כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מודל אנושי העכבר chimeric הכבד של היפרכולסטרולמיה משפחתית באמצעות hepatocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה אנושי. זהו מודל ערך בדיקה טיפולים חדשים עבור היפרכולסטרולמיה.

היפרכולסטרולמיה משפחתית (FH) נגרמת בעיקר על ידי מוטציות קולטן (LDLR) ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה ותוצאות סיכון מוגבר למחלות לב וכלי דם התפתחות מוקדמת עקב העלאת מסומן של כולסטרול LDL (LDL-C) בדם. סטטינים הן הקו הראשון של התרופות להורדת שומנים בדם לטיפול FH וסוגים אחרים של היפרכולסטרולמיה, אבל גישות חדשות מתגלים, בנוגדנים PCSK9 מסוים, כעת נבדקות בניסויים קליניים. לחקור את רומן גישות טיפוליות עבור FH, תרופות חדשות או ניסוחים חדשים, אנחנו צריכים מתאים ויוו מודלים. עם זאת, הבדלים פרופילי השומנים מטבולית לעומת בני אדם הם בעיה מפתח של מודלים בבעלי חיים הזמינים של FH. כדי לטפל בבעיה זו, יש לנו שנוצר דגם העכבר chimeric הכבד האנושי באמצעות תאי גזע pluripotent FH המושרה (iPSC)-נגזר hepatocytes (iHeps). השתמשנו עכברים/Ldlr^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (LRG) כדי למנוע דחיית החיסון של התאים המושתלים של האדם וכדי להעריך את ההשפעה של LDLR-iHeps חסר ב- LDLR null רקע. IHeps FH המושתלים יכול לאכלס 5-10% של הכבד העכבר LRG בהתבסס על אנושי אלבומין מכתים. יתר על כן, iHeps engrafted הגיב לתרופות להורדת שומנים בדם, recapitulated תצפיות קליניות של יעילות מוגברת של נוגדנים PCSK9 בהשוואה סטטינים. המודל chimeric הכבד האנושי שלנו ובכך יכול להיות שימושי לניסויים פרה של טיפולים חדשים כדי FH. שימוש באותו פרוטוקול, דומה עכברים chimeric הכבד האנושי FH וריאציות גנטיות אחרות, או מוטציות המתאימים למחלות כבד בירושה, ייתכן גם שיופקו.

קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDLR) לוכדת LDL הכולסטרול (LDL-C) בדם לווסת סינתזה כולסטרול בכבד. מוטציות בגן LDLR הם הגורם השכיח ביותר של היפרכולסטרולמיה משפחתית (FH)¹. סטטינים היו באופן מסורתי השורה הראשונה של תרופות לטיפול FH וסוגים אחרים של היפרכולסטרולמיה (תורשתית או נרכש). סטטינים מעכבים 3-הידרוקסי-3-methylglutaryl-קואנזים רדוקטאז להורדת כולסטרול סינתזה בכבד². בנוסף, סטטינים להגביר את רמות LDLR על פני hepatocyte לקדם פלזמה סיווג LDL-C. אולם, אזהרה העיקריים של הטיפול עם סטטינים היא כי הם בו זמנית זירוז הביטוי של proprotein convertase סבטיליזין/hexin 9 (PCSK9), אנזים זה נקשר LDLR לקדם השפלה³. אפקט זה הוא אחראי על התגובה לא מספיקות או אפילו null סטטינים אצל חולים רבים. לומד מנגנון זה, באופן בלתי צפוי, הוביל הגילוי של דרך חלופית לטיפול היפרכולסטרולמיה. נוגדנים PCSK9 לאחרונה אושרה על ידי ה-FDA כרגע בשימוש במחקרים קליניים ולהראות יעילות גבוהה וסובלנות טוב יותר מאשר סטטינים⁴. ההצלחה של נוגדנים PCSK9 מרמזת כי ייתכן אפשרויות טיפוליות אחרות לווסת את המעבר השפלה LDLR (חוץ PCSK9) בחולים עם היפרכולסטרולמיה. באופן דומה, יש עניין בפיתוח מעכבי החדש של PCSK9 שאינם נוגדנים, לדוגמה, siRNA oligos⁵.

כדי לבדוק טיפולים חדשים עבור FH וסוג באופן כללי אחרים של היפרכולסטרולמיה, מודלים המתאימים ויוו נחוצים. אחת הבעיות המרכזיות של הנוכחי אין ויוו מודלים, בעיקר עכברים⁶ , ארנבונים⁷, הבדלים פיזיולוגיים שלהם עם בני אדם. ויותר חשוב, בעיות אלה כוללות פרופיל מטבולי שונה השומנים. הדור של חיות chimeric הכבד האנושי⁸ עשוי לעזור להתגבר על זה אזהרה. העכבר chimeric הכבד האנושי הוא סוג של עכבר "humanized" בכבד אוכלס מחדש עם hepatocytes אנושי, לדוגמה, hepatocytes אנושי ראשוני (pHH)⁹. בעיה עם pHH היא שהם לא יכולים להיות מורחב vivo לשעבר, במהירות לאבד את תפקידם על בידוד, והם מקור מוגבל. אלטרנטיבה pHH הוא השימוש בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSC)-נגזר hepatocytes (iHeps)¹⁰. ראוי לציין, iPSCs החולה הספציפי, ניתן לגדל ללא הגבלת זמן, כך iHeps יכול להיות מיוצר לפי דרישה, המהווה יתרון משמעותי על פני pHH טריים. יתר על כן, iPSCs יכול גם להיות בקלות מהונדסים גנטית עם מעצבים nucleases לתיקון או להציג מוטציות בגן רקע isogenic כדי לאפשר השוואות נאמן יותר¹¹.

