L'isolement et expansion des cellules souches neurales de souris adultes utilisant le test Neurosphère

Ce protocole vidéo illustre la méthode de dosage Neurosphère de générer et de développer des cellules souches neurales de la région périventriculaire souris adulte, et donne un aperçu technique afin de garantir l'on peut obtenir des cultures Neurosphère reproductibles.

L'isolement et l'expansion des cellules souches neurales putatifs (CNS) à partir du cerveau adulte murin a été décrite par Reynolds et Weiss en 1992 emploie un système de culture chimiquement défini sans sérum connu comme le test Neurosphère (NSA). Dans cet essai, la majorité des types de cellules différenciées meurent dans les quelques jours de culture, mais une petite population de cellules précurseurs de la croissance des facteurs réactifs subissent une prolifération active, en présence du facteur de croissance épidermique (EGF) et / facteur de croissance basique fibroblastique (bFGF). Ces cellules forment des colonies de cellules indifférenciées appelées neurosphères, qui à leur tour peuvent être repiquées pour élargir le pool de cellules souches neurales. Par ailleurs, les cellules peuvent être induites à se différencier, générant des trois principaux types de cellules des neurones du SNC-dire, les astrocytes et des oligodendrocytes. Ce test fournit un outil précieux pour fournir une approche cohérente, source d'énergie renouvelable des précurseurs du SNC indifférencié, ce qui pourrait être utilisé pour des études in vitro et également à des fins thérapeutiques.

Cette vidéo illustre la méthode la NSA pour générer et développer NSCs de la région périventriculaire souris adulte, et donne un aperçu technique afin de garantir l'on peut obtenir des cultures Neurosphère reproductibles. La procédure comprend la récolte du cerveau de la souris adulte, la micro-dissection de la région périventriculaire, préparation des tissus et la culture dans la NSA. Le tissu est d'abord récolté chimiquement digérés par la trypsine-EDTA et ensuite dissociées mécaniquement dans le milieu de NSC pour parvenir à une suspension cellulaire unique et finalement plaqué dans la NSA. Après 7-10 jours de culture, les neurosphères résultant primaires sont prêts pour la sous-culture pour atteindre la quantité de cellules nécessaires pour de futures expériences.

Partie 1: mettre en place avant de procéder à la dissection:

1. Volume approprié de milieu complet NSC est préparée en mélangeant NeuroCult NSC moyen basale et NeuroCult NSC Suppléments prolifération à un ratio 9:1, respectivement. Moyennes NSC peuvent également être faites dans le laboratoire de base sur la composition du CNS milieu de croissance publiés dans la littérature ¹. Si votre laboratoire ne possède pas beaucoup d'expérience avec prise de moyenne, nous vous recommandons fortement d'utiliser le milieu du commerce qui a été de qualité contrôlée pour la croissance NSCs avant d'être vendus (ce qui est le cas pour NeuroCult, Technolgies de cellules souches).
2. Le milieu est chauffé dans un bain d'eau à 37 ° C.
3. Cold tamponné HEPES milieu essentiel minimum (HEM) à forte concentration d'antibiotiques (10%) est préparé pour la dissection et l'objet à laver. Alternativement, le NSC milieu basal avec une supplémentation en antibiotiques peuvent également être utilisés à cette fin.
30-40 HEM froide contenant des antibiotiques est distribué dans des tubes de 50 ml stériles pour la collecte de cerveau.
4. Plusieurs 10cm en plastique des boîtes de Petri sont nécessaires pour maintenir le cerveau lors de la dissection et un 10cm en verre stérile boîte de Pétri pour tenir les tissus disséqués.
5. Les outils chirurgicaux nécessaires pour enlever le cerveau (gros ciseaux, petits ciseaux pointus, pinces grandes, petites pinces courbes, et une petite spatule) ou pour la dissection des tissus (petite pince, pinces fines courbes, et un scalpel) sont stérilisés à l'aide de billes de verre stérilisateur à 250 ° C ou d'autres méthodes disponibles autoclave.
est lavée à l'alcool 70% et mis en place à l'intérieur du capot de PC2.

