Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

כאן אנו מספקים פרוטוקול עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing בנוכחות שכבה מזין גליה. נוירונים בתרבית להקים הקוטביות וליצור סינפסות, והוא יכול להיות מופרד גליה לשימוש ביישומים שונים, כגון electrophysiology, הדמיה סידן, מבחני הישרדות התא, immunocytochemistry, ו-RNA / DNA / בידוד החלבון.

סרט הווידאו הזה ינחה אותך בתהליך של עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing בנוכחות שכבה מזין גליה, מערכת המכונה bilaminar או שיתוף תרבות מודל. מערכת זו מתאימה למגוון צרכים הדורשים ניסיוני או כוס או מצע גידול פלסטיק יכול לשמש גם עבור התרבות של סוגים אחרים של נוירונים.

נוירונים בקליפת המוח עכברוש המתקבל בשלב עוברי מאוחר (E17) הם על coverslips מצופה זכוכית או בתרבית רקמה מנות מול שכבת מזין של גליה גדל על כלים או coverslips פלסטיק (המכונה Thermanox), בהתאמה. הבחירה בין שתי תצורות תלוי בטכניקה ניסויית מסוימת בשימוש, אשר עשויים לדרוש, או לא, נוירונים, כי הם גדלו על זכוכית (למשל, הדמיה סידן לעומת המערב כתם). השכבה מזין גליה, תרבות astroglia מועשר המשני של גליה מעורבת, מוכן בנפרד הקורטקס של גורי חולדה היילוד (P2-4) לפני העצביתדיסקציה.

היתרון העיקרי של מערכת זו תרבות לעומת תרבות של נוירונים היחיד הוא תמיכה של צמיחה הישרדות העצבית, והבחנה המסופקים על ידי גורמים trophic המופרשים מהשכבה מזין גליה, אשר דומה בצורה מדויקת יותר את הסביבה המוח in vivo. יתר על כן, שיתוף התרבות יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות עצביות, גליה ^1.

במקביל, זיהום גליה בשכבת העצבית נמנעת באמצעים שונים (תרבות צפיפות נמוכה, תוספת של מעכבי mitotic, חוסר להשתמש בסרום של המדיום תרבות אופטימיזציה) המובילה בשכבה עצבי טהור כמעט, בהשוואה לשיטות אחרות שהוקמו ^{1 -3.} נוירונים ניתן להפריד בקלות בכל עת מהשכבה גליה במהלך התרבות משמשת ליישומים ניסויים שונים הנעים בין ⁴ electrophysiology, ביולוגיה תאית ומולקולרית ^{5-8, 5} ביוכימיה, הדמיה מיקרופוןroscopy ^4,6,7,9,10. הנוירונים העיקרי להאריך אקסונים דנדריטים וסינפסות כדי ליצור תפקודית ^11, תהליך אשר אינו שנצפתה שורות תאים עצביים, למרות כמה שורות תאים לעשות להאריך תהליכים.

פרוטוקול מפורט של עכברוש נוירונים בהיפוקמפוס culturing באמצעות מערכת שיתוף תרבות תוארה בעבר ^4,12,13. כאן אנו פרט פרוטוקול שונה מתאים נוירונים בקליפת המוח. כמו כ 20x10 ⁶ תאים התאושש העובר כל עכברוש, שיטה זו שימושית במיוחד עבור ניסויים הדורשים כמויות גדולות של נוירונים (אך לא מודאג אוכלוסייה הומוגנית מאוד נוירונים). הכנת נוירונים גליה צריך להיות מתוכנן באופן ספציפי זמן. אנו נספק את פרוטוקול צעד אחר צעד עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing כמו גם בתאי גלייה culturing לתמוך נוירונים.

