שליטה אשכול הראשונית תא 3D היברידית ג'ל קוביה התקן עבור תצורות דפוס הדיר

אנו מציגים הליך לשליטה אשכול תא ראשוני הצורה מטריצה חוץ-תאית תלת-ממד כדי לקבל צורה דפוס הדיר. מכשיר מעוקב המכיל שני hydrogels שונים הוא מועסק כדי להשיג הדמיה רב כיוונית עבור צורה דפוס רקמות.

החשיבות של תרבויות 3D במבחנה מודגשת במידה ניכרת בתרבות תא/רקמות. עם זאת, חוסר ניסיוני הדיר הוא אחד את ההגבלות שהיא מטילה. הפקת תוצאות הדיר כמה תבניות מתדרדר הניתוח של המנגנונים הארגון עצמית. הפחתת וריאציה של תנאי התרבות הראשונית צפיפות התאים והפצה מטריצה חוץ-תאית (ECM), חיוני לשפר את הדיר של תרבות תלת-ממד. במאמר זה נדגים הליך פשוט אך חזקים לשליטה הצורה אשכול תא הראשונית מטריצה חוץ-תאית תלת-ממד כדי לקבל תבנית מאוד הדיר תצורות. Micromold לצורה הרצויה היה מפוברק על-ידי שימוש פוטוליתוגרפיה או תהליך עיבוד שבבי, הוא נוצר כיס תלת-ממד ב- ECM הכלול קוביה ג'ל היברידית (HGC). תאים מרוכז ואז הוזרקו בכיס כך הצורה אשכול תא מתאימים עם הצורה עובש מפוברק. HGC מועסקים מותר רב כיוונית סריקה על ידי הסיבוב שלה, שאיפשר דימות ברזולוציה גבוהה ועל לכידתו של המבנה כולו רקמות למרות עדשת הגדלה נמוכה שימש. אדם נורמלי הכיל. תאים אפיתליים הסמפונות שימשו כדי להדגים את המתודולוגיה.

חשיבותה של תרבות 3D, אשר כדאי מחקה סביבות ביולוגי מאשר תרבות 2D, מודגשת במידה ניכרת תא/רקמות תרבות^1,2,3. האינטראקציה בין תאים מטריצה חוץ-תאית (ECM) מספק רמזים חשובים לגבי מורפוגנזה^4,5. תצורות רקמות רבים יכולים לצאת רק תחת סביבות תלת-ממד, כגון תהליך קיפול^6,7, invagination⁸ו מבנה צינורי^9,10. עם זאת, הקשיים למנוע חוקרים הסטה ל ניסויים תלת-ממד של ניסויים 2D בצלחת. אחד הקשיים העיקריים בניסויים 3D הוא הנושא של דגימות 3D הדמיה. לעומת ניסויים מישורי, רכישת תמונות תלת-ממד המתאים הוא עדיין מאתגר במקרים רבים. בפרט, קבלת תמונה תלת-ממדית המתאימה היא משימה קשה כאשר גודל המדגם מגיע הטווח מ מ בשל העומק מוקד גדול של עדשות ההגדלה נמוך. לדוגמה, עומק מוקד מגיע יותר מ 50 מיקרומטר כאשר 10 x עדשת הגדלה בזמן הגודל של התא הבודד הוא בדרך כלל פחות מ- 10 מיקרומטר. כדי לשפר את איכות הדמיה, מפתחים מערכות טכנולוגיה מיקרוסקופ (למשל מיקרוסקופ שני הפוטונים¹¹ ו מערכת מיקרוסקופ אור-גיליון¹²), אבל את זמינותם מוגבל בשל מחירן יקר. כחלופה, פותחו בעבר היברידית ג'ל קוביה (HGC) התקן¹³. המכשיר מורכב משני סוגים של hydrogels: agarose ג'ל תמיכה, ECM כמו קולגן או Matrigel כמו ג'ל תרבות. HGC מאפשר לנו לאסוף את הדגימה במהלך culturing לסובב את הקוביה כדי להשיג הדמיה רב כיוונית, אשר פותר את הבעיה של מוקד עומק¹⁴.