Partie 2: Récolte cerveau de souris adultes et des micro-dissection:

1. 2-4 pour adultes (5-8 semaines) les souris sont anesthésiées selon un protocole d'animaux institutionnel approuvé avec 3-4% d'isoflurane ou par injection intra-péritonéale de pentobarbital (120 mg / kg).
col de l'utérus est effectuée pour s'assurer que l'animal ne souffre pas la douleur et la détresse.
2. La souris anesthésiée est posé sur son abdomen sur un papier tissu absorbant, et la tête est rincée avec de l'éthanol à 70% pour stériliser la région.
3. Gros ciseaux sont utilisés pour décapiter l'animal juste au-dessus de la région de la moelle épinière cervicale.
4. Petits ciseaux pointus sont utilisés pour faire une médiane caudale-rostrale couper et d'exposer le crâne.
5. La coupe des bords de la peau sont utilisés pour maintenir la tête et ensuite chaque lame d'un petits ciseaux est placé dans chaque cavité orbitaire pour faire une coupe coronale entre les orbites.
6. Utiliser le foramen magnum comme point d'entrée, une coupe longitudinale est faite à travers le crâne le long de la suture sagittale et deux coupes latérales sont également faites à la jonction des parois latérales et la base du crâne. Des précautions doivent être prises pour ne pas endommager le cerveau sous-jacente en faisant de petites coupures et en assurant l'angle des pales est aussi peu que possible.
7. Le crâne recouvrant chaque hémisphère est saisi et pelées extérieur en utilisant une pince courbe d'exposer le cerveau, puis à l'aide d'une petite spatule mouillée, le cerveau est écopé dans un tube de 50 ml contenant HEM.
8. Cette procédure est répétée jusqu'à ce que tous les cerveaux ont été récoltés.
9. Les cerveaux sont transférés à la cagoule PC2 et lavées trois fois avec un volume suffisant d'HEM stériles froide pour enlever les contaminants possibles comme le sang et les cheveux. Les cerveaux sont ensuite transférés dans une boîte de Petri contenant 10cm HEM.
10. Pour disséquer la région périventriculaire du cerveau antérieur, le plat contenant le cerveau est placé sous la loupe binoculaire à faible grossissement. Les cerveaux sont ensuite positionnés à plat sur leur surface ventrale et détenues par le côté caudale à l'aide des pinces fines courbes. Une autre série de forceps courbe est utilisée pour enlever les bulbes olfactifs.
11. Après l'enlèvement des bulbes olfactifs, les cerveaux sont en rotation pour exposer la face ventrale.
12. Une coupe de 90 ° coronale est faite au niveau du chiasma optique et les aspects caudale du cerveau sont jetés.
13. Cette procédure est répétée jusqu'à ce que tous les cerveaux sont sectionnés.
14. Au plus fort grossissement, les aspects rostrale du cerveau sont tournés afin que la surface de coupe vers le haut. Tout d'abord, le septum est enlevé et jeté à l'aide d'une amende de micro-ciseaux courbes ou courbes, des pinces pointues, et puis la couche mince de tissu entourant la paroi latérale des ventricules est coupé, à l'exclusion du parenchyme striatum et le corps calleux. Tissus disséqués sont regroupées dans un plat en verre 10cm de Pétri stériles.
15. Cette procédure est répétée jusqu'à ce que tous les cerveaux sont des micro-disséqués.

Partie 3: préparation des tissus et cellules plaquage:

1. Le tissu commun est hachée pendant environ 1-2 minutes à l'aide d'un scalpel, jusqu'à ce que de très petits morceaux demeurent.
2. Un volume total de 3 ml de 0,05% de trypsine-EDTA est utilisé et tous les tissus hachés est transféré dans un tube de 15 ml. 3ml trypsine-EDTA est suffisant pour une bonne digestion des tissus récoltés à partir de 8 souris.
3. Le tube est incubé pendant 7 min dans un bain d'eau à 37 ° C.
4. A la fin de l'incubation enzymatique, le tube est retourné à la cagoule et un volume égal d'inhibiteur de trypsine de soja est ajouté pour arrêter l'activité trypsine.
5. La suspension est pipeté haut et bas pour assurer l'inactivation de la trypsine et ensuite sédimentées par centrifugation à 700 rpm (110 g) pendant 5 min.
6. Le surnageant est éliminé, et les morceaux de tissus sont remis en suspension dans 150 ul de milieu de base stérile NSC. Réinitialisation de la pipette à 200 pi, les mottes sont dissociées par un léger pipetage haut et en bas (3-7 fois) jusqu'à une surface lisse suspension laiteuse seule cellule est atteint. Le nombre d'étapes pippetting dépend directement de la taille des particules dans les tissus hachés (il est préférable de hacher les tissus en très petits morceaux afin d'augmenter la surface d'activité de la trypsine). De longs et vigoureux dissociation mécanique pourrait conduire à la formation de la sphère réduite en raison de souches neurales et de la mort de cellules progénitrices.
7. Pour enlever les débris et non dissociée pièces, basale moyenne NSC est ajouté à la suspension de cellules dissociées pour atteindre un volume total de 10-15ml. La suspension cellulaire est passé à travers une passoire cellules 40μm dans un tube de taille appropriée, puis sédimentées par centrifugation à 700 rpm (110 g) pendant 5 min.
8. Pour mieux enlever les débris, il est recommandé de remettre en suspension le culot dans 10-15 ml de milieu de NSC et centrifuger la suspension cellulaire à 700 rpm (110 g) pendant 5 min.
9. Le surnageant est éliminé. Puis les cellules sont remises en suspension dans un volume approprié de NSC milieu complet supplémenté avec 20ng/ml EGF, bFGF et 10ng/ml 1μl/ml de l'héparine de 0,2%.
Dissocié d'un cerveau est mis dans un flacon T25 (contenant 5 ml de milieu complet). Les cellules sont ensuite incubées à 37 ° C CO, 5% ₂ Pour 7-10 jours par lequel neurosphères temps devrait se sont formés. Tissus récoltés d'un cerveau en général peut générer 400 à 600 neurosphères.

Partie 4: repiquage et l'expansion du CNS:

1. Quand les neurosphères sont prêts pour la sous-culture (150-200 um de diamètre), le milieu avec des sphères suspendues est retiré de la flacons, placé dans une taille de stériles tube approprié la culture de tissus, et centrifugées à 700 rpm (110 g) pendant 5 min à température ambiante.
2. Le surnageant est éliminé et les sphères sont remis en suspension dans 1 ml de 0,05% de trypsine-EDTA. Alternativement, neurosphères peuvent aussi être repiquées en utilisant des méthodes mécaniques ou chimiques de dissociation décrite dans la littérature ^2,3.
3. La suspension cellulaire est incubée à 37 ° C dans un bain d'eau pendant 2-3 min, puis un volume égal d'inhibiteur de trypsine du soja est utilisé pour arrêter l'activité de la trypsine.
4. La suspension cellulaire est doucement introduit à la pipette de haut en bas pour s'assurer que la trypsine a été complètement inactivé.
5. La suspension cellulaire est centrifugée à 700 rpm pendant 5 min. Ensuite, le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml de milieu NSC.
6. 10 ul de la suspension cellulaire est mélangé avec 90μl de bleu trypan pour effectuer un comptage des cellules.
7. Les cellules sont étalées à une concentration de 5x10 ⁴ Cellules / ml dans NSC milieu complet supplémenté avec 20ng/ml EGF, bFGF et 10ng/ml 1μl/ml de l'héparine de 0,2% dans un flacon de culture taille du tissu approprié. Utiliser 5ml moyenne pour les T25, T75 20 ml pour et 40 ml pour T175 flacons.
secondaire sont formés dans les 5-7 jours lors d'une incubation à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO ₂.

