כולה-הר מיקרוסקופיה קונפוקלית לעור מבוגר האוזן: מערכת מודל ללמוד מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון

כאן נתאר שיטת הדמיה כולה-הר ברזולוציה גבוהה בעור האוזן והעכבר כולו למבוגרים, אשר מאפשרת לנו לדמיין מורפוגנזה מסעף והמתבנת של העצבים ההיקפיים, כלי הדם, כמו גם התפלגות תא החיסון.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של עור האוזן למבוגרים כולה-הר של הדמיה טכניקה ללמוד מקיף תלת מימדי מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית ו המתבנת, וכן חלוקת תא החיסון ברמה התאית. הניתוח של היקפי עצבים, כלי דם מבנים אנטומיים של רקמות בוגרות מספק כמה תובנות להבנת חיווט נוירו-וסקולרית פונקציונלי והתנוונות נוירו-וסקולרית במצבים פתולוגיים כגון ריפוי הפצע. כמערכת מודל מאוד אינפורמטיבי, אנחנו התמקדו המחקרים שלנו בעור האוזן למבוגרים, אשר נגיש עבור ניתוח. פרוטוקול לשחזור ופשוט שלנו מספק תיאור מדויק של הרכיבים הסלולר של העור כולו, כגון העצבים ההיקפיים (אקסונים סנסוריים, סימפטי אקסונים ו תאי שוואן), כלי הדם (תאי אנדותל ותאים השריר החלק בכלי הדם ), ותאים דלקתיים. אנו מאמינים שפרוטוקול זה יסלול את הדרך לחקור ליקויים מורפולוגי של העצבים וכלי הדם, כמו גם הדלקת בעור האוזן למבוגרים תחת מצבים פתולוגיים שונים.

העור מורכב משלוש שכבות: אפידרמיס, דרמיס ובהיפודרמיס. זה שימש כמערכת מודל לחקר תאי גזע תחזוקה, בידול, מורפוגנזה פיתוח וכן התחדשות, tumorigenesis, וכן דלקת למבוגרים. העור הוא בעושר vascularized, innervated כך ההתפתחות של מערכת העצבים ההיקפית, מערכת כלי הדם היא מתואמת היטב.

בעבר הראו טכניקת דימות של העור מתחלקים כולה-הר עם תיוג מרובים ללמוד העצבים ההיקפיים שלמים וכלי הדם כולל את מרכיבי התא^{1,2,3, 4}: אקסונים סנסוריים אקסונים סימפטי, שוואן תאי העצבים, תאי אנדותל, pericytes, תאי השריר החלק בכלי הדם (VSMCs) בכלי הדם. במהלך האנגיוגנזה, רשת נימי הראשי עובר שיפוץ כלי הדם אינטנסיבית ומפתחת היררכי לרשת מסתעפים כלי הדם. פיתוח הדרמיס/ובהיפודרמיס, העורקים הסניף לצד העצבים החישה היקפיים וורידים מכן יוצרים הסמוכים העורקים. אחרי היררכי לרשת כלי הדם יהיה מכוסה היטב עם VSMCs, העצבים הסימפתטית להאריך לאורך, innervate כלי דם גדולים בקוטר^1,5,6. למרות החשיבות של האגודה קרוב בין מערכות עצבים וכלי פיתוח, שאלה גדולה כבר להתייחס מה יקרה הרשתות נוירו-וסקולרית במצבים פתולוגיים שונים אצל מבוגרים. דימות ברזולוציה תלת מימדי יש צורך להעריך בפתוגנזה, מורפוגנזה מסעף לזיהוי אנטומית ו המתבנת.

מורפוגנזה עצביים ואת כלי הדם בעור עכבר מבוגרים בדרך כלל ניתוח על ידי רקמת סעיף מכתים. מחקרים אחרים השתמשו כולה-הר הדמיה של העור כדי להמחיש את העצבים וכלי הדם, בנוסף זקיקי שיער, בלוטות החלב, arrector pili השרירים^7,8,9. עם זאת, עובי העור למבוגרים הפכה אותו קשה לנתח את העור מעל כל העומק שלה.

