בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

זה פרוטוקול וידאו מדגים את שיטת assay neurosphere ליצור ולהרחיב בתאי גזע עצביים מן האזור עכבר מבוגר periventricular, ומספק תובנות טכניות על מנת להבטיח ניתן להשיג תרבויות neurosphere לשחזור.

בידוד והתרחבות של תאים המשוערת גזע עצביים (NSCs) מהמוח Murine מבוגר תוארה לראשונה בשנת 1992 על ידי ריינולדס וייס העסקת הגדרה כימית סרום ללא מערכת התרבות המכונה assay neurosphere (NSA). ב assay זה, רוב סוגי תאים מובחנים למות בתוך ימים ספורים של תרבות אלא אוכלוסייה קטנה של גורם הגדילה התאים מגיבים מבשר לעבור התפשטות פעיל בנוכחותו של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו / צמיחה בסיסי גורם fibroblastic (bFGF). תאים אלה יוצרים מושבות של תאים שלא עברו התמיינות בשם neurospheres, אשר בתורו יכול להיות subcultured כדי להרחיב את מאגר בתאי גזע עצביים. יתר על כן, התאים יכול להיגרם להבדיל, שהניבו את שלושת סוגי התאים העיקריים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית, כלומר האסטרוציטים, ו oligodendrocytes. Assay זה מספק כלי רב ערך כדי לספק מקור עקבי, מתחדשת של מבשרי CNS מובחן, אשר יכול לשמש עבור במבחנה וגם למטרות טיפוליות.

וידאו זה מדגים את שיטת NSA ליצור ולהרחיב NSCs מן האזור עכבר מבוגר periventricular, ומספק תובנות טכניות על מנת להבטיח ניתן להשיג תרבויות neurosphere לשחזור. ההליך כולל קצירת המוח של העכבר הבוגרת, מיקרו דיסקציה של האזור periventricular, הכנת הרקמה והתרבות של NSA. הרקמה שנקטפו הוא הראשון מתעכל כימית באמצעות טריפסין-EDTA ולאחר מכן ניתק מכני בינוני NSC להשיג ההשעיה תא יחיד מצופה לבסוף ב NSA. לאחר 7-10 ימים תרבות, neurospheres העיקרי הנובע מוכנים תת להגיע כמות התאים הנדרשת בניסויים עתידיים.

חלק 1: מערכת בסיסית עד לפני שתמשיך לנתיחה:

1. נפח מתאים של המדיום המל"ל להשלים הוא מוכן על ידי ערבוב NeuroCult בינוני NSC הבסיס, NeuroCult NSC תוספי הפצת ביחס 9:01 בהתאמה. בינוני NSC אפשר גם במעבדה מבוסס על הרכב הצמיחה NSC בינוני שפורסמו בספרות ¹. אם המעבדה שלך אין הרבה ניסיון עם ביצוע בינוני, אנו ממליצים בחום להשתמש בינוני זמינים מסחרית, כי כבר נשלט על איכות לצמיחה NSCs לפני נמכרים (שהוא במקרה NeuroCult, תא גזע Technolgies).
2. המדיום הוא התחמם בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
3. הקרה HEPES שנאגרו מדיום חיוני מינימום (שולי) עם ריכוז גבוה של אנטיביוטיקה (10%) מוכן לנתיחה ומטרה כביסה. לחלופין, המדיום NSC הבסיס עם תוספת אנטיביוטיקה עשוי לשמש גם למטרה זו.
4. 30-40 מ"ל של שולי קר המכילות אנטיביוטיקה הוא חילק לתוך צינורות 50 מ"ל סטרילי עבור אוסף המוח.
5. מספר פלסטיק 10 ס"מ צלחות פטרי יש צורך להחזיק את המוח במהלך דיסקציה ואחד זכוכית סטרילית 10 ס"מ צלחת פטרי להחזיק רקמות גזור.
6. כלים כירורגיים צורך להסיר את המוח (מספריים גדולים, מספריים קטנים ומחודדים, מלקחיים גדולים, מלקחיים מעוקל קטן, מרית קטנה) או לנתיחה רקמות (מלקחיים קטנים, מלקחיים בסדר מעוקלות, אזמל) הם מעוקרים באמצעות חרוז זכוכית מעקר ב 250 ° C או אחר שיטות החיטוי זמין.
7. מיקרוסקופ Dissection הוא ניגב עם אלכוהול 70% ולהקים בתוך מכסה המנוע PC2.