עכבר chimeric הכבד האנושי עם engrafted pHH להראות דמיון לבני פרופילים מטבולי בכבד, תגובות סמים, ואת הרגישות זיהום וירוס הפטיטיס¹². זה הופך אותם מודל לימודים היפרליפידמיה ויוו. הדגמים העכבר הנפוצה ביותר מבוססים על/Fah^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (FRG) העכבר¹³ ו את uPA העכבר הטרנסגניים⁸, באיזה עד 95% של העכבר הכבד יכולים להיות מוחלפים על-ידי pHH. מעניין, דו ח זה התבצעה תיאר אדם FH כבד chimeric (מבוסס על העכבר FRG) עם העכבר pHH מחולה נושא מוטציה LDLR homozygous¹⁴. במודל זה, hepatocytes האנושי הנידונה לא LDLR פונקציונלי, אבל hepatocytes העכבר שיורית, ובכך להקטין את תוכנית השירות לביצוע ויוו בדיקות סמים להסתמך על מסלול LDLR.

כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט המבוסס על שלנו העבודה שפורסמו לאחרונה¹⁵ עבור engrafting FH iHeps לתוך הכבד העכבר/Ldlr^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (LRG). העכבר chimeric הכבד האנושי הזה הוא שימושי עבור מידול FH וביצוע בדיקות סמים ויוו.

כל השיטות המתוארות כאן המערבות את השימוש בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה על שימוש של לחיות חיות מחקר (CULATR) של אוניברסיטת הונג קונג והוראה.

1. עכבר הכנה ובדיקה פנוטיפי

1. דור של עכברים knockout (KO) ' Ldlr immunodeficient '.
   1. השתמש עכברים זנים Ldlr^{- / -}, Rag2^{- / -}, Il2rg^{- / -} (ראה טבלה של חומרים).
   2. לחצות Rag2^{- / -} עכברים עם עכברים^{- / -} Il2rgכדי ליצור Rag2^{- / -}/ עכברים^{- / -} Il2rg, לאחר מכן לעבור Ldlr^{- / -} עכברים עם Rag2^{- / -} / Il2rg^{- / -} עכברים ליצירת עכברים/Ldlr^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (LRG)¹⁵. בגיל 3-4 שבועות, לאסוף DNA גנומי האוזן כדי לקבוע את גנוטיפ מאת PCR ורצף.
   3. בגיל 8-12 שבועות, להשתמש עכברים LRG זכר הנמענים עבור iHeps כדי ליצור אנושי בכבד עכברים chimeric.
2. להאכיל את העכברים עם דיאטה עתירת שומן וכולסטרול גבוה (HFHC) 7 ימים לפני השתלת iHep כדי לעזור להם לפתח היפרכולסטרולמיה.
3. כדי לגרום פגיעה בכבד, המקל על ההתפשטות של iHeps engrafted בכבד, למקם את העכברים לתוך מכולה סטרילי, להאיר אותם באמצעות בעוצמה גאמא γ-קרני במינון של 3 Gy 24 שעןת לפני engraftment. לאחר מכן, להחזיר את העכברים לכלובים דיור. מצב תקין של עכברים לקרינה אלה יכולים לפקח על ידי מדידת המשקל שלהם.  עכברים עם ירידה במשקל 20% או יותר להרדימם.

2. iHep בידול, דיסוציאציה

LDLR KO משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים (+ /-) homozygous KO (- / -.) iPSCs האנושי, או המטופל FH-iPSCs עם משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים מוטציות בגן LDLR (FH iPSCs) משמשים כדי לייצר iHeps. הדור של LDLR + /- או- / - iPSCs FH iPSCs מתואר הדוח הקודם שלנו¹⁵.