במחקר הנוכחי, פיתחנו הרומן דימות כולה-הר ברזולוציה של האוזן למבוגרים עור כדי להתגבר על האתגרים הללו. האוזן העור הוא נגיש עבור ניתוח והדמיה כולה-הר עוקבות של העור מעל כל העומק שלה. לכן שיטה פשוטה מאוד לשחזור שניתן להחיל כדי להשוות בין ארכיטקטורה תלת מימדי של מערכות היקפיות לחוץ ואת כלי הדם של העור, עם מדידות כימות מקיף. להדגים היישור של העצבים ההיקפיים חושית ואוהד עם כלי דם גדולים בקוטר נשמרת בעור מבוגר. המטרה של פרוטוקול זה היא להציג באופן חזותי מורפוגנזה מסעף, את המתבנת של העצבים ההיקפיים, כלי הדם, כמו גם את התפלגות תא החיסון ברמה התאית במודלים של העכבר מבוגרים בתנאים שונים כגון דלקת ו התחדשות.

כל הניסויים בסעיף זה בוצעו תחת אישור מן הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (NHLBI) חיה אכפת לי שימוש הוועדה.

1. בגיר העכבר האוזן העור אוסף

1. המתת חסד עכברים בוגרים על ידי חשיפה פחמן דו-חמצני (CO₂) בתוך תא סגור ולאחר מכן לאשר את המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם.
   הערה: הניסוי מלווה מנחה לאומי מכונים לבריאות (NIH) עבור שיטת המתת חסד.
2. לנתח את האוזן מבסיס ולמקם אותו 35 x 10 מ מ² פטרי המכילות 2 מ"ל מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק). בקצרה לקצץ שערות עם מספריים.
3. לקלף את העור האחורי ועור הקדמי משם בקפידה הסחוס להתערב.
   הערה: סחוס מייחסת העור הקדמי.
4. להעביר את ישבנה ואת העור הקדמי בנפרד כדי בגודל 24 טוב לוח המכיל 1 מ"ל של קרח טרי 4% paraformaldehyde (PFA) בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) לכל טוב. לרדד את העור האחורי ו הקדמי של ארבעה אחוזים מחברים.
5. לתקן את העור האחורי ו הקדמי עם סחוס ב 4 ° C עבור 1 h.
6. לשטוף את העור האחורי ו הקדמי 3 פעמים במשך 5 דקות ב- 1 מ"ל של PBS עם ערבוב עדין על מערבל בטמפרטורת החדר.
7. להעביר את העור האחורי ו הקדמי עם הסחוס התחתון של 35 x 10 מ מ² פטרי. חתוך את אזור הבסיס, אשר הוא מקופל יש שומן ואת רקמות החיבור. לקלף את הסחוס של העור הקדמי באמצעות מלקחיים מעוקל בסדר.
8. הסר בזהירות את השערות, רקמות adipose ואת רקמות החיבור מהחלק הפנימי של העור האחורי בעזרת פינצטה מעוקל משובחים. לשמור על עור רטוב עם PBS.

2. כולה-הר נוגדן של העכבר האוזן העור

הערה: כל הניסויים בסעיפים הבאים בוצעו בהתאם להנחיות הבטיחות מעבדה NIH.