חלק 2: מסיק עכבר מבוגר המוח מיקרו לנתיחה:

1. 2-4 בוגרים (5-8 שבועות) בעכברים מורדמים על פי פרוטוקול חיה מוסדיים אחד אושרה באמצעות 3-4% isoflurane או בזריקה תוך הצפק של pentobarbital (120 מ"ג / ק"ג).
2. פריקה צוואר הרחם מתבצעת על מנת לוודא החיה אינה סובלת כאב ומצוקה.
3. עכבר הרדים מונח על הבטן שלו על נייר סופג רקמות, וראש היא שטפה עם אתנול 70% לחטא את האזור.
4. מספריים גדולים המשמשים לערוף את החיה רק ​​מעל אזור חוט השדרה הצווארי.
5. מספריים הצביע קטנים משמשים כדי להפוך קיצוץ הזנב-חציון מקורי ולחשוף את הגולגולת.
6. לחתוך קצוות של העור משמשים כדי להחזיק את הראש ולאחר מכן כל להב של מספריים קטנים ממוקם חלל כל מסלולית לעשות חתך העטרה בין ארובות העיניים.
7. שימוש מגנום foramen כנקודת כניסה, חתך אורכי נעשית דרך הגולגולת לאורך תפר sagittal ושני חתכים לרוחב עשויים גם בצומת של קירות לרוחב ובסיס הגולגולת. יש לנקוט זהירות לא לפגוע בבסיס המוח על ידי ביצוע חתכים קטנים ולהבטיח את הזווית של הלהבים שטחית ככל האפשר.
8. הגולגולת שמעל כל האונה נתפסת ומקולף החוצה באמצעות מלקחיים מעוקל לחשוף את המוח, ואז בעזרת מרית הרטובות קטן, המוח הוא אסף לתוך צינור המכיל 50 מ"ל שולי.
9. הליך זה חוזר על עצמו עד שכל המוחות כבר נקצרו.
10. המוח מועברים למכסה המנוע PC2 ורחץ שלוש פעמים עם נפח מספיק של שולי סטרילי קר להסרת מזהמים אפשריים כמו דם ושיער. המוח מועברים לאחר מכן צלחת פטרי המכילה 10 ס"מ שולי.
11. כדי לנתח את האזור periventricular forebrain, תבשיל המכיל את המוח ממוקמת מתחת למיקרוסקופ לנתח עם בהגדלה נמוכה. המוח ממוקמות על פני השטח ואז שטוח הגחון שלהם והחזיקו מהצד הזנב באמצעות מלקחיים מעוקל בסדר. סט נוסף של מלקחיים מעוקל משמש כדי להסיר את נורות חוש הריח.
12. לאחר הסרה של נורות חוש הריח, המוח הם לסובב כדי לחשוף את הפן הגחון.
13. 90 ° לחתוך העטרה נעשית ברמה של התצלובת הראייה ואת ההיבטים הזנב של המוח מבוטלים.
14. הליך זה חוזר על עצמו עד שכל כולם מחולק.
15. בהגדלה גבוהה יותר, את ההיבטים מקורי של המוח הם מסובבים כך את פני השטח חתך הפנים כלפי מעלה. ראשית, מחצה מוסר וזנוח באמצעות קנס מעוקל מיקרו מספריים או מעוקל, מלקחיים הצביע, ואז שכבה דקה של הרקמה הסובבת את הקיר לרוחב של החדרים הוא חתך, למעט parenchyma striatal את כפיס המוח. רקמה היא גזור נקווה צלחת זכוכית סטרילית 10 ס"מ פטרי.
16. הליך זה חוזר על עצמו עד מוח כל מיקרו גזור.

