانتعاش.
       ملاحظة: بدلا من ذلك، نقل شريحة الدماغ عند الخروج من حمام الماء ووضعها بلطف في غرفة التسجيل مع ACSF المؤكسج المتدفقة في درجة حرارة 32 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة من الانتعاش.
   21. أثناء الحضانة في حمام الماء، صب 400 مل من محلول ACSF في قارورة منفصلة والأكسجين (95٪ O₂/5٪ CO₂₎لمدة 20 - 30 دقيقة تقريبا قبل نقل شريحة الدماغ إلى غرفة التسجيل. يُسكب الـ ACSF باستمرار في غرفة التسجيل بسرعة 2 مل/دقيقة.
   22. تشغيل وحدة تحكم درجة الحرارة لتسخين ACSF المتدفقة إلى 32 درجة مئوية.
   23. تخزين بقية الحل 1.6 لتر في ثلاجة 4 درجة مئوية. الحفاظ على الحل لمدة تصل إلى أسبوع واحد بعد ذلك يجب التخلص منه إذا لم تستخدم لتجنب النمو الفطري.
3. التسجيل في المختبر
   1. إعداد جهاز تسجيل عن طريق تشغيل كافة الأجهزة المطلوبة.
   2. نقل شريحة الدماغ من غرفة عقد شريحة في غرفة التسجيل. ضبط موقف شريحة الدماغ مع ملقط حادة وعقد في مكان مع القيثارة. السماح لACSF لتشغيل لمدة 20 دقيقة على الأقل. وهذا يمكّن شريحة الدماغ من أن تكون مستقرة قبل التسجيل.
   3. ملء ماصة التسجيل مع ACSF كحل داخلي.
   4. تحقق من مقاومة ماصة التسجيل مع البرنامج المعين. يجب أن تكون مقاومة ماصة التسجيل ضمن نطاق 3-5 MΩ.
   5. قم بتشغيل البرنامج للحصول على البيانات. يجب أن يكون هذا البرنامج ميزات مماثلة التي تمكن الحصول على البيانات بطريقة مماثلة للتسجيلات في الجسم الحي هو مبين سابقا.
   6. إصلاح التسجيل وأقطاب التحفيز بحزم في حامل الصك مجسمة. ضع القطب المرجعي في ACSF في غرفة التسجيل.
   7. بالنسبة للشرائح الطولية، ضع قطب التحفيز والتسجيل في الطبقة oriens (S.O.). الحفاظ على المسافة بين الأقطاب الكهربائية إلى حوالي 300 إلى 500 درجة مئوية. وضع القطب تحفيز إما علىالجانب الحاجز أو الزمني من شريحة الدماغ وتسجيل من نفس الطبقة (الشكل 8).
   8. بدلا من ذلك، وضع القطب التحفيز وتسجيل في الطبقة رادياتوم (S.R.). ضع قطب التحفيز إما على الجانب الحاجز أو الزمني لشريحة الدماغ.
   9. بالنسبة للشرائح العرضية كتحكم، ضع القطب المحفز على منطقة CA3 (مسار شافر الجانبي)، وقطب التسجيل على منطقة CA1 (الشكل9).
      ملاحظة: هذه خطوة عنصر تحكم بديل ويجب تنفيذها في تجربة منفصلة.
   10. تشغيل مولد التحفيز معزولة وإعطاء التحفيز (100 ميكروثانية مدة, تتكرر في فترات 30 ثانية). ضبط عمق قطب التسجيل و / أو الموقف حتى يتم ملاحظة مستقرة أثار الإثارة الإثارة الإثارة إمكانات المجال.
   11. تأكد من أن fEPSP مستقرة قد أثيرت من خلال تغيير كثافة التحفيز. وينبغي ملاحظة تغير ملحوظ في منحدر fEPSP مع كل تغيير في كثافة التحفيز. ويسمى هذا منحنى الإدخال والإخراج. إنشاء منحنى الإدخال الإخراج (I-O) للكشف عن الحد الأقصى لكثافة التحفيز الذيلا مزيد من الزيادة في منحدر FEPSP (الشكل 6).
       ملاحظة: تجاهل البيانات وتغيير موضع القطب الكهربائي إذا اختفت الطائرة الألياف أثناء التجربة.
   12. استخدم منحنى الإدخال والإخراج لتعيين شدة التحفيز لتسجيل خط الأساس وللتحفيز العالي التردد (HFS) أو الكزاز إلى 30-40% من الحد الأقصى للfEPSP الذي يثيره.
   13. بدلاً من ذلك، بالنسبة للتجارب المتعلقة بشركة LTD، استخدم منحنى الإدخال والإخراج لتعيين شدة خط الأساس لتسجيل خط الأساس وللتحفيز على التردد المنخفض (LFS) إلى 70% من الحد الأقصى للfEPSP الذي يثيره.
   14. تسجيل إمكانات الحقل المحلي كخط أساس لمدة 20-30 دقيقة.
   15. تطبيق HFS من 100 هرتز البقول مرتين مع فاصل زمني 30 ثانية للحث LTP.
   16. بدلا من ذلك، لتجارب LTD، وتطبيق التحفيز التردد المنخفض من 5 هرتز (900 المحفزات خلال 3 دقائق) أو 1 هرتز LFS (900 المحفزات خلال 15 دقيقة) أو 1 هرتز النبض المقترن (50 مللي ثانية الفاصل الزمني نبض المقترنة، 900 أزواج من المحفزات خلال 15 دقيقة) للحث LTD بالفعل وضع البروتوكول.
   17. تسجيل إمكانات الحقل المحلي لمدة ساعة واحدة بعد HFS أو LFS.
   18. تصدير البيانات وتحليلها.