1. הבידול בבימויו של iPSCs לתוך iHeps
   הערה: השיטה עבור הבידול של האדם iPSCs לתוך iHeps ששינה מן הדוח הקודם¹⁶.
   1. שלושה ימים לפני בידול (יום-3), זרע iPSCs על גבי מטריצה חוץ-תאית מצופה לוחות 6-טוב (ראה טבלה של חומרים)-צפיפות של 300,000 תאים/טוב ב- 1.5 מ ל (גם להלן) של iPSC האנושי תחזוקה בינוני (ראה טבלה של חומרים ) בתוספת 5 מיקרומטר רוק מעכב (Y27632). התרבות התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה humidified CO₂ 5%. בדרך כלל, iHeps מצלחת 6-ובכן מספיקים engraft עכברים 5.
   2. כעבור 24 שעות (יום-2) 48 שעות מאוחר יותר (יום-1), לשנות את המדיום לבינונית תחזוקה iPSC אנושי טרי ללא רוק מעכב.
      הערה: iPSCs לפני בידול צריך לבטא רמות גבוהות של OCT4 ו NANOG, אשר יכולים להיבדק על ידי RT-PCR כמותי, immunofluorescence או cytometry זרימה.
   3. יום 0 של בידול, לשטוף את התאים עם RPMI 1640 פעם אחת ולאחר מכן להוסיף RPMI 1640 בתוספת 100 ננוגרם למ"ל Activin A ו- 25 ננוגרם למ"ל WNT3a.
   4. יום 1, יום 2 של בידול, לשנות את המדיום עבור RPMI 1640 בתוספת 100 ננוגרם למ"ל Activin א
      הערה: אם יש יותר מדי מוות של תאים בשלב זה (יום 0-3), ניתן להוסיף עד 0.5% סרום שור עוברית (FBS) המדיום כדי לשפר את יכולת הקיום התא. עם זאת, אנו מציעים בדיקות את כמות מינימלית של FBS שיתווספו עבור כל קו iPSC ספציפיים, כפי FBS עודף יכול להשפיע גם הבידול.
   5. יום 3, לשטוף את התאים עם DMEM פעם אחת ולאחר מכן לעבור למדיום 2^nd הבמה (החלפת סרום 20% חומצות אמינו שאינן הכרחיות x 1, 2 מ'-גלוטמין, 0.1 M בטא-mercaptoethanol, 1% דימתיל סולפוקסיד DMEM בינוני). לשנות את המדיום בכל יום עד ליום 10.
      הערה: ביום 7, התאים צריכים הגיעו למפגש וקצוות תצוגה ברורה. אולי יש כמה אזורים מובחן המופיעים בשלב זה; להתעלם מהן אם האחוז של אזורים אלה הוא קטן. אם האחוז גבוה, להפחית את המפגש של iPSCs ביום 0 ולהפחית את כמות FBS המשמשים את השלב הראשון של בידול.
   6. יום 10, לשטוף את התאים הבזליים בינונית hepatocyte פעם אחת ולאחר מכן לעבור לבינונית תרבות hepatocyte בתוספת 20 ng/mL האנושי הכבד גורם גדילה, oncostatin ng/mL 20 מ' כדי לקדם את ההבשלה iHep. לשנות את המדיום בכל יום אחר.
      הערה: בשלב זה, > 90% של התאים צריכים להיות חיוביים עבור HNF4A, לפי immunofluorescence מכתים או לזרום cytometry.
   7. ב יום 15 – 17, התאים הם מוכנים engraftment. לחלופין, תגובת שיקוע של התרבות תאים עשויים להיות נאספים ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס אורגנים של אלבומין המופרש (ALB) על ידי iHeps.
      הערה: בשלב זה, > 80% iHeps צריכים להיות חיוביים עבור HNF4A, ALB α1 אנטיטריפסין (AAT) על פי immunofluorescence מכתים. בסביבות 60-70% iHeps 17 יום צריכים להיות חיוביים עבור ASGPR, כפי שמוצג על ידי cytometry זרימה. בידיים שלנו, iHeps בתקופה זו יש יכולת אופטימלית לשקם את הכבד העכבר; iHeps להפריש רמות גבוהות יותר של הפריה ALB אך גם להיות senescent אם engraftment מתעכבת.
2. דיסוציאציה וטעינה של iHeps לתוך מזרק אינסולין
   1. הכן את הנדרש ריאגנטים וחומרים:
      1. 24 שעןת לפני engraftment, להפשיר את הכמות הנדרשת (V = 40 µL * מספר עכברים) של מטריצה חוץ-תאית, קרח בחדר קר, ולאחר להכניס את המזרק אינסולין וקופסת טיפים µL 200 מקרר 4 ° C.
      2. שעה אחת לפני engraftment, חמים האנזים דיסוציאציה תא בתוספת 50 µg/mL DNase אני לטמפרטורת החדר ומניחים המדיום RPMI 1640 בתוספת 20% החלפת סרום על קרח.
   2. קח שלב תמונות בניגודיות (100 X ו- 200 X) של iHeps כדי להקליט את מעמדם, כולל תא מורפולוגיה, צמיחה של צפיפות התאים.
   3. לשטוף iHeps עם 2 מ"ל/טוב של טמפרטורת החדר Ca^{2 +} ו- Mg^{2 +}-חינם PBS פעמיים, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של האנזים דיסוציאציה תא בתוספת 50 µg/mL DNase אני כדי מכל קידוח. לשים את התאים בחזרה לתוך החממה למשך 8-10 דקות.
      הערה: כדי לשפר את התא דיסוציאציה עם תא דיסוציאציה אנזים, לשטוף את התאים עם Ca^{2 +} ו- Mg^{2 +}-PBS חינם. כדי למקסם את הכדאיות תא, אנו מציעים בריא וולס לא יותר מ-6 לכל אצווה בכל פעם. יתר על כן, אנו מציעים הגבלת הטיפול אנזים תא דיסוציאציה פחות מ-10 דקות.
   4. לפקח על מורפולוגיה תאים במיקרוסקופ. כאשר רוב התאים הופכים עגול, להוסיף אמצעי שווה של 1640 RPMI קר, בתוספת 20% סרום החלפת כל טוב, pipette את התאים בעדינות כדי לנתק מהצלחת, להעביר התליה תא צינור 15 מ"ל.
      הערה: השלב זה קריטי לגבי הכדאיות של תאים שנקטפו. אם התאים נמצאים קשה להתנתק מן הצלחת, זה לא משנה אם חלק מהתאים נשארו. אם התאים לנתק כמו ריבועים גדולים של טפט, ואז פיפטה בעדינות לאחר צנטריפוגה כדי לקבל השעיה תא בודד.
   5. חזור על שלב 2.2.4 עבור כל טוב עד כמעט כולו מחובר התאים נאספים. צנטריפוגה ב x 200 גרם עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס.
   6. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend תאים עם 2 מ של PBS קר צינור 15 מ"ל. Pipette התאים בעדינות כדי לקבל השעיה תא בודד ולאחר מכן להוסיף PBS קר נפח סופי של 1 מ"ל * מספר בארות חלופה מועדפת. לבסוף, עוברים את התאים דרך מסננת תא 40 µm להוציא אגרגטים.
      הערה: בדרך כלל 1-2 x 10⁶ תאים/טוב ניתן לקצור לאחר סינון.
   7. Aliquot 20 µL של התא ההשעיה להוסיף 20 µL של 0.4% trypan blue פתרון, ואז לספור את התאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטיות, להקליט את הריכוז של הבולם תא כמו "C". לחשב את אמצעי האחסון הדרושים (V1 = [10⁶ * (n + 1)] / C, כאשר n הוא המספר של עכברים כדי להיות engrafted) של התא השעיה (1 מיליון/עכבר) להזרקה intrasplenic.
   8. Aliquot הנפח הנדרש של תא ההשעיה לתוך צינורות 15 מ"ל, צנטריפוגה ב x 200 גרם עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס.
   9. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תאי האחסון המתאים ל- PBS קר כדי להפוך את הנפח של התא ההשעיה (n + 1) * 55/2 µL (n = מספר עכברים), ולאחר מכן להוסיף אמצעי שווה של מטריצה חוץ-תאית כדי להפוך את הנפח הסופי של תא ההשעיה (n + 1) * 55 µL.
   10. למקם את המזרק אינסולין קר על קרח, נתק את הבוכנה, להעביר µL 55 של השעיה תא לתוך המזרק, ואז להחזיר את הבוכנה. הפרשות בועות בקפידה ולשים את המזרק אחורה על קרח.
   11. חזור 2.3.10 עד מזרקים כל שנטענו עם התאים. תארגן את הדברים. אתה מוכן להזרקה.
       הערה: כדי להגדיל את יכולת הקיום תא, מומלץ להשאיר את התאים על הקרח לאחר דיסוציאציה. 2.2.4–2.2.11 השלבים לעיל, ודא כל ריאגנטים נשמרים 2-8 ° C לפני השימוש.