1. הכנת המאגר חסימה. מסנן חום 10% לא פעיל עז סרום (HIGS) מדולל ב- PBS עם טריטון 0.2% מאגר חסימה X-100 (TX-100), או 10% חמור סרום (DS) מדולל ב- PBS עם 0.2% מאגר חסימה TX-100, באמצעות יחידת מסנן 0.45 מיקרומטר.
2. להעביר את הצד האחורי, העור הקדמי כדי בגודל 24 צלחת טוב המכיל 1 מ"ל של 10% HIGS מאגר חסימה או מאגר חסימה של DS 10% לכל טוב. דגירה על העור למשך 30 דקות עם ערבוב עדין על מערבל בטמפרטורת החדר.
3. להכין את הפתרון נוגדן ראשוני על ידי דילול הנוגדנים הראשי (טבלה של חומרים) במאגר חסימה (או 10% HIGS או 10% DS).
   הערה: כל-mout immunohistochemical ניתוח של האוזן למבוגרים עור עם נוגדנים לכיתה ספציפית נוירון סמן פאן עצבית השלישי β-טובולין (Tuj1, ארנב polyclonal IgG או בעכבר monocloncal IgG2a, דילול שבערך על הריכוז הסופי של 2 µg/mL). תאי אנדותל-פאן סמן טסיות תא אנדותל אדהזיה מולקולה 1 (PECAM-1, אוגר monoclonal איג, 1:300 דילול-הריכוז הסופי של 3.3 µg/mL), מעטפת המיאלין סמן המיאלין הבסיסי חלבון (MBP, ארנב polyclonal איג, 1:200 דילול ב הריכוז הסופי של 5 µg/mL), סמן דלקתיות התאים מיאלואידית CD11b (עכברוש IgG2b monoclonal, 1:50 דילול-הריכוז הסופי של 20 µg/mL) הוצג באיור 1 ו- 2 איור. העור, נדגרה עם נוגדנים Cy3 מצומדת על השריר החלק בכלי הדם תא סמן α שריר חלק אקטין (αSMA) יחד עם נוגדנים משניים (2.6). הנוגדנים הראשית נבדקו על-ידי עצמנו נרשמו בטבלה שלחומרים. יכול להיות מעורב מספר נוגדנים העיקרי נגזר מינים שונים בו זמנית.
4. להעביר את עור אחורי, קדמי באר חדשה המכילה 150 µL של הפתרון העיקרי נוגדנים. דגירה העור תוך ערבוב עדין על מערבל ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
5. למחרת, להעביר את עור אחורי, קדמי בארות חדשות בצלחת טוב 24 או תשאף המאגר חסימה המכיל נוגדנים העיקרי. להוסיף 1 מ"ל או 2% HIGS מדולל ב- PBS עם מאגר כביסה TX-100 0.2% או 2% DS מדולל ב- PBS עם מאגר כביסה TX-100 0.2%. לשטוף את העור עם שינויים 3 המאגר כביסה בכל 15 דקות עם ערבוב עדין על מערבל בטמפרטורת החדר.
6. להכין את הפתרון נוגדנים משניים (טבלה של חומרים). לדלל נוגדנים משניים במאגר חסימה (או 10% HIGS או 10% DS) ומסנן המאגר חסימה המכיל נוגדנים משניים דרך 0.22 מיקרומטר polyvinylidene difluoride (PVDF) ממברנה מזרק פילטר מחובר מזרק 1 מ"ל.
   הערה: אלקסה 488 או מצומדת 633 עז ארנב אנטי איג (H + L) או עכבר IgG2a עבור Tuj1, אוגר נגד עז מצומדת אלקסה 647 IgG (H + L) אנטי-ארנב PECAM-1, 488 אלקסה מצומדת עז IgG (H + L) עבור MBP, ושימשו עכברוש מצומדת אלקסה 594 IgG (H + L) עבור CD11b עם דילול 1:250-הריכוז הסופי של 8 µg/mL. העור, נדגרה עם נוגדנים αSMA מצומדת Cy3 (דילול שבערך על הריכוז הסופי של 2-3 µg/mL) בשילוב עם נוגדנים משניים אלה.
7. Centrifuge הפתרון ב 13,000 g x 10 דקות להסיר חלקיקים צבורים של נוגדנים משניים מתוך המאגר חסימה.
   הערה: שונה פלורסנט מצומדת משני נוגדנים נגזר מינים שונים יכול להיות מעורב בו זמנית.
8. העבר את העור האחורי ו הקדמי טוב המכיל 150 µL של הפתרון נוגדנים משניים. לעטוף את הצלחת היטב 24 בנייר אלומיניום כדי למנוע אור דגירה את העור h 1 עם ערבוב עדין על מערבל בטמפרטורת החדר.
9. להעביר את עור אחורי, קדמי בארות חדשות בצלחת טוב 24 או תשאף הפתרון נוגדנים משניים על-ידי pipet לחלוטין. להוסיף 1 מ"ל של מאגר כביסה HIGS 2% או 2% DS כביסה מאגר.
10. לעטוף את הצלחת היטב 24 בנייר אלומיניום ולשטוף בשינויים 3 המאגר כביסה בכל 15 דקות עם ערבוב עדין על מערבל בטמפרטורת החדר.