1. גליה Dissection (~ 2 שבועות לפני נוירונים ציפוי)

1. כדי להכין את המקום בכלים סטריליים לנתיחה באתנול 70%, להוסיף 4 לנתיחה קר מ"ל בינוני עד 60 מ"מ צלחות (צלחת אחת לכל המוח), ובמקום 2.5% טריפסין ו DNase על הקרח להפשיר (ראה פירוט על כלים כירורגיים השישי בטבלה ).
2. השתמש במספריים גדולים לערוף 2-4 גורים ישנים יום וראשי מקום בצלחת סטרילית 100 מ"מ.
3. השתמש במספריים בינוני לעשות חתך קו האמצע דרך העור ולמשוך בחזרה את העור ולחשוף את הגולגולת. השתמש במספריים מעוגלים לעשות חתך קו האמצע ושני חתכים לרוחב דרך הגולגולת, מבלי לפגוע ברקמות שמתחת המוח. הסר את הגולגולת העליונה כדי לחשוף את המוח.
4. חלץ את המוח ולמקם אותו בצלחת שלה עצמה 60 מ"מ המכיל 4 בינוני קר מ"ל דיסקציה (ראה טבלה אני להרכב). מניחים את צלחת תחת stereomicroscope (לייקה ZOOM 2000, זום שליטה: 70-30) וכן להשתמש במלקחיים No.5 להפריד את האונות, להסיר את המוח התיכון, וקליפת off קרומי המוח.
5. לאסוף את כל הקורטקס המוחי גזור בצלחת 60 מ"מ עם טרי בינוני לנתיחה קרים, לקצץ את רקמת עם מספריים מעוקל.
6. העברת רקמה טחון לצינור 15 מ"ל סטרילי. תביאו את נפח 4.5 מ"ל עם מדיום לנתיחה קר להוסיף 500 μL טריפסין של 2.5%. לעטוף את הצינורית Parafilm ולצוף אותה אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים במשך 15 דקות, ערבוב על ידי היפוך כל 5 דקות.

   (הערה: כאן אנו מתארים את הפרוטוקול אנחנו בדרך כלל לנקוט בעת שימוש של עד 5 מוחות, אם הגורים נמצאים בשימוש יותר, כרכים ייתכן שיהיה צורך להתאים כראוי)

7. העברת רקמה לצינור 15 מ"ל חדש, צמצום נפח בינוני טריפסין המכילים לנתיחה נשאו מעל. תביאו את נפח 4.8mL בינוני עם דיסקציה טריים להוסיף 200 DNase μL להגיע הריכוז הסופי של 60 UG / mL (פתרון מניות: 3 מ"ג ו -5 מ"ג DNase MgSO4 ב 2 מ"ל של מדיום דיסקציה). Triturate בעדינות ~ 20 פעמים עם pipet 5 מ"ל סטריליטה, ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של מדיום ציפוי גליה (ראה טבלה II עבור הרכב).
8. אפשר חתיכות גדולות של רקמה להתפשר על 4-5 דקות, ולאחר מכן להעביר את 80% העליונים של השעיה לתא צינור 50 מ"ל. חזור על טחינה דקה עם רקמת מ"ל 2-3 בינוני ציפוי נוסף של גליה (באמצעות פיפטה קטנות במידת הצורך); שוב, לאפשר לרקמות להתיישב, ולהוסיף את 80% העליונים לאוסף הקודם. תביאו את הנפח הכולל עד 20 מ"ל עם מדיום גליה ציפוי צנטריפוגות במשך 15 דקות ב 280 גרם (או 1,300 סל"ד ב צנטריפוגה Centra CL2 IEC).
9. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה בינוני ציפוי גליה (בערך באמצעות מ"ל 5-7 תלוי במספר הגורים בשימוש), ואז להוסיף בינוני ציפוי נוסף על מנת לקבל 10 מ"ל למוח כל גזור. מערבבים היטב צלחת 10 מ"ל של השעיה תא כל בקבוק 75 ס"מ ² (כלומר אחד מוח לכל בקבוק).
10. העבר צלוחיות תרבות להגדיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס (5 עד 10% CO2, יחסי bicarbona נתרןte התוכן של המדיום). שינוי התרבות בינוני לאחר 24-48 שעות, ולאחר מכן כל 3-4 ימים.