استكشفنا اللدونة متشابك على المدى الطويل من الخلايا العصبية الهرمية CA1 الطولية من الحصين باستخدام التسجيلات الميدانية خارج الخلية على حد سواء في الجسم الحي وفي المختبر. LTP وLTD هي جوانب من اللدونة متشابك على المدى الطويل التي تم إثباتها في المحور العرضي من الحصين لتكون أحادية الاتجاه.

أظهرنا هنا أنه باستخدام شرائح الدماغ فرس النهر الطولية، هناك LTP في المحور الطولي CA1 من الحصين. أعدنا شرائح طولية من الحصين على طول المحور السبهي الصدغي، الذيهو عمودي على الشرائح العرضية (الشكل 1). باستخدام التسجيلات من منطقة CA1 من الحصين، أظهرنا وجود LTP التي لم تكن محددة الاتجاه. لم تكن هناك اختلافات ذات دلالة إحصائية في التسجيلات من الحاجز أو الزماني (الشكل2)من شريحة الدماغ فرس النهر الطولية. كما أظهرنا وجود LTP التي لم تكن طبقة محددة; وهكذا، أظهرت التسجيلات من كل من الطبقة الراديوتوم وطبقة oriens (الشكل 2) التي تم حثها بنجاح LTP في شريحة الدماغ الطولية. استخدمنا D-AP5، وهو خصم NMDAR لإثبات أن LTP الناجمة عن ذلككان يعتمد على مستقبلات NMDA (الشكل 3). ما يحدث في المختبر لا يعكس بالضرورة في ظروف الجسم الحي، لذلك قمنا بالتحقيق LTP في الجسم الحي. الشكل 4 يظهر رسم تخطيطي للقطب الكهربائي للتحفيز والتسجيل المتمركز في الحصين الظهري على طول المحور الطولي لمنطقة CA1 في الجسم الحي. تم التحقق من موقف الأقطاب الكهربائية المستخدمة للتسجيل والتحفيز من خلال علامات الآفة وتلطيخ البنفسج الكريستال (الشكل4أ). أظهرنا وجود LTP في الجسم الحي في منطقة CA1 الطولية (الشكل4ب).

باستخدام البروتوكولات التي أنشئت بالفعل لتحفيز المحدودة، فشلنا في حثبنجاح المحدودة في كل من الجسم الحي وفي المختبر (الشكل 5).

