二层共培养小学的大鼠皮层神经元和神经胶质

在这里，我们培养大鼠皮层神经元胶质滋养层的存在提供了一个协议。培养的神经元建立极性和创建的突触，可以用于各种应用，如电生理，钙成像，细胞存活率检测，免疫细胞化学，和RNA / DNA /蛋白分离，神经胶质细胞的分离。

此影片将引导您通过培养大鼠皮层神经元胶质滋养层，称为一个二层或联合培养模式系统的存在的过程。该系统适用于各种需要的玻璃或塑料增长基板的实验需要，也可以用于其他类型的神经元的文化。

从后期的胚胎阶段（E17）中获得的大鼠皮层神经元均镀上盖玻片或组织培养皿中的神经胶质细胞饲养层菜肴或塑料盖玻片 （作为Thermanox），分别增长面临。具体的实验使用的技术，这可能需要，或不取决于两种配置的选择，即神经元生长在玻璃上（如钙成像与免疫印迹）。胶质细胞饲养层，混合胶质细胞星形胶质细胞，丰富了中学文化，分别是准备前的神经元新生幼鼠皮层（P2 - 4）清扫。

这个文化系统的一个主要优势相比，神经元的文化不仅是神经细胞生长，生存，从胶质滋养层，更准确地类似于大脑体内环境分泌的营养因子提供差异化的支持。此外，共培养可用于研究神经胶质细胞相互作用^1。

与此同时，神经胶质细胞在神经元层的污染，是防止不同的手段，几乎是纯的神经元层（低密度文化，除了有丝分裂抑制剂，缺乏血清和使用优化培养基^），可比其他方法1 ^-3。胶质层神经元可以很容易地分离过程中随时文化和不同实验应用^范围从5，生物化学，细胞和^分子生物学^5-8电4，成像和麦克风使用roscopy ^{4,6,7,9,10。}主要的神经元的延长轴突和树突，形成功能性^突触的11，这是不是在神经细胞株的观察过程中，虽然一些细胞系扩展过程。

使用这种合作培养体系，培养大鼠海马神经元的一个详细的协议已被描述^以前 4,12,13 。在这里，我们详细的修改协议，适合皮层神经元。从每只大鼠胚胎回收约20 × 10 ⁶细胞，这种方法特别适用于需要大量的神经元（但不是一个高度同质的神经元群）的实验是有用的。编制的神经元和神经胶质细胞需要在一个具体时间的方式的计划。我们将提供一步一步培养大鼠皮层神经元的协议，以及培养的神经胶质细胞支持神经元。

1。神经胶质细胞夹层（1〜2周电镀前神经元）

1. 要准备无菌工具清扫的地方，70％的乙醇，添加4毫升冷夹层中等至60毫米的菜（每一个脑盘），和2.5％胰蛋白酶和DNase冰解冻（见第六表的手术工具的详细信息）。
2. 使用大剪刀杀头100毫米的无菌培养皿中的2-4日龄仔兔和地方首长。
3. 使用介质剪刀通过皮肤中线切割和拉背部皮肤暴露的头骨。使用弯曲的剪刀中线切割和通过头骨的两个侧削减，使不损害脑组织下方。拆下上部的头骨，大脑暴露。
4. 提取的大脑，并放置在自己的60毫米，含4毫升冷夹层介质的菜（我看到的成分表）。将盘放在立体显微镜下（2000年徕卡变焦，变焦控制：7-30），并使用5号钳的半球分开，取出脑，剥离ØFF脑膜。
5. 收集在一个新的60毫米冷夹层介质菜的所有解剖的脑皮层，并直言不讳地用弯剪刀组织。
6. 肉末组织转移到无菌的15 mL试管。把4.5毫升的冷夹层介质的体积，并加入500微升2.5％胰蛋白酶。包装在封口膜管和漂浮在37℃水浴15分钟，每5分钟颠倒混合。

   （注：在这里，我们描述了协议，我们一般使用最多5动脑筋时，如果使用更多的幼仔，卷可能需要进行适当调整）

7. 组织转移到一个新的15毫升管，最大限度地减少含有胰蛋白酶清扫结转中等量。到4.8mL带来新鲜夹层介质的体积和添加200μL的DNA酶终浓度达到60微克/毫升（原液：3毫克的DNase和硫酸镁5毫克2毫升夹层介质）。 5毫升无菌吸管轻轻磨碎〜20倍TE神经胶质电镀液，再加入10毫升（成分表二）。
8. 允许组织的大块定居为4-5分钟，然后80％的细胞悬液转移至50ml管。重复一个额外的神经胶质电镀液2-3毫升（并使用一个较小的吸管如果需要的话）的组织trituration;再次，让组织来解决，并添加80％到以前的集合。神经胶质细胞电镀液和离心15分钟在280总量带来的20毫升克（或在IEC CENTRA CL2的离心机1300 RPM）。
9. 吸上清，重悬细胞沉淀在神经胶质细胞电镀液（大约用5-7毫升，取决于使用的幼仔数量），然后再添加额外的电镀液，以每个解剖的大脑有10毫升。搅拌均匀，板，每75厘米^的 2瓶（即每一个烧瓶脑）10 ml的细胞悬液。
10. 将培养瓶中孵化器设置在37 ° C（5至10％的二氧化碳;比例的钠bicarbonaTE内容的介质）。更改后24-48小时，然后每隔3-4天的培养基。