2. גליה משניים (48 שעות לפני נוירונים ציפוי)

1. הכן thermanox coverslips (אם נוירונים יהיה מצופה על מנות) על ידי הוספת 3 טיפות קטנות של שעווה מותכת paraplast סביב היקף של thermanox כל שטף autoclaved. תאים יהיה מצופה בצד הזה של thermanox. Thermanox שלנו הם בעבודת יד לשימוש חוזר ~ 60 מ"מ מוסיף לחתוך מפלסטיק (ראה טבלה VI של ריאגנטים) עם 50 ~ 2 מ"מ חורים שנקדחו דרך, למרות התרבות זמינים מסחרית גם מוסיף עשוי לשמש במקום.
2. שטפו את גליה ראשוני עם PBS פעמיים, במרץ רועד כל בקבוק כדי להסיר תאים פנויים. כל בקבוק עם גליה העיקרי ומחוברות תספק כ 10,000,000 astroglia, ולכן אנו משתמשים בקביעות 2-4 צלוחיות לכל ניסוי.
3. ניתוק התאים עם 0.05% tryspin-EDTA (1 mL10X 0.5% טריפסין-EDTA פתרון המניות בדילול מלא של 9 מ"ל PBS). קומבינה את התאים מן 2 צלוחיות לתוך צינור 50 one חרוטי מ"ל ולהוסיף כמות זהה של בינוני ציפוי גליה (ראה טבלה II של ריאגנטים). צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 280 גרם לשאוב supernatant ו לפזר את גליה בתוך גלולה מ"ל כמה בינוני ציפוי גליה.
4. ספור את התאים בעזרת hematocytometer ו לדלל את ההשעיה התא לפי הצורך (~ 1x10 ⁶ תאים / מ"ל); צלחת התאים או על 60mm מנות (אם נוירונים יהיה מצופה על coverslips), או על coverslips thermanox (אם נוירונים תהיה מצופה ב 60 מנות מ"מ). תאים צריך להיות מצופה ב 500,000 תאים לכל תבשיל או thermanox באמצעות ציפוי בינוני גליה. במקרה של thermanox coverslips, 600 צלחת μL של תאים באופן dropwise, אז אחרי 2 שעות thermanox להעיף ותאי לצלול בינוני ציפוי גליה.
5. אם מכינים מנות 60 מ"מ של גליה משני coverslips נוירונים, שינוי בינוני עד N2.1 ערב לפני לנתיחה עצביים.