الشكل 1 . رسم تخطيطي لشرائح الدماغ العرضية والطولية. تم تكييف هذا الرقم وتعديله من Sun et al. 2018²¹. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 . LTP في شرائح طولية. الاستجابات متشابك في S.R. (أ) أو S.O. (ب) في الشرائح الطولية هي قوية مباشرة بعد تحفيز الكزاز مع كل من المدخلات الزمنية والحاجز (S.R./time (n = 12, c), S.R./septal (n = 12, c), S.O./time (n = 10, d), S.O./septal (n = = = = 9، د).
n لتقف على عدد من الشرائح. تمثل أشرطة الخطأ SE. تم تكييف هذا الرقم وتعديله من Sun et al. 2018²¹. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 . LTP تعتمد على NMDAR في شرائح طولية. (أ،ب) يتم حظر تحريض LTP في الاتجاه الزمني والحاجز بمقدار 50 درجة مئوية D-AP5 (الزمني، n = 6، أ) (الحاجز، n = 5، b). (ج،د) كما يتم حظر تحريض LTP في الاتجاه الزمني والحاجز من قبل D-AP5. n لتقف على شرائح. تمثل أشرطة الخطأ SE. تم تكييف هذا الرقم وتعديله من Sun et al. 2018²¹. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4 . في فيفو LTP في شبكة interlamellar. (أ) رسم تخطيطي لتسجيل وحفز الأقطاب الكهربائية في الحيوانات مخدر. تم تحديد موضع التسجيل (على الجانب الحاجز من CA1) وتحفيز الأقطاب الكهربائية (على الجانب الزمني من CA1) من قبل علامات الآفات. (ب) يتم حث LTP في اتصال interlamellar بواسطة 100 هرتز التحفيز عالية التردد (HFS) (ن = 10 الفئران). آثار اللون: قبل (أسود) وبعد (أحمر) HFS. تمثل أشرطة الخطأ SE. تم تكييف هذا الرقم وتعديله من Sun et al. 2018²¹. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5 . غياب في الجسم الحي وفي المختبر المحدودة في شبكة INTERlamellar CA1. (أ) 1 هرتز-ب LFS لا تحفز في الجسم الحي المحدودة (ب) 1 هرتز PP-LTP، (ج) 5 هرتز LFS، و (د) 1 هرتز LFS لا تنتج المحدودة على الجانبين الزمني أو الحاجز من شريحة الدماغ الطولية. في حين أن LTD يتم تحريضها بواسطة 1 هرتز PP-LFS في شرائح عرضية: الزمني (ن = 8)، الحاجز (ن = 11) والعرضية (ن = 6) مع 1 هرتز PP-LFS؛ الزمني (n = 3) والحاجز (n = 3) مع LFS 5 هرتز؛ الزمني (n = 3) والحاجز (n = 3) مع LFS هرتز 1. n لتقف على شرائح. تمثل أشرطة الخطأ SE. تم تكييف هذا الرقم وتعديله من Sun et al. 2018²¹. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6 . منحنى الإدخال والإخراج تقديم منحدر fEPSP استجابة لزيادة مدخلات التحفيز في شريحة الدماغ فرس النهر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7 . الأدوات الجراحية المستخدمة لعزل فرس النهر أثناء تقطيع الدماغ في المختبر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8 . شريحة دماغ طولية جاهزة للتسجيل. يتم إدخال قطب التحفيز وتسجيل الماصة في الطبقة رادياتوم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9 . شريحة دماغ فرس النهر عرضية جاهزة للتسجيل. يتم إدخال قطب التحفيز في منطقة Ca3 الجانبية Schaffer ويتم إدراج تسجيل pippette في منطقة CA1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تركيزات المركبات في شريحة الدماغ وحلول السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي.