3. הרכבה את העור האוזן בשקופית

1. מקם את העור על החלק התחתון של 35 x 10 מ מ² פטרי. הסר בזהירות את שערות רקמות adipose, רקמות החיבור, dusts, הסיבים מהחלק הפנימי של העור בעזרת מלקחיים מעוקל בסדר תחת stereomicroscope עם תאורה נמוכה כדי למזער תמונה מקיפה הלבנה. לשמור על עור רטוב עם PBS.
2. להעביר את העור שקופיות מיקרוסקופ דבק באמצעות מלקחיים. מקם את העור האחורי ו הקדמי עם הפנימי כלפי מעלה בשקופית. לשטח העור בעזרת מלקחיים.
3. הר העור במדיום הרכבה לדעוך אנטי נוזלית כדי להימנע photobleaching ולשמר אותות פלואורסצנט. ודא כי אין בועות אוויר הם בערך בהעור.
4. מכסה עם coverslip על הדגימות העור בזהירות, לאחסן השקופיות לדוגמה את העור הנטען הלילה חשוך בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר את שהתקשורת הרכבה לקבל המשרד. לסגור את coverslip אל השקופית עם לק ואחסן אותו ב 4 ° C לאחסון לטווח ארוך.

4. מיקרוסקופיה קונפוקלית

1. כוונן המתאים לייזרים של fluorophores. מיקרוסקופ קונפוקלי עם שלושה מקורות לייזר (ארגון 488 ננומטר, DPSS 561 ננומטר, הנה 633 ננומטר) משמש בניסוי זה.
2. השתמש בכלי הסריקה רציפים, אשר בו זמנית מרגש דגימות שהוכתמו שלוש פעמים, כדי למנוע ולהפחית בחפיפה.
   הערה: תמונות תועבר באופן רציף באמצעות מצב סריקה רציפים.
3. תמונה תחת מטרה X 10. השתמש בכלי הסריקה אריח כדי ללכוד את העור כל אוזן. הגדר Z-מחסנית וודא כי z-המיקום מכסה את כל עובי העור האוזן.

עור אחורי האוזן העכבר למבוגרים (איור 1 א') והעור באוזן קדמית (איור 1B) היו immunostained עם נוגדנים αSMA (אדום), Tuj1 (ירוק), ו- PECAM-1 (כחול). העור האחורי היה immunostained ללמוד נוירו-החיסון הפצה באמצעות נוגדנים CD11b (אדום) ו MBP (ירוק), יחד עם Tuj1 (כחול) (איור 2 א). חלוקת CD11b⁺ תאים דלקתיים, כולל מקרופאגים זוהה ברזולוציה הסלולר יחיד (איור 2B).

איור 1: יישור ofperipheral העצבים וכלי הדם בעור האוזן למבוגרים. כולה-הר immunofluorescence טריפל מיקרוסקופיה קונפוקלית של האוזן האחורי ו הקדמי עור עם נוגדנים αSMA (אדום), Tuj1 (ירוק), PECAM-1 (כחול) מוצגים. (א) מכוסה VSMC גדול-קוטר כלי הדם להתיישר עם העצבים ההיקפיים בעור האוזן האחורי. (B) קטן יותר-קוטר כלי הדם מכוסה VSMCs להתיישר עם קוטר קטן במערכת העצבים ההיקפית חבילות בעור האוזן הקדמי. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: Myelination של העצבים ההיקפיים, CD11b⁺ תא מיאלואידית הפצה בעור האוזן למבוגרים. Immunofluorescence טריפל כולה-הר מיקרוסקופיה קונפוקלית של עור אחורי האוזן עם נוגדנים CD11b (אדום) ו- MBP (ירוק), יחד עם Tuj1 (כחול), מוצג. (א) בינוניים וגדולים קוטר העצבים ההיקפיים הם סיבי העצב. (B) תקריב תמונה ב- (א). CD11b⁺ תאים דלקתיים פזר באופן שווה בעור האוזן האחורי. סרגל קנה מידה = 1 מ מ (א), 100 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פרוטוקול זה מתאר את כולה-הר immunonohistochemical הדמיה של האוזן למבוגרים עור לניתוח של המבנים הנוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון. אנו מאמינים שבשיטה זו יש יתרונות רבים ניסיוני לחוקרים ללמוד מורפוגנזה מסעף ו את המתבנת של העצבים וכלי הדם, כמו גם תלת מימדי הפצה של רכיבי העור כולל תאים חיסוניים ושיער זקיקי. ניתן לכמת את התוצאות של ההדמיה באמצעות תוכנות דימות לצורך ניתוח כמותי נוסף.