3. עצבי Dissectionתרבות

1. הכן coverslips זכוכית (15 מ"מ קוטר) על ידי הוספת 3 טיפות קטנות של שעווה מותכת paraplast סביב היקף של coverslip כל סטרילי, על מנת ליצור הפרדה פיסית בין שכבות התא ולמנוע גירוד התא. תאים יהיה מצופה בצד הזה של coverslip.
2. מעיל צלחות או coverslips עם polylysine 0.5 מ"ג / מ"ל ​​(או פולי-L-ליזין או פולי-D-ליזין מומס חיץ borate; ראה טבלה VI) עבור 2 שעות או למשך הלילה. לשטוף עם מים סטריליים 2-3 פעמים ולאפשר לו להתייבש לחלוטין. הערה: coverslips ממוקמות בצלחת פטרי הידרופובי, כדי למנוע שפיכת / הפצת פתרונות במהלך ציפוי עם ציפוי פולי-ליזין או תא, אשר יכול בקלות להתרחש אם coverslips ממוקמים מנות בתרבית רקמה.
3. היכונו לנתיחה עצביים כמו לנתיחה גליה (שלב 1.1). להרדים חולדה 17 יום בהריון, תרסיס פרווה עם 70% אתנול, ו לחתוך מדיאלית דרך העור ולחשוף את הרחם. הסר את כל העוברים ומניחים אותם בתוך100 מ"מ סטרילי תבשיל.
4. במהירות לנתח בחינם, לערוף כל העובר, הצבת כל הראש בצלחת שלו 60 מ"מ שלו עם המדיום לנתיחה קר (4 מ"ל). בדרך כלל אנחנו עוברים לנתח 4-5 לכל הניסוי כפי כ -20 מיליון נוירונים נגזרות כל העובר E17. אם עוברים יותר יש צורך, לוודא כי ההליך כולו (משלב 3.4-3.12) לא יותר מ 9-10 דקות האחרונות.
5. שימוש stereomicroscope ו No.1/No.5 מלקחיים לבודד את הקורטקס המוחי על ידי משיכת לפתוח את עור הגולגולת, להוציא את המוח, להפריד את האונות, והסרה של המוח התיכון ואת קרומי המוח.
6. לאסוף את כל הקורטקס גזור בצלחת 60 מ"מ עם טרי בינוני לנתיחה קרים, לקצץ את הרקמה במספריים מעוגלים לתוך חתיכות ~ 1 מ"מ.
7. העברת רקמה טחון לצינור 15 מ"ל סטרילי. תביאו את נפח 4.5 מ"ל עם מדיום לנתיחה קר להוסיף 500 μL טריפסין של 2.5%. לעטוף את הצינורית Parafilm ולצוף אותו לאמבטיה מים 36 מעלות צלזיוס במשך 15 minuTES, על ידי היפוך ערבוב כל 5 דקות.
8. העברת רקמה לצינור 15 מ"ל חדש, צמצום נפח בינוני טריפסין המכילים לנתיחה נשאו מעל. מביאים 4.8 מ"ל עם מדיום לנתיחה טריים להוסיף 200 DNase μL להגיע הריכוז הסופי של 60 UG / mL. Triturate בערך 10 פעמים עם פיפטה סטרילית 5 מ"ל או 2; לחזור על פעולה זו לפי הצורך באמצעות אש מלוטש (קר) פיפטה פסטר לנתק ביותר של הרקמה. ואז לאפשר שנותרו חתיכות של רקמות (בדרך כלל מעטים מאוד, אם בכלל) להתפשר על 4-5 דקות.
9. הסר את ההשעיה העליון מתא בודד תוך השארת חלקים התיישבו של רקמות, המקום הזה פתרון צינור חדש עם נפח שווה של בינוני ציפוי נוירון (ראה טבלה III). מערבבים היטב אך בעדינות, ואז לספור את התאים; הצלחת על 15 coverslips מ"מ (35,000 תאים כל μL 200) או 60 מנות מ"מ (1x10 ⁶ תאים למ"ל כל 3) לפי הצורך. העברת התאים אל האינקובטור (36.5 ° C, CO2 50-10%).
10. לאחר 3-4 שעות COMBIN דואר שכבת הנוירון ואת גליה משני כדלקמן. עבור נוירונים על 60 מנות מ"מ, לשטוף את התאים עם DMEM חם, לשנות את בינוני עד 4mL של המדיום החופשי בדם (N2, ראה טבלה IV), וכן להוסיף thermanox עם גליה על כל צלחת (ותאי גלייה צריך להיות מול נוירונים). עבור coverslips העצבית, 3-5 להעביר coverslips אל כל מנה 60 מ"מ של גליה משנית, עם הנוירונים כלפי מטה.
11. 24 שעות לאחר ציפוי הנוירונים, להוסיף 10 מיקרומטר של ציטוזין-β-D-arabinofuranoside על כל מנה, על מנת למנוע התפשטות גליה. אנחנו מכינים 4 מניות פתרונות מ"מ, לדלל 1:10 עם המדיום N2, ולהוסיף 25 UL / mL של תמיסת בדילול אל כל מנה.
12. תאים משמשים בדרך כלל עבור ניסויים לאחר 7-10 ימים בתרבות, למרות הזמן המדויק תלוי בשלב בידול הרצוי, הם כבר גדל עד 4 שבועות ללא ירידה משמעותית בהישרדות. אחרי השבוע הראשון, מומלץ כי מחצית הנפח של התקשורת להיות מוחלף מדי שבוע.

= "Jove_title"> 4. נציג תוצאות:

כמה שעות לאחר נוירונים יש מצורף המצע, הם מתחילים להאריך lamelliopodia. תהליכים ממשיכים להאריך (איור 2 א) ו לקטב על פני כמה ימים בתרבות, ואת האקסונים המורחבת הדנדריטים נראים בבירור (איור 2B; MAP2 מכתים). כאשר נוירונים בוגרים סוכות דנדריטים הופכים מורכבים יותר, הם מפתחים קשרים סינפטיים, כ 2-3 שבועות לאחר ציפוי הקוצים הדנדריטים רבים גלויים (איור 2 ג) ^11.

