El aislamiento y la expansión de las células troncales nerviosas de ratones adultos mediante el ensayo de neuroesfera

Este protocolo de vídeo se muestra el método de ensayo neuroesfera para generar y expandir las células madre neurales de la región periventricular del ratón adulto, y proporciona una visión técnica para asegurarse de que uno puede lograr culturas neuroesfera reproducible.

El aislamiento y la expansión de las células madre neurales putativo (NSC) del cerebro murino adulto fue descrita por primera vez por Reynolds y Weiss en 1992, empleando una química definida libre de suero sistema de cultivo conocido como ensayo neuroesfera (NSA). En este ensayo, la mayoría de los tipos de células diferenciadas mueren a los pocos días de la cultura, sino una pequeña población de células precursoras del factor de crecimiento de respuesta experimentan una proliferación activa en presencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y / factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF). Estas células forman colonias de células indiferenciadas llamadas neuroesferas, que a su vez puede ser un subcultivo para ampliar el grupo de células madre neurales. Por otra parte, las células pueden ser inducidas a diferenciarse, generar los tres tipos principales de células de las neuronas del SNC, es decir, astrocitos y oligodendrocitos. Este ensayo proporciona una valiosa herramienta para proporcionar una fuente constante y renovable de los precursores del SNC no diferenciadas, que podrían ser utilizados para estudios in vitro y también con fines terapéuticos.

Este video muestra el método NSA para generar y ampliar NSCs de la región periventricular del ratón adulto, y proporciona una visión técnica para asegurar que uno puede lograr culturas neuroesfera reproducible. El procedimiento incluye la extracción del cerebro del ratón adulto, micro-disección de la región periventricular, la preparación del tejido y la cultura de la NSA. El tejido es la primera cosecha químicamente digerido con tripsina-EDTA y luego disociado mecánicamente en un medio de NSC para lograr una suspensión de células individuales y, finalmente, se sembraron en la NSA. Después de 7-10 días en la cultura, las neuroesferas primarios resultantes están listos para la subcultura de llegar a la cantidad de celdas requeridas para futuros experimentos.

Parte 1: Configuración básica antes de proceder a la disección:

1. Volumen apropiado de medio completo NSC se prepara mezclando NeuroCult NSC medio basal y NeuroCult Suplementos NSC proliferación en una proporción de 9:1, respectivamente. Medio NSC también se pueden hacer en el laboratorio basado en la composición NSC medio de crecimiento publicados en la literatura ¹. Si su laboratorio no tiene mucha experiencia con la fabricación de medio, se recomienda utilizar medio disponible en el mercado que ha sido un control de calidad para el crecimiento NSCs antes de ser vendidos (como es el caso de NeuroCult, Technolgies de células madre).
2. El medio es calentado en un baño de agua a 37 ° C.
3. Cold HEPES buffer medio esencial mínimo (HEM), con alta concentración de antibióticos (10%) se prepara para la disección y el propósito de lavado. Por otra parte, NSC medio basal con la suplementación de los antibióticos también pueden ser utilizados para este propósito.
30-40 de HEM resfriado que contienen antibióticos se distribuye en tubos de 50 ml estériles para la recolección de cerebro.
4. Varias placas de Petri de plástico de 10 cm se necesitan para mantener el cerebro durante la disección y una de 10 cm de cristal placa de Petri estéril para mantener los tejidos disecados.
5. Los instrumentos quirúrgicos para remover el cerebro (tijeras grandes, pequeñas tijeras con punta, pinzas grandes, pequeñas pinzas curvas, y una espátula pequeña) o para la disección de los tejidos (pequeñas pinzas, pinzas finas curvas, y el bisturí) se esterilizan con cuentas de vidrio esterilizador a 250 ° C o de otros métodos disponibles autoclave.
La disección se limpia con alcohol al 70% y establecer dentro de la campana PC2.

Parte 2: La recolección del cerebro del ratón adulto y micro-disección:

1. 2-4 adultos (5-8 semanas de edad) son los ratones anestesiados de acuerdo a su protocolo institucional de los animales aprobado con 4.3% de isoflurano o por inyección intraperitoneal de pentobarbital (120 mg / kg).
cervical se realiza para asegurarse de que el animal no sufre dolor y la angustia.
2. El ratón anestesiado se coloca en el abdomen en un pañuelo de papel absorbente, y el jefe se lava con etanol al 70% para esterilizar la zona.
3. Tijeras grandes se usan para decapitar el animal justo por encima de la región de la médula espinal cervical.
4. Señaló Tijeras pequeñas se utilizan para hacer una media de caudal-rostral corte y para exponer el cráneo.
5. El corte de los bordes de la piel se utilizan para sostener la cabeza y después de cada hoja de una tijera pequeña se coloca en cada cavidad orbital para hacer un corte coronal entre las órbitas.
6. Utilización del foramen magnum como punto de entrada, un corte longitudinal a través del cráneo a lo largo de la sutura sagital y dos cortes laterales también se hacen en la unión de las paredes laterales y la base del cráneo. Se debe tener cuidado de no dañar el cerebro subyacente, haciendo pequeños cortes y garantizar el ángulo de las palas es tan superficial como sea posible.
7. El cráneo que cubre cada hemisferio es captado y pelado pasivo utilizando una pinza curva para exponer el cerebro, y luego con una espátula mojada pequeño, el cerebro se recogió en un tubo de 50 ml que contiene HEM.
8. Este procedimiento se repite hasta que todos los cerebros se han cosechado.
9. El cerebro se transfieren a la campana de PC2 y lavado tres veces con un volumen suficiente de HEM estéril fría para eliminar los posibles contaminantes como la sangre y el cabello. Los cerebros se transfieren a una placa de Petri de 10 cm que contiene HEM.
10. Para diseccionar la región periventricular del cerebro anterior, el plato que contiene el cerebro se coloca bajo el microscopio de disección con bajo aumento. El cerebro se coloca a continuación plana en su superficie ventral y el lugar desde el lado de caudal con finas pinzas curvas. Otro conjunto de pinzas curvas se utiliza para eliminar los bulbos olfatorios.
11. Después de la eliminación de los bulbos olfatorios, el cerebro se rotan para exponer la cara ventral.
12. Un corte de 90 ° coronal se realiza a nivel del quiasma óptico y los aspectos caudal de los cerebros se descartan.
13. Este procedimiento se repite hasta que todos los cerebros son seccionados.
14. A mayor aumento, los aspectos rostral del cerebro son rotados de manera que la superficie de corte mire hacia arriba. En primer lugar, el tabique se extrae y se desecha con una multa curva micro-tijeras o pinzas curvas, señaló, y luego la fina capa de tejido que rodea la pared lateral del ventrículo corte es decir, excluyendo el parénquima estriatal y el cuerpo calloso. Los tejidos disecados se combinaron en un vidrio de 10 cm placa de Petri estéril.
15. Este procedimiento se repite hasta que todos los cerebros son micro-disección.

Parte 3: preparación de tejidos y células de revestimiento:

1. El tejido combinado es picada durante unos 1-2 minutos con una hoja de bisturí, hasta que sólo quedan trozos muy pequeños.
2. El volumen total de 3 ml de 0,05% de tripsina-EDTA se utiliza y todo el tejido picada se transfiere a un tubo de 15 ml. 3 ml de tripsina-EDTA es suficiente para una buena digestión de los tejidos cosechados de un máximo de 8 ratones.
3. El tubo se incuba durante 7 minutos en un baño de agua a 37 ° C.
4. Al final de la incubación enzimática, el tubo se volvió a la capilla y un volumen igual de inhibidor de tripsina de soja se agrega a detener la actividad de la tripsina.
5. La suspensión es una pipeta de arriba a abajo para garantizar la inactivación de tripsina y luego se sedimentan por centrifugación a 700 rpm (110 g) durante 5 minutos.
6. El sobrenadante se descarta y las piezas de tejido se resuspendió en 150 ml de medio estéril basal NSC. Restablecimiento de la pipeta a 200 l, los grupos se disocian pipeteando suavemente hacia arriba y abajo (3-7 veces) hasta que una suave suspensión lechosa sola célula se logra. El número de pasos pippetting depende directamente del tamaño de las partículas en el tejido picado (es mejor picar el tejido en trozos muy pequeños con el fin de aumentar la superficie para la actividad de la tripsina). Disociación mecánica prolongada y vigorosa podría conducir a la formación de ámbito reducido debido a la madre neurales y la muerte de células progenitoras.
7. Para eliminar los restos y piezas sin disociarse, medio base NSC se añade a la suspensión de células disociadas de alcanzar un volumen total de 10 y 15 ml. La suspensión celular se hace pasar por un tamiz 40μm de células en un tubo de tamaño apropiado, y luego se sedimentan por centrifugación a 700 rpm (110 g) durante 5 minutos.
8. Para eliminar más de los escombros, se recomienda volver a suspender el pellet en 10-15 ml de medio de NSC y centrifugar la suspensión celular a 700 rpm (110 g) durante 5 minutos.
9. El sobrenadante se descarta. Luego, las células se resuspenden en un volumen adecuado de medio completo suplementado con NSC 20ng/ml EGF, bFGF 10ng/ml y 1μl/ml del 0,2% con heparina.
10. Tejido disociado de un cerebro se pone en un frasco T25 (que contiene 5 ml de medio completo). Las células se incubaron a 37 ° C CO, 5% ₂ Durante 7-10 días en que neuroesferas momento que lo han formado. Tejidos del cerebro por lo general uno puede generar 400-600 neuroesferas.