קושי נוסף בניסויים 3D הוא שלהם הדיר נמוכה בשל בקירות וצפיות המסכן סביבות תלת-ממד. בניגוד תרבות מישורי בצלחת פלסטיק, בווריאציות התנאים התרבות הראשונית בקלות להתרחש במרחב תלת-ממדי מוקף בחומר רך. וריאציה משמעותי בתוצאות הניסוי מתדרדר את הניתוח הבא ומסכות המנגנונים המשמשת כבסיס. טכנולוגיות הנדסיות רבות פותחו ליישור במרחב תאים בודדים, כגון^15,bioprinting¹⁶, סיבים אריגה¹⁷, פיגומים¹⁸, אבל הם דורשים preprocessing מורכבים או באופן ספציפי ציוד מעוצב. לעומת זאת, פיתחנו מתודולוגיה להשגת תא 3D יישור HGC¹⁹.

ב פרוטוקול זה, אנחנו מאויר הליך פשוט עם ציוד נפוץ לשליטה הצורה אשכול 3D תא הראשונית HGC. ראשית, הודגם תהליך ייצור HGC. לאחר מכן, micromolds מפוברק על ידי פוטוליתוגרפיה או תהליך עיבוד שבבי יכניסו את HGC לייצר כיס עם צורה שרירותית ב- ECM. לאחר מכן, הוזרקו תאים בעלי צפיפות גבוהה לאחר צנטריפוגה לתוך הכיס כדי לשלוט בצורה אשכול תא הראשונית ב HGC. האשכול התא מבוקרת בדיוק יכול לדימות מכיוונים רבים בגלל HGC. האדם הסמפונות אפיתל (NHBE) תאים נורמליים שימשו כדי להפגין השליטה של הצורה אשכול תא ראשוני והדמיה של הענפים מכיוונים רבים לשיפור איכות הדמיה.

1. ייצור של היברידית ג'ל קוביה התקן

1. להכין מסגרת מעוקב פוליקרבונט (PC) באמצעות תהליך עיבוד שבבי או מדפסת תלת-ממד. הגודל של המסגרת PC תלוי גודל המדגם. במחקר זה, השתמשנו באפשרות מסגרת של 5 מ מ בכל צד כך הענפים היה די שטח כדי להאריך במהלך culturing.
2. להציב את המסגרת PC על שקופית זכוכית טרום מקורר או משטח חלק אחר בתיבה קרח (< 0 ° C) (איור 1 א').
3. להוסיף 12 µL של 1.5% מחומם מראש agarose (w/v) מן הפנים העליון של המסגרת מעוקב המשטח התחתון פיפטה. ללטף את פיפטה כך agarose מתפשט כדי ליצור משטח שטוח (איור 1B).
4. בתוך דקות, agarose תתרפא. לאסוף את המסגרת המחשב על-ידי הזזת אותו לקצה השקופית זכוכית באמצעות פינצטה. שימו לב כי אנכית אוספת את המסגרת של השקופית זכוכית עלולים לגרום של ניתוק של agarose מהמסגרת מעוקב בשל הכוח דבק בין agarose את השקופית זכוכית (איור 1C).
5. סיבוב מסגרת מעוקבים כדי להפוך הפנים פתוח למטה, ולאחר מכן מקם בשקופית זכוכית שוב (איור 1D).
6. חזור על שלבים 1.3-1.5 עד לשלושה משטחים מלאים agarose (איור 1E).
7. כדי ליצור חומה agarose על פניהם הרביעית והחמישית, שחרר את agarose של פנים פתוח (איור 1F). ברגע קיר של agarose נוצרת על פני החמישי, הכנת HGC הושלמה.