3. intrasplenic הזרקה של iHeps

1. עזים ומתנגד העכברים עם קטמין (100 מ ג/ק ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג) מוזרק intraperitoneally. לשים משחה הוטרינר על עכברים עיניים למניעת יובש במהלך ההליך בהרדמה, לנטר את הרפלקסים השריר שלהם כדי לבחון ההשפעה של ההרדמה והערכת הכאב.
2. ברגע עכברים איבדו רפלקס גירוי השריר, למקם אותם הנכונה למקם חמצן לרוחב. חלות שכבה עבה של קרם depilatory באזור החתך לאגף השמאלי עבור 5-8 דקות. לאחר מכן, הסר את קרם depilatory והשיער שתמחקי את האזור עם פד גזה לחלח במים.
3. לקרצף את האגף השמאלי עם povidone יוד או, לחלופין, עם אתנול 70% 3 פעמים ואחריה טבילה סופית עם povidone יוד לחיטוי.
4. ב- cabinet רמה 2 אבטחה, אתר את המיקום של הטחול, אשר ניתן לאבחן בצורה שקופה, האגף השמאלי ולאחר מכן פצעים וחתכים בעור של דופן הבטן של 0.5-1 ס מ. Exteriorize הטחול על-ידי הוצאת את רקמת שומן בעדינות ליד אותו באמצעות מחודד . מלקחיים. ייצוב הטחול באמצעות מקלון בעדינות.
5. להכניס את המחט של המזרק אינסולין 3 – 4 מ parenchyma של הטחול ולהזריק כ 50 µL תא השעיה בעדינות. . משכי את המחט ולמקם ספוגית כותנה על ההזרקה 1 דקה כדי למנוע דימום, דליפה של חומר.
6. לחזור הטחול הצפק ולסגור את הפצע עם התפרים ניילון 5-0. לאחר מכן, שמור עכברים קאמרית/חממה חמה עבור h 3-16 כדי להחזיר אותם לטמפרטורת הגוף נורמלי שלהם וכדי להחיות אותם. עכברים אשר עברו ניתוח אינם מוחזרים על החברה של בעלי חיים אחרים עד החלים לחלוטין.
7. להוסיף meloxicam (26 μg/mL) למים ולהזריק. הבופרנורפין (50 μg/kg) intramuscularly בתרופות אנטי-דלקתיות, שיכוך כאב, בהתאמה. צג כירורגי פצעים מדי יום כדי למנוע דלקת כלשהי.
   הערה: ודא כל הכלים, הציוד בשימוש שלבים 4-7 סטרילי.

4. בדיקת רמת ה-LDL-C פלזמה

1. Engraftment שלאחר ימים 0, 7, 14, 21, 28, לרסן את העכברים LRG בחוזקה כדי למזער את צד לצד תנועת הראש בשיטת מגבילות בשתי ידיים, ואז לנקב את הווריד פנים באמצעות אזמל המנתחים. הדם יתחיל לזרום לאחר הסרת lancet. לאסוף בסביבות 50 µL של דם לתוך צינורות 1.5 mL המכיל 1 µL של EDTA.
   הערה: אם האחיזה הוא חזק מדי, אולי ניתן לצמצם את נפח הדם שנאספו, עכברים עלולים למות בגלל קושי נשימה.
2. לערבב את הדם בעדינות על-ידי היפוך הצינורות מספר פעמים, ואז צנטריפוגה ב x 950 גרם במשך 15 דקות לאסוף את supernatants ואחסן אותם ב- 80 ° C באופן מיידי.
3. לאחר כל הדגימות שנאספו, להפשיר פלזמה בטמפרטורת החדר ולבדוק את רמת ה-LDL-C באמצעות ערכת זיהוי LDL-C על-פי הוראות היצרן.