חלק 3: הכנת רקמות ותאי ציפוי:

1. הרקמה ונקווה הוא טחון כ 1-2 דקות בעזרת להב סכין המנתחים, רק עד חלקים קטנים מאוד להישאר.
2. בנפח כולל של 3 מ"ל של% 0.05-EDTA טריפסין משמש וכל הרקמות טחון מועבר לתוך שפופרת 15 מ"ל. 3ml טריפסין-EDTA מספיק לעיכול טוב של רקמות קוצרים עד 8 בעכברים.
3. צינור הוא מודגרות 7 דקות בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
4. בסוף הדגירה האנזימטית, הצינור הוא חזר אל מכסה המנוע בנפח שווה של מעכבי טריפסין סויה מתווסף להפסיק פעילות טריפסין.
5. ההשעיה היא pipetted מעלה ומטה כדי להבטיח איון טריפסין ו pelleted מכן על ידי צנטריפוגה בסל"ד 700 (110 גרם) של 5min.
6. Supernatant נמחקת, ואת פיסות רקמה resuspended ב 150 μl של המדיום NSC סטרילי הבסיס. איפוס פיפטה כדי μl 200, גושים הם ניתק ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה (3-7 פעמים) עד ההשעיה חלק חלבי תא בודד מושגת. מספר צעדים pippetting ישירות תלוי בגודל של חלקיקים ברקמה טחון (עדיף לקצץ את הרקמה לחתיכות קטנות מאוד כדי להגדיל את שטח הפנים על פעילות טריפסין). ניתוק מכני ארוך נמרצת עשויה להוביל להיווצרות כדור מופחת בשל גזע עצביים של התא למוות אב.
7. כדי להסיר פסולת בלתי ניתק חתיכות, הבסיס בינוני NSC מתווסף ההשעיה התא ניתק להגיע בנפח כולל של 10-15 מ"ל. ההשעיה התא עובר דרך מסננת תא 40μm לתוך צינור בגודל המתאים, pelleted מכן על ידי צנטריפוגה בסל"ד 700 (110 גרם) עבור 5min.
8. כדי להמשיך להסיר את הפסולת, מומלץ resuspend גלולה ב 10-15 מ"ל של מדיום NSC ו צנטריפוגות ההשעיה תא בסל"ד 700 (110 גרם) של 5min.
9. Supernatant נמחקת. ואז התאים resuspended בנפח בינוני המתאים המל"ל להשלים בתוספת 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF ו 1μl/ml של הפרין 0.2%.
10. רקמה ניתק ממוח אחד מוכנס לתוך בקבוק one T25 (המכיל 5 מ"ל של מדיום שלם). התאים מודגרת אז 37 ° C CO, 5% ₂ במשך 7-10 ימים על ידי אשר neurospheres זמן צריך יצרו. רקמות שנקטפו ממוח אחד יכול לייצר בדרך כלל 400-600 neurospheres.

חלק 4: Passaging והרחבת NSCs:

1. כאשר neurospheres מוכנים תת (150-200 מיקרומטר קוטר), בינוני עם תחומי מושעה יוסר צלוחיות, להציב צינור סטרילי המתאים לגודל רקמת תרבות, centrifuged על 700 סל"ד (110 גרם) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
2. Supernatant נמחקת ואת התחומים הם resuspended ב 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA. לחילופין, ניתן גם neurospheres passaged מכניים או כימיים באמצעות שיטות דיסוציאציה שתוארו בספרות ^2,3.
3. השעיית התא מודגרות על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 2-3 דקות, ולאחר מכן נפח שווה של מעכבי טריפסין סויה משמש כדי לעצור את פעילות טריפסין.
4. השעיה התא pipetted בעדינות מעלה ומטה כדי להבטיח את טריפסין כבר מומת לחלוטין.
5. השעיה התא centrifuged בסל"ד 700 דקות 5. ואז, supernatant היא להסיר את התאים הם resuspended ב 1 מ"ל של מדיום המל"ל.
6. 10μl ההשעיה התא הוא מעורבב עם 90μl של trypan כחול לבצע ספירת תאים.
7. התאים מצופה בריכוז של 5x10 ⁴ תאים / מ"ל ​​במדיום המל"ל להשלים בתוספת 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF ו 1μl/ml הפרין של 0.2% בשנת בקבוק בגודל המתאים רקמה תרבות. השתמש בינוני 5 מ"ל ל 20 מ"ל T25, T75 עבור מ"ל ו - 40 עבור T175 צלוחיות.
8. Neurospheres משניות נוצרות 5-7 ימים כאשר מודגרות על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם CO 5% ₂.