2. ייצור של micromolds על ידי פוטוליתוגרפיה או תהליך עיבוד שבבי

1. ייצור על ידי פוטוליתוגרפיה
   1. נקי רקיק צורן (Si) באמצעות שטיפה עם אצטון, אלכוהול איזופרופיל (IPA), ואז (DI) מים מזוקקים למשך 5 דקות. לאחר חנקן נושבת כשהפחד Si עם חנקן, מייבשים בתנור ב 140 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (איור 2 א(א)).
   2. ספין-קואט שכבה ההקרבה כגון לור ו- Az יתנגד על כשהפחד סי (2,000 סל ד, 30 s) באמצעות ספין-coater תחת אור צהוב. מיד לאחר ספין-ציפוי, מחממים את לחם הקודש על פלטה חמה ב 90 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (איור 2 א(ii)). עובי השכבה ההקרבה הרצוי הוא יותר 1 מיקרומטר כך המעלית את התהליך יכול להתבצע בקלות, אבל עובי מדויק. זה לא נחוץ.
   3. למקם את לחם הקודש על פלטה חמה ב- 70 מעלות צלזיוס ולאחר מכן למינציה גיליון עבה photoresist שלילי עם העובי הרצוי בשכבה ההקרבה באמצעות גלגלת יד (איור 2 א(iii))
   4. חמש דקות לאחר רבוד, במקום את לחם הקודש על aligner מסכת חשיפה UV. להגדיר את photomask עם התבנית הרצויה להתנגד גיליון ולחשוף עם אור UV עבור משך הזמן המתאים. זמן החשיפה נקבעת לפי העובי של photoresist לבין עוצמת האור UV. לאחר מכן, למקם את לחם הקודש על פלטה חמה עבור לאפות לאחר חשיפה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, ואחריו אפיה ב 90 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (איור 2 א(iv))
   5. לפתח photoresist שלילי במועט כשהפחד בפרופילן גליקול monomethyl אתר אצטט (PGMEA) עד אזור סמויה היא התפרקה לחלוטין (כ- 20 דקות) (איור 2 א(v)).
   6. להמיס את שכבת ההקרבה באמצעות IPA עבור שטיפה כדי להמריא את מיקרו. פעם אחת מיקרו קולפה מ כשהפחד, לשטוף עם מים DI על ידי שטיפה-10 דקות (איור 2 א(vi)).
   7. לטבול את התבנית ב 30 µL של הפולימר MPC למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (כ 20 ° C) להתייבש לחלוטין זה. איור 2B מראה כייר פריזמה מפוברק.
2. ייצור של תבנית גליל
   1. לפברק תבנית גליל פלדה עם הגודל הרצוי על ידי תהליך עיבוד שבבי. לחלופין, השתמש זמינים מסחרית פלדת אל-חלד. (במחקר זה, צילינדר מיקרומטר 600 φ משמש).
   2. לטבול את גליל פלדה 30 µL של הפולימר MPC למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (כ 20 ° C) להתייבש לחלוטין זה.
   3. הכן polydimethylsiloxane נוזלי (PDMS) על ידי ערבוב בסיס שרף הזרז (ראה טבלה של חומרים) על יחס 10:1 ואחריו degassing עם ואקום degassing מערכת עבור 20 דקות. לאחר מכן שופכים את PDMS בצלחת 12-. טוב.
   4. הגדר גליל פלדה בניצב לשטח נתון וקבוע לשלב-z ליניארי כך זה יכול להיות מוכנס בניצב השטח PDMS משומרים בתוך 12-ובכן-צלחת מניחים על פני השטח של דנון אותו על-ידי הזזת z-הבמה. דגירה של PDMS עם פלדה גליל בתנור למשך 20 דקות ב 90 מעלות צלזיוס לריפוי. חותכים את PDMS כדי ליצור משטח האגף כך pipet יכול להיות מוכנס בתהליך הבא (איור 2C).