הכנה נכונה של העור האוזן הינה קריטית להצלחת פרוטוקול זה. ראשית, בעור האוזן צריך גזור בקפידה זמן קצר לאחר המתות חסד העכבר. החלק האחורי של העור האוזן צריך לקלף מן הסחוס. לאחר מכן, הסחוס צריך לקלף מן העור הקדמי לפני צביעת. שנית, רקמות החיבור, רקמות adipose ו שערות צריך להסיר בעדינות וביסודיות לפני הרכבה. בשל קיומה של העצבים ההיקפיים על פני השטח של העור, הסרת זהירות נדרשת כדי למנוע נזק העצבים. שלישית, האוזן העור צריך להיות פרש עם ההסרה של כמה רקמות העור האוזן עבה. לבסוף, העור האוזן צריך להיות שטוח רכוב ללא בועות אוויר.

מגבלה אחת של פרוטוקול זה הוא מתויג אוזן לאוזן העור אינו מתאים לניתוח כמו האוזן תג גורם חור או צלקת. לכן, זיהוי של עכברים באמצעות שיטות שונות תג האוזן כמו תיוג על הזנב הוא הכרחי במקרה ישנם עכברים מרובים כדי לנתח.

ניתן לסרוק בעור האוזן כולו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית עם כלי סריקה אריח, למרות דיווחים קודמים הדגימו כי אזור עניין יכול לדימות עם רזולוציה גבוהה¹⁰. מעניין, חושף ההדמיה כולה-הר של העור כולו אוזן מורפוגנזה מסעף ברורים ואת המתבנת של העצבים וכלי הדם בין העור האחורי ו הקדמי (איור 1): לעור האחורי יש קוטר גדול עצבים חבילות (20 – 50 מיקרומטר) מיושר עם כלי הדם קוטר גדול ומשופץ, מכוסה αSMA⁺ VSMCs (20-60 מיקרומטר), בעוד הקדמי העור יש עצב בקוטר קטן יותר חבילות (< 20 מיקרומטר) מיושר עם קוטר קטן יותר אך שופצה כלי דם מכוסה αSMA⁺ VSMCs (< 20 מיקרומטר).

ישנם מספר מודלים העכבר¹¹ כדי להבהיר את המנגנון של מחלות עור האדם כגון אטופיק דרמטיטיס¹², פסוריאזיס¹³, פצע ריפוי¹⁴ונוירופתיה סוכרתית¹⁵יוצא מן הכלל. אנו החילו לפרוטוקול זה על העור האוזן של דיאטה-induced ההשמנה עכברים, הקלד 2 בעכברים סוכרתיים ללמוד נוירופתיה סוכרתית¹⁶. פרוטוקול זה ניתן להחיל מ לנוער למבוגרים העכבר העור בתנאים פתולוגיים שונים.

המחברים אין לחשוף.

אנו מודים ק' גיל לניהול מעבדה, תמיכה טכנית, ג'יי הוקינס, הצוות של נבחרת מכונים לבריאות (NIH) בניית מתקן בעלי חיים 50 על הסיוע עם העכבר, והטיפול ר ריד, פ Baldrey לסיוע מינהלי. תודה גם Motegi ס ו מ Udey עבור שיתוף שלהם האוזן העור לנתיחה פרוטוקול, כוויות (ש ע) עזרה העריכה, חברים של המעבדה של תאי גזע וביולוגיה נוירו-וסקולרית לקבלת עזרה טכנית ודיון מתחשב. ט יאמזאקי נתמכה על ידי החברה יפן עבור NIH-KAITOKU קידום המדע (JSPS). עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מחקר מגזר של הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (HL005702-11 כדי עיון)