2。中学胶质电镀前神经元（48小时）

1. 准备加入3 paraplast蜡融化的小滴周围的每个清洗和灭菌thermanox圆周thermanox盖玻片（如神经元将被镀上的菜肴）。细胞将被镀上这一侧thermanox。我们thermanox是手工制作的可重用〜60毫米刀片切钻通〜50毫米的孔（见表六试剂）从塑料，虽然市售的文化以及插入可能被用来代替。
2. 洗净，主要的神经胶质细胞，PBS洗涤2次，大力摇晃每个烧瓶，以消除任何独立的细胞。每个烧瓶与融合的主要神经胶质细胞，将提供约10万星形胶质细胞，因此，我们经常使用2-4实验烧瓶。
3. 细胞分离tryspin - EDTA（1 mL10X 0.5％胰蛋白酶- EDTA原液9毫升的PBS稀释）为0.05％。 Combi机NE细胞从2烧瓶，并添加到一个50 mL锥形管等量的神经胶质细胞电镀液（见试剂表二）。离心15分钟，在280克吸弃上清液，并溶解在几毫升的神经胶质细胞电镀液的神经胶质沉淀。
4. 计数细胞，使用hematocytometer和稀释细胞悬液（〜1 × ¹⁰ 6细胞/ mL）;板60毫米菜（如神经元将被镀上盖玻片）， 或 thermanox盖玻片（细胞，如果神经元将镀上60毫米的菜肴）。细胞应该是镀在使用神经胶质细胞电镀液，每盘或thermanox 50细胞。 thermanox盖玻片，板600μL细胞在滴加的方式，然后2小时后翻转thermanox淹没细胞和神经胶质细胞电镀液的情况下。
5. 如果准备次要的神经胶质细胞神经​​元盖玻片60 mm培养皿，改变介质N2.1晚上前神经剥离。

3。神经解剖与文化

1. 准备每个无菌盖玻片的周长增加约3 paraplast蜡融化的小滴，以物理上独立的细胞层，防止细胞刮盖玻片（直径15毫米）。细胞将被镀上盖玻片的这一边。
2. 涂层板或盖玻片与0.5 mg / mL的聚赖氨酸（无论是聚- L -赖氨酸或D -聚赖氨酸的硼酸盐缓冲液溶解;见表六），2小时或过夜。用无菌水冲洗2-3次，并允许完全干燥。注：盖玻片放置在疏水培养皿，以避免溢出/传播与多聚赖氨酸或细胞电镀，可以很容易地发生在组织培养皿中的盖玻片在涂层过程中的解决方案。
3. 准备为神经剥离的神经胶质细胞夹层（步骤1.1）。安乐死一个为期17天的孕鼠，喷用70％乙醇的皮毛，并穿过内侧的皮肤暴露子宫。删除所有的胎儿，并将其放置在无菌100毫米菜。
4. 迅速解剖自由和杀头每个胎儿，用冷夹层介质（4毫升）每头放置在自己的60毫米菜。我们正常解剖实验，每4-5个胎儿，约20万个神经元，从每个E17胎儿派生。如果需要更多的胚胎，确保整个过程（从3.4至3.12步）不超过90-100分钟。
5. 使用立体显微镜，No.1/No.5镊子隔离拉动皮肤和颅骨开放，提取大脑半球分离，去除脑和脑膜脑皮层。
6. 收集在一个新的60毫米冷夹层介质菜的所有解剖皮层，并直言不讳地用弯剪刀组织成〜1毫米件。
7. 肉末组织转移到无菌的15 mL试管。把4.5毫升的冷夹层介质的体积，并加入500微升2.5％胰蛋白酶。包装在封口膜管和漂浮在36℃水浴15阿米努工商业污水附加费，颠倒混合，每5分钟。
8. 组织转移到一个新的15毫升管，最大限度地减少含有胰蛋白酶清扫结转中等量。置于4.8毫升新鲜夹层介质，添加200μL的DNA酶达到终浓度为60微克/毫升。磨碎，用无菌的5或2毫升吸管大约10倍;重复使用一个火抛光（冷）的巴斯德吸管游离于组织的这一必要步骤。然后让组织的剩余件（一般很少，如果有的话）解决4-5分钟。
9. 拆下上部的单细胞悬液，同时落户件组织背后的离开，并将其放置在一个新的管的神经元电镀液等体积（见表三）解决方案。而是轻轻拌匀，然后在细胞计数板15毫米的盖玻片（35000细胞200μL）或60（1 × ¹⁰ 6细胞每3毫升）mm培养皿需要。转移细胞培养箱（36.5℃，5-10％CO2）。
10. 经过3-4小时的COMBINE的神经元层和继发胶质细胞如下。 60 mm培养皿中神经元，用温暖的DMEM细胞，改变介质的无血清培养液4ml（氮气，见表四），并添加一个神经胶质细胞thermanox每块板（神经胶质细胞，应面临的神经元）。对于神经细胞的盖玻片，转让3至5盖玻片到每个盘60毫米二级神经胶质细胞，神经元朝下。
11. 电镀后24小时内的神经元，每道菜添加胞嘧啶-β- D - arabinofuranoside 10微米，为了防止神经胶质细胞的增殖。我们准备4毫米库存解决方案，用氮气中等稀释的1:10，并添加25 UL / mL的稀释液，每道菜。
12. 一般用于细胞实验后7-10天在文化，虽然确切的时间取决于所需的分化阶段，他们已经成长为没有生存的显著减少至4个星期。第一个星期后，这是建议媒体的二分之一量，每周更换一次。