3. שליטה הצורה אשכול תא הראשונית הידרוג

1. להזריק ECM המתאים עבור התרבות התא הרצוי, כגון קולגן, קרום המרתף מלאכותי, לתוך HGC כדי למלא את החלל תרבות (איור 3 א).
2. להגדיר את micromold מפוברק HGC במישרין או בעקיפין עם מחזיק המתאים, כפי שמוצג באיור 3B. לאחר מכן, מקם את HGC חממה₂ CO במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לריפוי זה.
3. הרם בזהירות החוצה micromold כך ה-ECM לא יתדרדר (איור 3C). הכיס, של הצורה הרצויה עובש, להיות מפוברק ב- ECM.
4. קציר תאים מן המנה בתרבית על ידי טריפסין-EDTA או שווה ערך בהתאם סוגי תאים. לאחר מכן, centrifuge את התאים כדי להשיג את התאים מרוכז (לתרבות NHBE, להחיל 0.25% טריפסין-EDTA, דגירה תאים עבור 3 דקות, לאחר מכן לנטרל עם FBS המכילות בינוני, צריך שתוציאו ב x 300 גרם במשך 4 דקות).
5. לאחר צריך שתוציאו, להסיר את המדיום supernatant לתמצת את התאים, מזריקים תאים מרוכז (3.0 × 10⁴ תאים/µL עבור תאים NHBE) לתוך הכיס ב ה-ECM (דמות תלת-ממד).
6. דגירה של HGC עם תאים חממה₂ CO כעשרים דקות ב 37 ° C כך התאים ליפול לתוך הכיס ECM כדי למלא את החלל שנוצר על-ידי micromolds. אם בינוני מוגזמת או תאים קיימים על המשטח העליון, הסר בזהירות בעזרת פיפטה.
7. למקם את HGC על צלחת 24-ובכן, להוסיף 100 µL של המדיום המתאים (איור 3E). עבור תאים NHBE, השתמש תערובת 1:1 של בינוני מיוחדים זמינים מסחרית עבור NHBE ותאי אנדותל (ראה טבלה של חומרים).
8. להזריק ECM נוספים כדי לסגור את הכיס ב- ECM ולאחר מכן דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות.
9. לקרר טרופה agarose 1.5% לטמפרטורת החדר (כ 20 ° C). ירידה בערך 10 µL של agarose על גבי המשטח העליון של HGC סגירת השטח ולמנוע את ECM מנפילה מתוך HGC במהלך culturing והדמיה (איור 3F). לאחר מכן, דגירה HGC עוד כעשרים דקות ב 37 ° C כדי לרפא את agarose.
10. הוסף בינוני כדי לכסות את HGC כל כך לחץ אוסמוטי יכול לסייע במתן תזונה על התאים בתוך HGC.

4. רב כיוונית הדמיה

1. זיהוי לא פולשנית צורה תלת ממדית על-ידי צפייה רב כיווניות.
   1. למקם את תרבות מאכל או צלחת טוב המכיל את HGC-מיקרוסקופ, אוריינט את HGC למסגרת המצלמה. לאחר מכן, להשיג תמונה לדוגמה לעומת שדה או שלב בהיר.
   2. לאסוף וסובב את HGC להציב משטח שונה למטה.
   3. חזור על שלבים 4.1.1 ו 4.1.2 עד תמונות מכל הצדדים 6 מתקבלים.
2. חיסונית-פלורסנט הדמיה באמצעות התבוננות רב כיוונית
   1. עבור קיבוע, חלות paraformaldehyde 4% המדגם מעל HGC בטמפרטורת החדר (כ 20 ° C) במשך 20 דקות, ואחריו שתי שטיפות של PBS למשך 10 דקות.
   2. Permeabilize את HGC עם PBS המכילה 0.5% טריטון X-100 10 דקות ב 4 ° C, אז תרחץ 3 x 10 דקות עם PBS.
   3. דגירה של HGC עם 10% סרום עז במאגר-אם (0.2% טריטון X-100, אלבומין שור 0.1% ו- 0.05% Tween-20 ב- PBS) עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר במשך צעד חסימת העיקרי.
   4. עבור צביעה של מולקולה מסוימת, השתמש הנוגדן המתאים. כדי לבחון את הגיאומטריה תא קולקטיבית, אלקסה עבור חיל הים 488 Phalloidin יכול לשמש כתם אקטין.
   5. מניחים את HGC על צלחת תחתית זכוכית תחת מיקרוסקופ לייזר או פלורסנט ולבצע סריקה מתוך ששת הצדדים כדי לקבל את תמונת מדגם כולו.