5. in Vivo בדיקות סמים ב עכברים Chimeric Engrafted עם LDLR + /- ו FH iHeps

1. לזירוז היפרכולסטרולמיה, להאכיל לעכברים דיאטה HFHC 7 ימים לפני engraftment.
2. ב 7 ימים שלאחר engraftment, מתייחסים לכל קבוצה של עכברים עם רכב (PBS, מוזרק subcutaneously), 10 מ"ג/ק"ג/שבוע PCSK9 נוגדנים (ניסוח ברמה הקלינית של נוגדנים חד-שבטיים PCSK9, מוזרק subcutaneously מדי), 10 מ"ג/ק"ג/יום סימבסטטין (40 מ ג/ליטר mg / מ ל מי שתייה), או בשילוב נוגדנים PCSK9 ו סימבסטטין.
3. לאסוף את העכבר פלזמה-engraftment שלאחר ימים 0 (מיום engraftment), 14, 21, 28. אחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס מיד.
4. לאחר כל הדגימות זמינים, לבדוק את רמת פלזמה LDL באמצעות ערכת זיהוי LDL-C, על פי הוראות היצרן.

6. מבחן תפקוד אנדותל

הפונקציה אנדותל המושפע מוקדם FH, יכול להיבדק במודל עכבר שלנו כמחוון של החומרה של המחלה או להעריך את השיפור עם טיפולים שונים. Stereomicrocope, דיסקציה מלקחיים, מספריים, חוט myograph, רכישת חומרה (ראה טבלה של חומרים), ואת מחשב יש צורך זה.

1. להקריב את העכברים בזריקה בקרום הבטן פנוברביטל 100 מ"ג/ק"ג. להסיר את האיברים הפנימיים כך העורקים מקבילים לעמוד השדרה גלוי ולא יכול להיות מבותרים החוצה על-ידי מספריים יחד עם רקמות סמוכים והלב. לנתח את aortae באמצעות מספריים בסדר ולמקם אותם בפתרון קרבס מחומצן קר (מ מ: 119 NaCl, 4.7 אשלגן כלורי, 2.5 CaCl₂, 1 MgCl₂, 25 NaHCO₃,₂פו ח'₄1.2 ו- D 11-גלוקוז).
2. להעביר את aortae בתמיסה קרבס צלחת פטרי מצופה סיליקון. להצמיד את רקמת החיבור כדי לתקן את מיקום העורקים מבלי למתוח את זה. תחת stereomicroscope, שימוש מלקחיים בסדר מעיין המספריים ומנתחים העורקים חינם מן הרקמה שמסביב adventitial ונטייה ללא פגיעה הקיר כלי, ואז לחתוך אותו ל 1.5-2 מ"מ אורך המקטעים.
3. חתך כ 2 ס מ 40 וארוך μm עבה אל חלד חוט ולשים בעדינות דרך אבי העורקים לומן. להעביר את המקטע תא myograph חוט ממולא מחומצן קרבס פתרון על-ידי החזקת החוט.
4. כדי למדוד את אורך הקטעים aortae לומדים contractility, במקום כל אחד מהמקטעים בניצב בין הלסתות ולהקליט הקריאה (ד₁) על מיקרומטר. להסיר את המקטע ינועו הלסתות, להקליט את הקריאה (D₀). אורך המקטע יהיה L = D₁-D₀.
5. בצע את המדריך למשתמש תהדק את החוט ולאבטח אותה עם המברג, תוך הצבת על הקטע בין הלסתות, אבל להשאיר את זה unstretched.
6. נורמליזציה לפני הניסוי, להגדיר את myograph אפס תנוחה unstretched. לאחר מכן, לאט להזיז את הלסת בנפרד, לבחון את המתח העורקים לשנות עד שהגיע 3 mN. אחרי 15 דקות, לנקז את הפתרון מן החדר myograph, ולא להחליף עם פתרון קרבס טריים, לחכות 15 דקות ולהתאים את המתח ל 3 mN שוב.
7. לשנות את הפתרון קרבס רגיל 60 מ מ המכילות אשלגן כלורי קרבס פתרון לזירוז התכווצות לפחות 15 דקות יש לשטוף עם פתרון קרבס טריים 3 פעמים.
8. להוסיף הגדלת ריכוזים של phenylephrine (Phe; למשל, מ-10 ננומטר ל 100 μM). לשטוף עם פתרון קרבס רגיל ולהוסיף ריכוז יחיד של Phe ~ 70% של התכווצות מירבית של התכווצות הקודם. בעת ההתכווצות יציב, להוסיף הגדלת ריכוזים של אצטילכולין (ACh; למשל, מ- 1 או 3 nM 10 או 30 מיקרומטר) לזירוז vasodilation. ACh נוסף במרווח כ 2 דקות.
   הערה: בקטעים מסוימים אבי העורקים עם התכווצות Phe-induced קטן, למשל קטן מ- 30% של אשלגן כלורי המושרה התכווצות, U46619 (עוד מצר את כלי הדם)-ריכוז 1 ננומטר ל- 30 ננומטר יכול לשמש כדי לגרום התכווצות יציב שהוא גדול יותר מ 70% אשלגן כלורי-induced התכווצות.
9. לנקות את myograph על פי הוראות היצרן.
10. באמצעות תוכנה ניתוח נתונים (ראה טבלה של חומרים), שיא הכוח (נ) לאחר כל תוספת של תרופות. לצייר את הסמן המתח הבזליים (F_{הבזליים}) למדידה היחסי, להזיז את החץ עד לנקודה הגבוהה ביותר לאחר Phe כמו F_Pheולאחר מכן הזז אל הנקודה הנמוכה ביותר לאחר כל תוספת של ACh כמו F_ACh. לחשב את vasodilation אנדותל תלוית ACh-induced (EDV) על-ידי הרפיה % = (_AChF -F_{הבזליים}) / (_PheF -F_{הבזליים}) בציר ה-y. להכין את עקומת התגובה ריכוז על תוכנה סטטיסטית באמצעות log10 ערך של ריכוז מ' בציר ה-x.
11. כדי לנתח את הבדל סטטיסטי, להשתמש באזור תחת עקומת של כל אחד מהמקטעים של עכבר אחד, ולנתח את ההבדל של האזור תחת עקומת בין קבוצות באמצעות חד-כיווני אנובה. גם יכול להיות מנותח נקודות בודדות במידת הצורך.