4。代表性的成果：

几个小时后的神经元连接到基板，他们开始扩展lamelliopodia。进程继续拉长（图2A），过几天在文化和两极化，并延伸的轴突和树突清晰可见（图2B; MAP2染色）。由于神经细胞成熟树突状乔木变得更加详尽和发展突触联系;电镀许多树突棘后约2-3周可见（图^2C）11。

图1。培养大鼠皮层神经元与胶质细胞的饲养层（二级神经胶质细胞）的程序流程图。首先，11天前神经清扫，一个主要的神经胶质细胞文化是准备从新生大鼠（P2 - 4）。当细胞融合（大约9天前神经剥离的主要神经胶质细胞和两天后电镀），星形胶质细胞是机甲anically少突胶质前体细胞和小胶质细胞和菜肴或thermanox镀要么（二级神经胶质细胞）分离。从E17的胚胎和菜（涂多聚赖氨酸）盖玻片或镀的皮层神经元，然后获得。电镀后4小时，神经细胞层被添加到次要的神经胶质细胞。

图2在不同阶段的文化的例子（如5小时，12格，21格）。数字盖玻片上的皮层神经元在不同时间点的代表图像。后神经细胞附着于基材的神经元开始延长lamelliopodia。相衬图像显示了一些电镀后5小时延长突起（一）。 （B，从库克等人，2010年，经许可）在中间的图像显示12格的固定和皮层神经元与神经元的树突状标记MAP2免疫染色。 Hoechst染色被用来作为一个counterstai宁。由于神经细胞成熟的树突棘，也成为可见（C）。标尺：A，B = 25微米，C = 10微米。

该协议提供了一个方法培养大鼠原代皮质神经元的神经胶质细胞的存在，同时使神经元容易被孤立的实验分析。一个健康的神经细胞表型的神经胶质细胞支持发展，同时也调节神经元的反应，在生理相关的方式的试验性治疗。此外，传代之前，培养这种细胞群成为在星形胶质细胞的选择性丰富与神经元的主要神经胶质细胞，从而阻止炎症的小胶质细胞的刺激。然而，对于某些类型的实验，可能所需的不同比例的神经胶质细胞，从而额外的神经胶质细胞培养可进行优化这种细胞成分。此协议也可能适用于来自其他脑区的培养神经元，如海马，以适应特定的实验要求

这项技术的主要问题包括防止细菌续氨化和防止进入神经元层的神经胶质增生。该系统不包括抗生素，无菌技术，特别是在各阶段的关键。神经胶质增生是预防的抗有丝分裂剂，低密度电镀和无血清培养基胞嘧啶arabinofuranoside此外，此协议的星形胶质细胞后，应撰写不超过3-5％的细胞在神经^元层1,4应检测和小于1％的小胶质细胞。 Immunopanning或其他技术可用于去除，即使这样低的神经胶质细胞污染^4。

这种技术还可以被修改为共培养各种贴壁细胞类型的任何隔离单一类型进行分析时，是可取的。例如，该系统成功地改编为成骨细胞的影响分析的Ca ^{2 +}信号在骨转移性癌细胞^14。

没有利益冲突的声明。

作者感谢以前的实验室成员谁促成了这个协议的细化和国立卫生研究院（DA19808，DA15014到OM）多年来的支持。安娜阿布特^1“在neuroAIDS跨学科和转化研究训练”（T32 - MH078795）研究员;因此，这项工作是支持部分露丝属Kirschstein国家研究服务奖5T32MH079785下由美国国立卫生研究院。