成年鼠神经干细胞的分离和扩大使用神经干含量

这个视频协议演示，从成年小鼠脑室周围地区产生和扩大神经干细胞的神经球的含量测定方法，并提供技术见解，以确保可以实现重复性的神经球文化。

分离和扩展的假定从成年鼠大脑中的神经干细胞（NS​​Cs的）是在1992年首次描述了采用化学定义的无血清培养系统，被称为神经干法（NSA）的雷诺和Weiss。在这个实验中，多数分化的细胞类型文化的几天内死亡，但人口少的生长因子的反应前体细胞进行增殖活跃在表皮生长因子（EGF）和/碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的存在。这些细胞的未分化细胞，称为神经球，这反过来又可以传代培养的神经干细胞池扩大形成的殖民地。此外，细胞可以诱导分化，产生中枢神经系统，即神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞的三个主要类型的细胞。这个实验提供了一个宝贵的工具，提供一个一致的，可再生能源的未分化的中枢神经系统前体， 可用于在体外研究中，也为治疗目的。

本视频演示了NSA的产生和扩大，从成年小鼠脑室周围区域的神经干细胞的方法，并提供技术见解，以确保可以实现重复性的神经球文化。该过程包括收获从成年小鼠，脑室周围地区的微观解剖，组织编制和文化在NSA大脑。收获的组织是第一个使用在NSC培养基胰蛋白酶- EDTA和机械分离，实现了单细胞悬液，最后镀在NSA化学消化。经过7-10天文化，产生的初级神经球传代培养的准备，以达到未来的实验所需的细胞量。

第1部分：基本设置，然后再进行剥离：

1。如果您的实验室不具备了丰富的经验与介质，我们强烈建议使用市售的中等质量控制神经干细胞生长之前被卖掉（这是NeuroCult，干细胞Technolgies公司）已。
1. 介质在37℃水浴预热。
2. 冷HEPES缓冲的最低限度的基本介质与高浓度抗生素（10％）（HEM）准备剥离和清洗的目的。另外，国科会与抗生素补充培养基，也可能被用于此目的。
3. 30-40毫升含抗生素的冷HEM分装到无菌50毫升脑收集管。
4. 若干10厘米塑料培养皿期间举行的大脑解剖和一个10厘米无菌玻璃培养皿举行解剖组织。
5. 需要删除的大脑（大剪刀，小尖剪刀，大钳，小弯钳，和一个小铲）或组织剥离（小镊子，弯细镊子，手术刀）的外科手术工具使用玻璃珠的灭菌消毒在250 ° C或其他可用高压灭菌方法。
6. 解剖镜下用70％酒精擦拭和内部设置的PC2罩。

第2部分：收获成年小鼠大脑和微观解剖：

1. 2-4成年小鼠（5-8周龄）根据机构批准的动物协议使用3-4％的异氟醚或腹腔注射戊巴比妥麻醉（120毫克/公斤）。
2. 颈椎脱位执行，以确保动物不遭受的痛苦和悲伤。
3. 麻醉鼠标吸水纸巾上，放在其腹部和头部是用70％乙醇冲洗，消毒面积。
4. 大剪刀，用来斩首略高于脊髓型颈椎病地区的动物。
5. 小尖剪刀被用来制造中位数的尾鳍喙切断，暴露颅骨。
6. 切割边缘的皮肤用于保存头部，然后每一个小剪刀的刀片放置在每个眶腔之间的轨道作冠状切开。
7. 使用为切入点，枕骨大孔，纵向切割是通过头骨沿矢状缝和横向削减两个侧壁交界处及颅底。时应注意不损伤小切口，并确保刀片的角度尽可能浅底层的大脑。
8. 覆每个半球的头骨是掌握和使用弯钳揭露大脑，然后用一个小的湿锅铲向外去皮，脑舀到50毫升含HEM管。
9. 重复此过程，直到所有的大脑已收获。
10. 解剖前脑脑室周围地区，置于解剖显微镜下用低倍率的菜含有的大脑。的大脑，然后对他们的腹面定位平面和尾侧用细弯钳举行。另一套弯钳是用于去除嗅球。
11. 后去除嗅球，大脑旋转腹侧方面暴露。
12. 重复此过程，直到所有的大脑切片。
13. 在更高的放大倍率，大脑延髓方面旋转，使切面朝上。首先，隔罚款弯曲的微型剪刀或弯曲，尖头镊子，然后一层薄薄的心室侧壁周围组织被切断，但不包括纹状体实质和胼胝体的拆除和丢弃。解剖组织是汇集在一个10厘米无菌玻璃培养皿。
14. 重复此过程，直到所有的大脑微解剖。