7. עדויות iHep איכלוס בכבד עכבר

1. על הקצה, להקריב את העכברים על ידי הזרקת intraperitoneally פנוברביטל 100 מ"ג/ק"ג.
2. לאסוף פלזמה על ידי דקירה בלב. לנתח אונות הכבד באמצעות מספריים אופטלמולוגיות, ואז מכניסים כבדי פרי-מנה ס מ-10, לשטוף פעמיים עם תמיסת מלח. להסיר את תמיסת מלח מהמשטח כבד בנייר סופג ולאחר מכן לחתוך האונות לתוך סביב 0.6 ס מבאורך חתיכות. לתקן את האונות של הכבד בפורמלין 10%.
3. להטביע את הכבדים קבוע פרפין ובמקטע בעזרת טישו עיבוד ומערכת של מיקרוטום הזזה, בהתאמה, על פי הוראות היצרן.
4. מחממים את השקופיות עד 60 ° צלזיוס עבור h 1 להמיס השעווה. לאחר מכן, לטבול את השקופיות קסילן עבור 5 דקות פעמיים, נתרענן הרקמה עם 100%, 90% ו- 70% אתנול במרוכז.
5. לטבול את השקופיות אל השקופית-החדר המכיל בסביבות 50 מ של אנטיגן אחזור פתרון, ולאחר מכן הצב את התא לתוך סיר הלחץ, 120 ° C עבור 1.5 דקות לשטוף השקופיות בעדינות עם צינור מים במשך 5 דקות.
6. כתם הסעיפים עם נוגדנים הראשי (בסביבות 100 µL סעיף) מיקוד ALB אנושי (ט') ואת הגרעינים האנושי אנטיגן (hNA). אז, הכתם עם נוגדנים משניים מצומדת עם תווית פלורסנט או peroxidase חזרת (אשר מגיב עם ערכת זיהוי DAB).
7. כדי לחשב את אחוז ט' + hNA + תאים ואזורי, לסרוק את השקופיות מוכתם אנטי-ט' ו- anti-hNA, הגיבו DAB באמצעות שקופיות אוטומטיים של מערכת סריקה כדי לקבל תמונות שכל האזור.
   הערה: כל תמונות שנסרקו סעיף מועילים לחשב יעילות הנידונה בצורה בלתי לא משוחדת בהתבסס על ט' + אזורים או תאים hNA + כבדי שהוכתמו אימונוהיסטוכימיה. כאמצעי חלופי כדי לנטר את יעילות איכלוס iHep, רמת אלבומין האנושי הפלסמה יכול להיבדק באמצעות ערכת ALB אליסה אנושי ספציפי.
8. לקחת תמונה תמונות כדי לכסות את כל השקופית באמצעות השקופית הדיגיטלי המשויך במלונות תוכנה תחת תצוגה X 5. לכמת את האחוז של ט' + אזורים, עבור כל תמונה תמונה, השתמש המיקרוסקופ imaging התוכנה לאשר את האזור חיובי (P) לבין אזור הכולל (T) של התמונה, והשתמש התמונה J להעפיל האזור הריק (B). האחוז של ט' + אזורים מבוטאת P/(T-B) * 100%. עבור כל קבוצה, יש לבחור לפחות 3 עכברים. עבור כל עכבר, יש לבחור לפחות 4 סעיפים של עמדות שונות של הכבד.
9. לכמת את אחוז hNA + תאים, עבור כל תמונה תמונה, לבחור באקראי 1/16 של האזור עם תמונה בתוכנת עיבוד ולאחר מכן באופן ידני לספור את מספר הכולל גרעינים (T) ו- hNA + גרעינים (N). האחוז של hNA + מבוטאת N/T * 100%. עבור כל קבוצה, יש לבחור לפחות 3 עכברים. עבור כל עכבר, יש לבחור לפחות 4 סעיפים של עמדות שונות של הכבד.

IPSCs בידול של האדם מכוון לתוך iHeps
כשמגיעים 70% הנהרות, iPSCs אנושיים מובחנים לתוך iHeps עם פרוטוקול 3-צעד¹⁶ (החלונית העליונהאיור 1 ). אחרי 3 ימים של בידול האנדודרם, מושבות iPSC הפך התיר, להתפשט למפגש מלא (החלונית התחתונהאיור 1 ). לאחר מכן, עם 2^nd הבמה בינוני, hepatoblasts מופיעים, להתרבות. תאים אלה עמוסים, אבל להראות קצוות ברור בשלב זה (יום 7, החלונית התחתונה איור 1 ). לאחר 17 ימים של בידול, מופיעים iHeps מקוטב עם מורפולוגיה אופיינית משושה (החלונית התחתונהאיור 1 ). IHeps אלה מבטאים סימנים pHH, כולל AAT ALB (איור 2 א). יתר על כן, היחס של ASGPR + iHeps צריך להיות יחסית גבוה, כפי שהיא נמדדת לזרום cytometry (איור 2B)¹⁵.