Parte 4: pases y la expansión de NSCs:

1. Cuando el neuroesferas están listos para la subcultura (150-200 micras de diámetro), el medio de esferas de suspensión se retira de los frascos, colocado en un tubo estéril del tamaño adecuado del cultivo de tejidos, y se centrifuga a 700 rpm (110 g) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
2. El sobrenadante se descarta y las esferas se resuspendió en 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA. Alternativamente, también puede ser neuroesferas pasajes utilizando métodos mecánicos o químicos de disociación descrito en la literatura ^2,3.
3. La suspensión celular se incuba a 37 ° C en un baño de agua durante 2-3 minutos, y luego un volumen igual de inhibidor de tripsina de soja se utiliza para detener la actividad de la tripsina.
4. La suspensión de la célula es una pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que la tripsina se ha eliminado por completo.
5. La suspensión del celular se centrifuga a 700 rpm durante 5 min. Luego, se retira el sobrenadante y las células se resuspenden en 1 ml de medio NSC.
6. 10μl de la suspensión celular se mezcla con 90μl de azul tripán para llevar a cabo un recuento de células.
7. Las células se sembraron a una concentración de 5x10 ⁴ Células / ml en medio completo suplementado con NSC 20ng/ml EGF, bFGF 10ng/ml y 1μl/ml del 0,2% de heparina en un frasco de cultivo de tejido del tamaño adecuado. Use 5ml por medio de T25, T75 de 20 ml y 40 ml de T175 frascos.
Secundaria se forman en 5-7 días cuando se incuba a 37 ° C en un incubador humidificado con un 5% de CO ₂.

Parte 5: Resultados del representante:

En los adultos la cultura primaria NSC, la mayoría de las células se mueren al cabo de 2-3 días, pero precursor del factor de crecimiento de respuesta (incluidas las células madre y progenitoras) que proliferan (figura 1) y generar colonias de células indiferenciadas después de 6-8 días. En estas culturas una cantidad importante de desechos que normalmente está presente puede adquirir una forma esférica, y se puede confundir con neuroesferas. La cantidad de desechos es directamente dependiente de la disección de las micro y las técnicas de tejido de la preparación. Neuroesferas verdaderos son la fase luminosa (luminosa) y cada vez más a medida que aumenta el tamaño esférica (ver video). Después de 7-10 días, las esferas deben ser redondeados, pero no compactada, y debe medir entre 150 y 200 micras y también debe tener rígida micro-picos en la periferia a gran aumento (Figura 2). Si las neuroesferas se les permite crecer demasiado, se vuelven de color oscuro debido a la muerte celular en el centro de las esferas. El neuroesferas grandes son difíciles de disociar y, finalmente, comenzará a dar al sustrato y se diferencian.

Figura 1. Primaria para adultos NSC cultivo de 3 días después de placas. Las flechas muestran las pequeñas colonias de NSCs proliferativa. Original de ampliación; 20x.

Figura 2. El paso de un adulto neuroesfera 7 días después de la siembra. Tenga en cuenta los picos de micro en la periferia de la esfera. Original de ampliación; 20x.

El ensayo neuroesfera ² ha ganado gran atención en la comunidad de investigación no sólo para el aislamiento y estudio de los comités directivos de la CNS ^05/04, sino también para el aislamiento de otros tipos de células madre putativa de numerosos tejidos, como el de mama ⁶ y ⁷ y el corazón para la identificación de cerebro, mama y colon células madre tumorales ^8-9 lo que sugiere que este sistema de cultivo se puede aplicar a una serie de síntomas somáticos y el tumor de las poblaciones de células precursoras a través del cuerpo. Algunas de las ventajas de este método son su sencillez, reproducibilidad y la generación de número indeterminado de células de un pequeño trozo de tejido o incluso un pequeño número de células en un medio químicamente definido libre de suero.

Cabe destacar que el número de neuroesferas en la cultura no representa el número de células madre como neuroesferas se pueden derivar ya sea de buena fe o las células madre a partir de células progenitoras más restringida ^10. A este respecto, un ensayo ha sido desarrollado para enumerar correctamente NSCs en la cultura ^11.

Se utilizan diferentes métodos para disociar neuroesferas en suspensión de células individuales incluyendo los métodos mecánicos y enzimáticos. Aunque el método mecánico es el método original de disociación neuroesfera ^2, se requiere de mucha experiencia y su eficacia varía según el operador. Este método también puede causar la muerte celular y daño si se aplica a una persona sin experiencia, lo cual puede disminuir la precisión de los ensayos que se basan en la disociación neuroesfera ^3. Tripsina-EDTA disociación enzimática también tiene algunas ventajas y desventajas. Enzimático de disociación de neuroesferas es fácil, eficiente y reproducible si se realiza para el periodo de tiempo adecuado y en el neuroesferas tamaño adecuado. Aunque no hay estudios de lado a lado la comparación de los efectos de estos dos métodos de neuroesfera disociación, nuestra experiencia muestra que una incubación breve (3-5 minutos) de las neuroesferas (hasta 250 m) con tripsina-EDTA resultados de manera eficiente la disociación sin afectar su capacidad de viabilidad, proliferación y diferenciación. Por otro lado, la exposición prolongada de neuroesferas (especialmente para las neuroesferas cubierto de gran tamaño) a la tripsina-EDTA podría causar graves daños a los receptores de superficie celular, la digestión celular y potencialmente la muerte celular. La sobreexposición a la tripsina-EDTA también pueden interferir con la formación de la esfera y las células de la causa para unir al sustrato y se diferencian.

Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Overstreet.