Partie 5: Résultats du représentant:

Dans les adultes culture primaire NSC, la majorité des cellules meurent au bout de 2-3 jours, mais précurseur du facteur de croissance réactive (y compris les cellules souches et progénitrices), les cellules prolifèrent (Figure 1) et de générer des colonies de cellules indifférenciées, après 6-8 jours. Dans ces cultures une quantité importante de débris est normalement présent qui pourrait acquérir une forme sphérique, et peut être confondu avec neurosphères. La quantité de débris est directement dépendante de la dissection des micro-et les techniques de préparation des tissus. Neurosphères vrai sont la phase lumineuse (lumineux) et à devenir plus sphérique que la taille augmente (voir vidéo). Après 7-10 jours, les sphères doivent être arrondis, mais non compacté et doit mesurer entre 150 et 200 um et devrait également avoir des micro-pointes rigides à la périphérie à fort grossissement (figure 2). Si les neurosphères sont autorisés à devenir trop volumineux, ils deviennent de couleur foncée à cause de la mort cellulaire au centre des sphères. La grande neurosphères sont difficiles à dissocier et éventuellement commencer à se fixent au substrat et se différencier.

Figure 1. Primaire pour adultes NSC culture 3 jours après l'étalement. Les flèches indiquent de petites colonies de NSCs proliférative. Grossissement original; 20x.

Figure 2. Neurosphère adulte seul passage 7 jours après placage. Notez le micro-pointes, à la périphérie de la sphère. Grossissement original; 20x.

Le dosage de Neurosphère ² a gagné une grande attention dans la communauté de la recherche non seulement pour l'isolement et l'étude de NSC à partir du SNC ^4-5, mais aussi pour l'isolement des autres types de cellules souches à partir de nombreux tissus putatifs, comme la poitrine de ⁶ et ⁷ et le cœur pour l'identification du cerveau, du sein et du côlon cellules souches tumorales ^8-9 suggérant que ce système de culture peut être appliqué à un certain nombre de tumeurs somatiques et des populations de cellules précurseurs de tout le corps. Certains des avantages de cette méthode comprennent sa simplicité, la reproductibilité et la génération de nombre indéfini de cellules à partir d'un petit morceau de tissu ou même d'un petit nombre de cellules dans un milieu chimiquement défini sans sérum.

Il convient de souligner que le nombre de neurosphères dans la culture ne représente pas le nombre de cellules souches comme neurosphères peuvent être dérivées soit de bonne foi ou les cellules souches provenant de plus les cellules progénitrices restreintes ^10. À cet égard un test a été développé pour recenser correctement les CNS dans la culture ^11.

Différentes méthodes sont utilisées pour dissocier neurosphères en suspension cellule unique, y compris des méthodes mécaniques et enzymatiques. Bien que la méthode mécanique est la méthode originale de dissociation Neurosphère ^2, il requiert beaucoup d'expérience et de son efficacité varie en fonction de l'opérateur. Cette méthode peut aussi causer la mort des cellules et des dommages importants si elle est appliquée par un individu inexpérimenté, ce qui peut diminuer la précision des dosages qui reposent sur ​​la dissociation Neurosphère ^3. Trypsine-EDTA dissociation enzymatique a aussi quelques avantages et inconvénients. Dissociation enzymatique des neurosphères est facile, efficace et reproductible si elle est effectuée pour la durée appropriée et sur les neurosphères la bonne taille. Bien qu'il n'y ait pas de côté par les études comparant les effets secondaires de ces deux méthodes de Neurosphère dissociation, notre expérience montre qu'une brève incubation (3-5 minutes) de l'neurosphères (jusqu'à 250 um) à la trypsine-EDTA en résulte une efficacité de dissociation sans déranger leurs capacités de viabilité, la prolifération et la différenciation. D'autre part, l'exposition de longues neurosphères (surtout pour les grandes neurosphères envahis) à la trypsine-EDTA peut causer de graves dommages aux récepteurs de surface cellulaire, la digestion et la mort cellulaires potentiellement cellule. La surexposition à la trypsine-EDTA pourrait aussi interférer avec la formation de la sphère et les cellules provoquer d'attacher au substrat et se différencier.

Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation Overstreet.