דור של iHeps FH ב Vivo מחלת מודל באמצעות FH
כדי לסייע עכברים LRG לפתח היפרכולסטרולמיה, אנחנו מאכילים אותם עם דיאטה HFHC 7 ימים לפני engraftment (יום-7). ביום של engraftment (יום 0), LRG עכברים להציג פלזמה 3-fold סביב רמת ה-LDL-C (בסביבות 600 מ"ג/ד"ל, איור 3B). יום ש-15 – 17 iHeps הם engrafted לתוך LRG עכברים באמצעות הזרקת intrasplenic; אלה iHeps בקרוב מתגורר parenchyma הכבד ובהם להתרבות שם (איור 3 א). -מובילים, הכבדים של עכברים chimeric אלה הם אספו קבוע ואז צבעונית עם ט', hNA, אשר שניהם צריך להראות הוכחה ברורה בתיווך iHep איכלוס כבד בכבד עכבר LRG, בהתבסס על צביעת עבור ט' ו- hNA (איור 4A-E). בידיים שלנו, LDLR + /- והן FH iHeps להפחית פלזמה LDL-C ברמה משמעותית 21 ימים שלאחר engraftment (איור 4F). בשלב זה, עכברים chimeric הכבד האנושי FH יכול לשמש כדי לבדוק טיפולים FH.

אימות של מודל אנושי כבד עכבר Chimeric FH משתמש בסמים זמין
כדי לאמת את המודל שלנו, השתמשנו 2 ידועים סמים להורדת LDL-C, סימבסטטין, PCSK9 נוגדנים (איור 5A). הנתונים ממחישים כי 21 ימים לאחר הטיפול, נוגדנים PCSK9 יש יכולת חזקה של ועבור להורדת LDL EDV מאשר סימבסטטין בעכברים chimeric FH (איור 5B-D). ראוי לציין, הפחתת אחוז התצפיות פלזמה LDL-C עם נוגדנים PCSK9 בעכברים chimeric FH דומה דיווח עליהן ניסויים קליניים⁴. תוצאות אלו מדגימים השירות פוטנציאל של LRG עכברים chimeric engrafted עם iHeps FH לבדיקת פרה של תרופות חדישות FH.

איור 1: בוים בידול של האדם iPSCs לתוך לוח iHeps.Top, ציר זמן עבור בידול iPSC לתוך iHeps; ציטוקינים מפתח ומדיה מוצגים עבור כל אחד מהשלבים. (החלונית התחתונה) שלב נציג תמונות חדות נקודות זמן שונות של בידול iHep. אופנוע: נוקאאוט סרום חלופי; HCM: hepatocytes תרבות בינוני; דבורה שחר: hepatocyte פקטורי גדילה; OSM: oncostatin מ' אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: אפיון iHeps הופק עם פרוטוקול בידול שונה. (א) Immunofluorescence של iHeps בשלבים שונים של בידול. הגרעינים מוכתמים בצבע כחול יצירות הממוזג. בר (B) הגרף מראה את אחוז ASGPR + iHeps נגזר מתקבל ביום 17, כפי שהיא נמדדת cytometry זרימה. דוגמאות נמדדו בניסויים עצמאית 3; כלומר הערכים מוצגים ומציינים קווי שגיאה סטיית תקן (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: דור של דגם FH המחלה Vivo עם iHeps. (א) זמן שורה לדור של עכברים chimeric הכבד האנושי על-ידי הזרקת intrasplenic FH iHeps לתוך LRG עכברים. (B) בר גרף כי האכלה LRG עכברים עם דיאטה HFHC מוביל באופן משמעותי גדלה רמת ה-LDL-C (n = 10). P ערכים נקובים על הדמות, התקבלו באמצעות מבחן t אינטראקצית; כלומר הערכים מוצגים ומציינים קווי השגיאה שגיאת התקן של הממוצע (SEM). פאנל B שונה מ- דמות 3עכשיו שלנו הקודם ח¹⁵. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: iHep Mediated איכלוס של הכבד עכברים LRG. (א) נציג כל סעיף סריקת תמונה של ט' מכתים בכבד עכבר אוכלס מחדש עם LDLR + /-iHeps. חיצים מציינים אשכולות של האדם iHeps engrafted לתוך הכבד העכבר; סעיפים מוגדלת מוצגים בחלונית הימנית. פיזור (B) מגרש הגרף מראה את האחוז אוכלס מחדש ט' + המתאימים לאזורים iHep המכילים כבד עכבר (מתוך iPSCs תורם אחר), חישוב התבססה על כל סעיף סריקת תמונות (n = 19). כלומר הערכים מוצגים ומציינים קווי שגיאה SD. (ג) להחליפן בתמונות של immunohistochemical מכתים עבור hNA ב כבד עכבר עם engrafted FH iHeps. (ד) גרף מראה את אחוז הנידונה hNA + iHeps (מתוך iPSCs התורם שונים) ב- LRG העכבר כבדים (n = 3). כלומר הערכים מוצגים ומציינים קווי שגיאה ט' SD. (E) ו- hNA מכתים על שני קטעים רצופים של כבד עכבר אוכלס מחדש עם פראי סוג iHeps. (F) גרף עמודות מציג את האחוז של פלסמה להפחתת LDL-C מקו-engraftment שלאחר יום 21; n = 5 עבור LDLR + /-iHeps ו- n = 6 עבור FH iHeps ועל הרכב. P ערכים נקובים על הדמות, התקבלו באמצעות מבחן t אינטראקצית; כלומר הערכים מוצגים קווי שגיאה מציינים ב- SEM. לוחות B, D ו- E הינם שונה איור 3G-3עכשיו הקודם הדו ח¹⁵. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5 : PCSK9 נוגדנים להראות חזק LDL להורדת יכולת מאשר סימבסטטין בעכברים LRG Chimeric הכבד האנושי. (א) הצג סכימתי של התרופה ויוו בדיקות גישה באמצעות עכברים chimeric הכבד האנושי FH. (B ו- C) אחוזי השינוי של פלסמה LDL-C מקו ימים 14, 21, 28 בעכברים FH chimeric נמאס HFHC דיאטה ו שטופלו הסמים שצוין; n מציין מספר עכברים. ערכים P התקבלו באמצעות מבחן Kruskal-איי ווליס; כלומר הערכים מוצגים ומציינים קווי שגיאה ב- SEM (D) EDV בתגובה הגדלת ריכוזים של ACh. P ערכים נקובים על דמות ריכוז המצוין. ערכים P התקבלו באמצעות ANOVA דו-כיוונית באמצעות השוואה מרובים של Dunnett; קווי שגיאה מציינים שב-SEM. איור 5 הוא שונה מן דמות 4A-4 C ו- 5A איור של שלנו הקודם ח¹⁵. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מחקרים קודמים באמצעות iHeps ב מכרסמים אישרו כי הם דרך יעילה ללמוד בירושה מחלות כבד¹⁷. בכדי להרחיב את השימוש בטכנולוגיה זו, כי המודלים הנוכחיים של בעלי חיים FH שיוצרת, אנו engrafted FH iHeps לתוך עכברים LRG, הראה כי את engrafted LDLR + /- או משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים LDLR-iHeps FH מוטציה יכולה להפחית את רמת הפלסמה LDL-C עכברים להגיב להורדת שומנים בדם סמים ויוו.