האדם הסמפונות אפיתל (NHBE) תאים נורמליים שימשו כדי להדגים את המתודולוגיה מאויר ולשלוט הגיאומטריה תא קולקטיבית הראשונית כדי להשיג את צורת גליל צורה פריזמה, בהתאמה בסביבה ECM. רב כיוונית הדמיה התוצאות המתקבלות על ידי ניגודיות שלב, כמו גם phalloidin מכתים של צורת גליל (איור 4AB), הצורה פריזמה (איור 4CD) מוצגים. התאים מיושרים כראוי להניב הצורה התלת-ממדית הרצויה בסביבת ECM. לאחר מכן, התאים היו בתרבית במשך ארבעה ימים ליצור צורה מסוימת, ואז נותחו על ידי הדמיה רב כיוונית. גודל המדגם גדול עושה את זה די קשה כדי ללכוד את התמונה כולה רקמות מכיוון אחד; אולם, HGC מותר הדמיה עד שישה צדדים, חושף את הצורה כל רקמות. איור 5 מראה את התוצאות immunostaining של עץ הסמפונות פיתח את התאים NHBE. התאים NHBE נשלטו בתחילה כדי בצורת גליל ב- HGC. לאחר מכן, רוב הענפים היו מכוונת בניצב לציר גלילי.

איור 1: תהליך ייצור של היברידית ג'ל קוביה התקן. (א) במסגרת מעוקב פוליקרבונט מוגדר על קופסת הקרח precooled. Agarose (B) (1.5%) מוזרק כדי לכסות את המשטח התחתון. (ג) הקוביה היא החליקה להיות שנאספו. (ד) הקוביה מסובבים את לעשות משטח אחר למטה. (E) Agarose (1.5%) מוזרק כדי ליצור קיר agarose נוסף. (F) לאחר שלוש פנים המופק קיר של agarose, agarose מוזרק דרך פנים פתוח. סרגל קנה מידה: 5 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: תהליך ייצור של micromolds. (א) ייצור תהליך של micromold מאת פוטוליתוגרפיה. (B) בצורה מלאה של micromold צורה פריזמה מפוברק על ידי פוטוליתוגרפיה. (ג) המציא micromold עם גליל פלדה. סרגל קנה מידה: (B) 2 מ מ, (ג) 10 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: תהליך ייצור השליטה באשכול הראשוני תא. ECM (A) (למשל, קולגן ו- Matrigel) מוזרק HGC. (B) micromold שוכן על המסגרת מעוקב עם או בלי בעל. (ג) לאחר ה ECM נרפאה, מוסר את micromold. (ד) לאחר צריך שתוציאו, בעלי צפיפות גבוהה תאים מוזרק, מתפשט. בינוני (E) מוחל. ECM נוספים (F), ואחריו agarose מוזרקים כדי לכסות את המשטח העליון של HGC. סרגל קנה מידה: 5 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: תוצאות תא הראשונית של שליטה עם תאים NHBE. (א) תמונות בניגודיות שלב של התאים NHBE cylindrically מבוקרת שנדרשו עבור המשטח התחתון, לרוחב. . עלולים לזהות את כל הצורה באמצעות התבוננות רב כיוונית ללא צורך הדמיה פלורסנט. (B) זריחה תמונות של התאים NHBE cylindrically מבוקרת צביעת F-אקטין. (ג) שלב חדות תמונות של NHBE תאי מבוקר בצורת מנסרה משולשת שנלכד על משטחים התחתון ולא לרוחב. (ד) זריחה תמונות של התאים NHBE נשלט בצורת מנסרה משולשת. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. 10 x עדשת הגדלה (מפתח נומרי 0.3) שימש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5: מוקרן פלורסנט תמונות שנלכדו סריקה רב כיוונית. התאים NHBE היו בתחילה מבוקר כדי לייצר בצורת גליל, תרבותי ב HGC ארבעה ימים. לאחר מכן, אקטין הוכתם phalloidin. הענפים היו מוארך מן הגליל הראשונית לאורך ציר x, אורך, בגודל זווית הציר פותחו באותה מידה. תמונה מימין התחתון מציג שתתמודדו הציר x-y-z וגם צורת הדגימה. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. נעשה שימוש של 10 x עדשת הגדלה (מפתח נומרי 0.3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