חלק 5: תוצאות נציג:

בתרבות העיקרי NSC מבוגר, הרוב המכריע של התאים ימותו לאחר 2-3 ימים אך גורם גדילה מבשר מגיבים (כולל בתאי גזע אב) התאים יתרבו (איור 1) וליצור מושבות של תאים שלא עברו התמיינות לאחר 6-8 ימים. בתרבויות אלה כמות משמעותית של פסולת בדרך כלל להציג שעשוי לרכוש צורה כדורית, והוא יכול להיות בטעות neurospheres. כמות פסולת תלויה ישירות דיסקציה מיקרו והכנת טכניקות רקמה. Neurospheres נכון הם שלב בהיר (זוהר) ולהיות כדורית יותר מגדילה גודל (ראה וידאו). לאחר 7-10 ימים, הכדורים חייבים להיות מעוגל אך לא דחוס, ויש למדוד בין 150 ל -200 מיקרומטר וגם צריך נוקשה מיקרו קוצים בשולי בהגדלה גבוהה (איור 2). אם neurospheres מותר לגדל גדולים מדי, הם הופכים להיות כהה עקב מוות של תאים במרכז הספירות. Neurospheres גדול שקשה לנתק, ובסופו של דבר להתחיל לצרף המצע להבדיל.

באיור 1. ראשי מבוגר NSC תרבות 3 ימים לאחר ציפוי. חצים מראים מושבות קטנות של NSCs שגשוג. הגדלה מקורי; 20x.

באיור 2. קטע אחד מבוגר neurosphere 7 ימים לאחר ציפוי. הערה מיקרו קוצים בשולי התחום. הגדלה מקורי; 20x.

Assay neurosphere ² צברה תשומת לב רחבה בקהילה המחקר לא רק בידוד המחקר של מערכת העצבים המרכזית NSCs מ ^4-5, אלא גם עבור בידוד של סוגים אחרים של בתאי גזע המשוערת מרקמות רבות, כמו חזה ולב ⁶ ו ⁷ לצורך זיהוי של השד המוח, גידול במעי הגס בתאי גזע ^8-9 טוען כי מערכת זו תרבות ניתן ליישם מספר גופניות הגידול תא מבשר אוכלוסיות בכל הגוף. חלק מן היתרונות של שיטה זו כוללים, בפשטותו reproducibility הדור של מספר בלתי מוגבל של תאים חתיכה קטנה של רקמה או אפילו מספר קטן של תאים בינוניים הגדרה כימית חופשית בסרום.

יודגש כי מספר neurospheres בתרבות אינו מייצג את מספר בתאי גזע כמו neurospheres ניתן לגזור גם מתוך בתום בתאי גזע בתום או יותר ובתאים מוגבלת ^10. בהקשר זה assay פותחה כראוי למנות NSCs בתרבות ^11.

שיטות שונות משמשות כדי לנתק neurospheres לתוך ההשעיה תא יחיד כולל שיטות מכאניות האנזימטית. אמנם שיטה מכנית היא neurosphere המקורי דיסוציאציה שיטה ^2, זה דורש הרבה ניסיון ויעילות שלה משתנה בהתאם למפעיל. שיטה זו גם עלולה לגרום מוות של תאים נזק משמעותי אם להחיל על ידי אדם לא מנוסה, שיכול להקטין את הדיוק של מבחני המסתמכים על neurosphere דיסוציאציה ^3. טריפסין-EDTA דיסוציאציה אנזימטית יש גם כמה יתרונות וחסרונות. דיסוציאציה אנזימתי של neurospheres קל, יעיל לשחזור אם ביצע לאורך המתאים של זמן על neurospheres בגודל הנכון. למרות שאין צד לצד מחקרים משווים את ההשפעה של שתי השיטות של neurosphere דיסוציאציה, הניסיון שלנו מראה כי דגירה קצר (3-5 דקות) של neurospheres (עד 250 מיקרומטר) עם טריפסין-EDTA תוצאות דיסוציאציה יעיל מבלי להפריע יכולות, הכדאיות שגשוג והתמיינות שלהם. מאידך, חשיפה ארוכה של neurospheres (במיוחד עבור neurospheres מגודל גדול) כדי טריפסין-EDTA עלול לגרום נזק חמור קולטנים פני התא, עיכול התא ומוות התא פוטנציאלי. חשיפת יתר טריפסין-EDTA עלול גם להפריע היווצרות כדור ותאי לגרום לצרף המצע להבדיל.

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מקרן אוברסטריט.