يوضح البروتوكول طريقة الحث على اللدونة متشابك على المدى الطويل في الجسم الحي وكذلك من شرائح الدماغ في محور CA1-CA1 الطولية من الحصين في المختبر. الخطوات المبينة تعطي تفاصيل كافية للمُجرِّب للتحقيق في LTP وLTD في اتصال فرس النهر الطولي CA1-CA1. وثمة حاجة إلى ممارسة المهارات اللازمة لتسجيل الإمكانات المحفزة الميدانية بنجاح.

وبالإضافة إلى الحاجة إلى الممارسة، هناك عدة خطوات حاسمة ضرورية لتحقيق نتائج جيدة. أولا، تبين سابقا أن الزاوية التي تم إجراء شرائح الدماغ يمكن إما اقتطاع أو الحفاظ على التوقعات الطولية للخلايا العصبية الهرمية في منطقة CA1-CA1 من الحصين¹⁶. مشروع الخلايا العصبية الهرمية الطولية من الخلايا العصبية العرضية في زاوية عموديتقريبا. كما تنتشر الخلايا العصبية CA1 في زوايا متنوعة داخل الحصين، والربط الطولي بينهما يضع على طول محور الظهر من الحصين. وهكذا، للتسجيل في المختبر، يجب على المجرب أن تبقي هذا في الاعتبار لاستهداف الخلايا العصبية فرس النهر CA1-CA1 بدقة على طول المحور الطولي عن طريق قطع أنسجة الحصين المعزولة على طول محور الظهرية البطني. أيضا، بالنسبة لتسجيلات الجسم الحي، فإن الزاوية التي يتم فيها وضع التحفيز وأقطاب التسجيل تحدد ما إذا كانت النتائج التي تم الحصول عليها تمثل المحور الطولي أو خليط من كل من المحور العرضي والطولي. ويمكن إجراء مزيد من التحقيقات باستخدام CRISPR-Cas9 للتأكد مما إذا كانت الاستجابة التي أثيرت هي فقط من منطقة CA1 لأنها يمكن أن تكون مزيجا من الردود من كل من المناطق CA1 و CA3.

ثانيا، بالنسبة للتجارب المختبرية، يجب على المجرب ضمان أن الحل تقطيع الدماغ، ACSF، مقاعد البدلاء العمل وجميع المعدات أو الأدوات التي تأتي في اتصال مع شريحة الدماغ خالية من الملوثات. أي شكل من أشكال التلوث سيؤدي إلى تدهور سلامة أو موت شريحة الدماغ. الحفاظ على سطح قطب نظيف يضمن تسجيلات جيدة ومستقرة لكل من التجارب في المختبر وفي الجسم الحي.

لقد أظهرنا أن شبكة فرس النهر الطولية CA1 تعرض LTPs تعتمد على NMDAR، ولكن ليس LTDs. الدائرة trisynaptic، ومع ذلك، يعرض مع كل من LTP والمحدودة^22،23. وهذا يعني أن شبكة CA1 الطولية والدوائر ثلاثي ة متشابك لها ميزات فريدة من نوعها. بروتوكولنا يستخدم فقط التسجيلات الكهرولوجية وبالتالي محدودة في العثور على الفرق بين هاتين الشبكتين.

يستمر البحث عن علاج لأمراض الدماغ مثل الفصام. وقد تم ربط انخفاض أو تشوه المناطق دون الإقليمية فرس النهر CA1 مع بعض أعراض الفصام^24,25. وقد أدى تطبيق بروتوكولنا، على الرغم من أنه أساسي، إلى تسليط الضوء على قدرة متشابكة فريدة من نوعها في المنطقة دون الإقليمية الطولية لفرس النهر CA1. هذه المعرفة مفيدة في تصميم التجارب التي يمكن أن تزيد من التحقيق في هذا المرض الدماغ المنهكة على طول محور CA1 طولية من الحصين.

ليس لدينا ما نكشف عنه

وقد دعمت هذا العمل منحة بحثية من جامعة إنتشون الوطنية (التعاونية الدولية). ونود أن نشكر السيدة غونا تشوي على مساعدتها في جمع بعض البيانات.