השיטה המובאת בעיתון הזה הוא פשוט, יכול להתבצע ללא ציוד טכנולוגיה. במקביל, ניתן להשיג תוצאה שליטה צורה של אשכול תא מדויק במרחב תלת-ממדי של הידרוג. לאחר הפקד הראשונית, התאים יכולים לגדול ב- HGC עד כמה הם בתרבית על צלחת. ההדמיה רב כיוונית מתבצע על ידי סיבוב הדגימה עם HGC באמצעות כל מערכת מיקרוסקופ, מגבירה באופן משמעותי את איכות הדמיה. הבחירה של החומרים עבור מסגרת HGC ו- micromold הוא גמיש, כל עוד הם מסתיימים. מדפסת תלת-ממד עשוי לשמש כדי לייצר את המסגרת HGC או micromold אם הדיוק של המדפסת 3D מספיקה על היישומים שלהם. השיטה המוצעת הוא תואם עם תמונות רבות שיפור טכנולוגיות כגון שקיפות ריאגנטים^20,21 גיליונות אור מיקרוסקופ ומערכות. על ידי שימוש בטכנולוגיות אלה, ניתן לשפר את איכות התמונה.

עוצמת הקול של agarose, ECM, תאים בעלי צפיפות גבוהה כדי להיות מוזרק תלויה בגודל HGC ועובש. פעולה ידנית של זהיר לא מזריקות בועות אוויר נדרש, אחרת הבועות נוצר יחריף את הדיוק של שליטה, צמיחת תאים, איכות הדמיה.

תהליך ייצור micromolds ייקבע על ידי לצורה הרצויה כדי לשלוט. פוטוליתוגרפיה מאפשר ייצור של צורות דו-ממדיות מדויק עם עומק מסוים, כגון צורה פריזמה הסדר מיקרומטר; עם זאת, היא לא יעילה עם צורות תלת-ממד, כגון גליל... תהליך עיבוד שבבי מאפשר לנו לפברק הצורה התלת-ממדית, אך באופן כללי, הדיוק תלת-ממדי הוא נמוך יותר מאשר פוטוליתוגרפיה. לאחר ייצור של micromolds, ציפוי של הפולימר phosphorylcholine (MPC) 2-methacryloyloxyethyl התבניות נדרשת כדי למנוע הידבקות ב- ECM.

על-ידי ניצול HGC, ניתן לבצע הדמיה מיקרוסקופיים עם או בלי חשיפה ללייזר בכיוונים מרובים. צורת הדגימה 3D יכול כ יזוהו על-ידי התבוננות רב כיוונית ללא תיוג פלורסנט; שיטה זו אינה גורמת כל invasiveness תא במהלך התצפית. לעומת זאת, הדמיה פלורסנט נדרש לקבלת צורה מדויקת יותר מדגם התלת-ממד וביטוי מולקולרית.

האילוץ של השיטה הציג לבקרת תא הראשונית היא כי זה לא ניתן להחיל תבנית עם צורה תלת-ממדית מורכבת. העובש יש להסירו ע י הרמת ללא מתדרדר ECM. לפיכך, כייר מוגבל על צורה פשוטה של ישרים או מחודדות. כדי להשיג שליטה צורה מורכבת יותר, בהמשך פיתוח של הפרוטוקול נדרשת.

המתודולוגיה המוצעת יש כלי רחב והוא יכול להתבצע בקלות במרבית סביבות מעבדה. נוהל פשוט זה יכול להתגבר על המגבלות של תרבות 3D הדמיה, הדיר, לתרום להמשך פיתוח נדרש לתרבות תלת-ממד.

המחברים ו אוסקה פריפקטורה של אוניברסיטת קיושו מכון טכנולוגי הגישו בקשה לרישום פטנט היברידית ג'ל קוביה המכשיר, ואת ניפון רפואי, מכשירים כימי ושות' בע מ, יפן יש לאחרונה ממוסחר הקוביה. החברה לא השפיע על כל של עיצוב, תהליך, בשיטות המתוארות.

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי JSPS KAKENHI (18H 04765) ואת התוכנית להפצת מערכת מעקב אחר הקביעות, MEXT, יפן.