יש 3 שלבים קריטיים בפרוטוקול שלנו ליצירה האנושית FH הכבד chimeric עכברים באמצעות iHeps:
1) ייצור באיכות גבוהה iHeps דרך בידול מכוונת. לאור ההשתנות המשובטים בין iPSC קווים¹⁸, חשוב להשתמש isogenic iPSCs להשוואות נאותה, כדי לבדוק את היעילות של בידול iHep של הקו אמא תא לפני ביצוע ההנדסה, את engraftment.

2) iHep נכונה להעלות לתוך המזרק. שונה מכל בפרוטוקולים אחרים, אנחנו השתמש מטריצה חוץ-תאית 50% (הריכוז הסופי, וי/v) כדי resuspend iHeps, ולאחר מכן להעלות אותם לתוך המזרק אינסולין. אנו מאמינים כי מטריצות מגן על התאים מספק microenvironment המקל על הגירה iHep לתוך הכבד של הטחול. הבועות הן גורם קטלני לניתוח, יש להימנע לחלוטין במזרק.

3) לתקן מספר תאים engrafted. עומס יתר של תאים יכול גם להוביל lethality גבוהה קצב. אנו ממליצים engrafting iHeps 1 – 1.5 מיליון לכל 25-30 גרם העכבר.

פרוטוקול שלנו יש גם כמה מגבלות: הפגיעה בכבד המושרה על ידי הקרנה בינוני והוא במינון יחיד, מצב ההבשלה של iHeps שלנו הוא לא דומה pHH. קשורה בשני שיקולים, מידת chimerism של המודל שלנו דומה דיווחים אחרונים המתארת הנד/Lt-SCID/IL-2Rγ^−/− עכברים או חולדות גאן engrafted עם^17,iHeps, נגזר iPSC¹⁹ , אבל נמוך משמעותית מאשר עכברים FRG או uPA העכברים הטרנסגניים engrafted עם pHH. כדי להתגבר על זה אזהרה, מצד אחד, אחד נוסף יכול למטב את פרוטוקול בידול הכבד כדי לשפר את התבגרותם של iHeps. מצד שני, LRG עכברים יכול להיות חצה עם עכברים FRG ליצירת עכברים Ldlr^{- / -}/Fah^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- /} .

לסיכום, הנה תארנו פרוטוקול מפורט ליצירת אנושי בעלי FH iHeps chimeric בכבד ולאחר בדיקה את הפונקציונליות של iHeps engrafted. חשוב, אלו עכברים chimeric יכול לשמש עבור ויוו בדיקות סמים. ניתן למטב המודל שלנו ככל הנראה על-ידי שיפור הפונקציונליות של iHeps או לדפוק גנים נוספים (למשל., Fah) של הנמען LRG עכברים, וזה יהיה שימושי לחקור מנגנונים פתולוגי של המחלה ולבצע פרה מחקרים.

ה-ס. ז הוא רכז נבחרת החוקר של אודיסיאה תוצאות המחקר בחסות סאנופי ופרמצבטיקה Regeneron.

עבודה זו נתמכה על ידי המדע שנג'ן טכנולוגיה מועצת המחקר התוכנית הבסיסית (JCYJ20150331142757383), תכנית המחקר עדיפות אסטרטגית של האקדמיה הסינית למדעים (XDA16030502), הונג קונג מחקר המועצה מענק דירוג המבוסס על מחקר ערכת (טי12-705/11), תוכנית משותפת של המועצה מענקים למחקר של האזור המנהלי המיוחד הונג קונג ושל קרן מדעי הטבע הלאומית של סין (N-HKU730/12 ו- 81261160506), צוות פרוייקט מחקר מדעי הטבע גואנג-דונג קרן (2014A030312001), גואנגג'ואו המדע, הטכנולוגיה התוכנית (201607010086), בפרובינצית גואנג-דונג מדע, טכנולוגיה תוכנית (2016B030229007 ו- 2017B050506007).