באיור 1. תרשים זרימה של הליך עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing יחד עם שכבת מזין גליה (גליה משנית). ראשית, 11 ימים לפני לנתיחה העצבית, תרבות גליה העיקרי הוא מוכן מן החולדות הילוד (P2-4). כאשר התאים הם ומחוברות (בערך תשעה ימים אחרי ציפוי גליה יסודי יומיים לפני לנתיחה עצבי), האסטרוציטים הם mechמופרדים anically מתאי מבשר oligodendrocyte ו microglia ו מצופה או על כלים או thermanox (גליה משנית). נוירונים מתקבלים אז מן הקורטקס של E17 עוברים מצופה או על coverslips או על מנות (מצופה poly-ליזין). ארבע שעות לאחר ציפוי, השכבה העצבית מתווסף גליה המשני.

איור 2 דוגמאות של תרבויות בשלבים שונים (לדוגמא: 5 שעות, 12 DIV: DIV 21).. הנתונים הם תמונות של נוירונים בקליפת המוח נציג על coverslips בנקודות זמן שונות. לאחר נוירונים לצרף את הנוירונים המצע להתחיל להרחיב lamelliopodia. בניגוד שלב בתמונה מראה neurites המורחבת חמש שעות ספורות לאחר ציפוי (A). התמונה באמצע (B, מ קוק et al. 2010, עם רשות) מראה 12 נוירונים בקליפת המוח DIV קבוע immunostained עם הסמן דנדריטים עצביים MAP2. מכתים Hoechst שימש counterstaiנינג. כאשר נוירונים בוגרים הקוצים הדנדריטים וגם להיות גלוי (C). ברים סולם: A, B = 25 מיקרומטר; C = 10 מיקרומטר.

פרוטוקול זה מספק שיטה עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing העיקרי בנוכחות תאים גליה, תוך מתן אפשרות לתאי העצב להיות מבודד בקלות לניתוח ניסיוני. תמיכה גליה התפתחות פנוטיפ בריא העצבית, בעוד תגובות עצביות ויסות גם טיפולים ניסיוניים באופן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, על ידי passaging גליה ראשוני לפני culturing עם הנוירונים אוכלוסיה זו התא הופך מועשר סלקטיבי האסטרוציטים, ובכך למנוע גירוי דלקתי microglial. עבור סוגים מסוימים של ניסויים, עם זאת, הפרופורציות שונות ותאי גלייה עשוי להיות הרצוי, ובכך תרבויות גליה נוספות ניתן לבצע כדי לייעל את הרכב הסלולר. פרוטוקול זה יכול להיות גם מותאם נוירונים culturing שמקורם באזורים אחרים במוח, כמו בהיפוקמפוס, כדי להתאים לדרישות הניסוי בפרט

החששות העיקריים של שיטה זו כוללים מניעת המשך חיידקיamination ומניעת התפשטות גליה לתוך שכבת עצביים. מערכת זו אינה כוללת סוכנים אנטיביוטי, ולכן טכניקות סטרילי הם קריטיים במיוחד בכל השלבים. התפשטות גליה נמנעת על ידי תוספת של סוכן אנטי mitotic ציטוסין arabinofuranoside, ציפוי צפיפות נמוכה המדיום בסרום ללא תרבות; הבאה זה האסטרוציטים הפרוטוקול צריך להלחין לא יותר מ 3-5% מכלל התאים של השכבה העצבית ^1,4 ופחות מ -1% microglia צריך להיות מזוהה. Immunopanning או טכניקות אחרות ניתן להשתמש כדי להסיר אפילו זה זיהום גליה נמוך ^4.

טכניקה זו יכולה גם להיות שונה עבור מגוון כל שיתוף culturing של סוגי תאים חסיד כאשר לבודד סוג אחד לניתוח רצוי. לדוגמה, מערכת זו הותאמה בהצלחה לניתוח ההשפעות של osteoblasts על Ca ^{2 +} איתות עצם גרורתית תאים סרטניים ^14.

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

המחברים מודים לחברי מעבדה קודמות שתרמו עידון של פרוטוקול זה, ה-NIH על התמיכה לאורך השנים (DA19808 ו DA15014 ל OM). אנה אבט ¹ הוא עמית של "אימון המחקר הבינתחומי Translational ב neuroAIDS" (T32-MH078795), ולכן עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים תחת רות ל 'פרס Kirschstein הלאומית למחקר שירות 5T32MH079785.