第3部分：组织准备和电镀细胞：

1. 汇集组织肉末约1-2分钟使用手术刀刀片，直到只有非常小的碎片仍然的。
2. 总量的3％，0.05毫升胰蛋白酶- EDTA是用剁碎组织转移到一个15毫升的试管中。 3毫升胰蛋白酶- EDTA的是足够的8只收获了良好的组织消化。
3. 7分钟在37℃水浴孵育管。
4. 上清被丢弃。然后细胞悬浮于适当量完成国科会与20ng/ml EGF，在10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和1μl/ml0.2％肝素培养基。
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第4部分：神经干细胞传代和扩展：

1. 上清液丢弃，重悬于1毫升的0.05％胰蛋白酶EDTA的领域。另外，神经球也可以传代使用机械或化学分解方法在文献中描述的 ^2,3。
2. 细胞悬液，培养于37 ° C在水浴为2-3分钟，然后等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂是用来阻止胰蛋白酶的活性。
3. 细胞悬液轻轻吸管，以确保已完全灭活，胰蛋白酶。
4. 细胞悬液，离心5分钟700转。然后，取上清液被删除，在1毫升的NSC培养基中悬浮细胞。
5. 细胞悬液10μL混合90μl台盼蓝进行细胞计数。
6. 细胞镀浓度的5X10 ⁴细胞/ ml的完成国科会在一个适当大小的组织培养瓶中的培养基与20ng/ml EGF，在10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和1μl/ml0.2％肝素补充。 T75和T175烧瓶40毫升，使用的T25，20毫升的5毫升介质。
7. 中的神经球是在5-7天，在37℃孵育形成℃，5％CO2培养箱在 ₂。

第5部分：代表性的成果：

在小学成人国科会文化，多数细胞就会死亡后2-3天，但反应前体（包括干细胞和祖细胞）生长因子，细胞就会增殖（图1），后6-8天产生的未分化细胞的克隆。在这些文化通常是大量的碎片可能获得一个球形目前，可用于神经球误。碎片的数量是直接的微观解剖和组织制备技术的依赖。真正的神经球是相亮（发光）和规模的增大变得更加球形（见视频）。经过7-10天，球必须是圆，但不板结;和应措施，在150和200微米之间，也应在高放大倍率（图2）周边刚性微尖峰。如果允许的神经球增长过大，他们变得​​颜色较暗，由于细胞死亡的领域的中心。大神经球是很难解离，并最终开始附加到基板和区分。

图1。成人国科会主文化电镀后3天。箭头显示增殖神经干细胞的小菌落。原始放大倍率20倍。

图2。快速通道成人神经干电镀后第7天。请注意在微球体的外围尖峰。原始放大倍率20倍。

神经球的^检测 2不仅获得了隔离和中枢神经^系统 4-5的神经干细胞研究，但也是公认的从众多的组织干^细胞 ，如^乳房 6和心脏7，其他类型的隔离研究界的广泛关注和脑，乳腺癌和结肠癌肿瘤干细胞^8-9表明，这种文化系统可应用于体细胞和肿瘤的整个身体的前体细胞群的鉴定。这种方法的一些优点，包括它的简单性，重复性和无限期数量从一小块组织，甚至在化学定义无血清培养细胞的少数细胞的生成。

应当强调，在培养的神经球数量并不代表干细胞的数量作为神经球，可无论是从真正的干细胞，或从更受限制的祖^细胞 10派生。在这方面的检测已发展到正确枚举文化¹¹中的神经干细胞。

使用不同的方法分解成单细胞悬液的神经球，包括机械和酶法。虽然机械方法是原始的神经干分解方法，它需要很多的经验和它的效率有所不同，取决于运营商。这种方法也可能造成重大的细胞死亡和破坏，如果一个没有经验的个人，它可以减少检测的准确性依赖于神经干^解离3的应用。胰蛋白酶EDTA酶解也有一些优点和缺点。酶法分解的神经球很容易，高效和可重复性，如果进行适当的时间长度和权利大小的神经球。虽然没有侧方神经球解离这两种方法的效果比较研究，我们的经验表明，一个简短的潜伏期（3-5分钟）的神经球（250微米），胰蛋白酶EDTA结果在一个高效率的解离不干扰他们的生存能力，增殖和分化能力。另一方面，长期暴露的神经球（特别是对于大型杂草丛生的神经球）胰蛋白酶EDTA可能与细胞表面受体，细胞消化和潜在的细胞死亡造成严重损害。过度胰蛋白酶EDTA也可能干扰领域的形成，并导致细胞附着到基板和区分。

这项工作是从Overstreet基金会的资金支持。