Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Dieses Video-Protokoll zeigt die Neurosphäre Assay-Methode zu generieren und zu erweitern neurale Stammzellen aus dem erwachsenen Maus periventrikulären Region und erbringt technische Erkenntnisse, um sicherzustellen, kann man reproduzierbare Neurosphäre Kulturen zu erreichen.

Isolation und Expansion der vermeintlichen neuralen Stammzellen (NSCs) aus der erwachsenen Mäuse-Gehirn wurde zuerst von Reynolds und Weiss im Jahr 1992 beschrieben unter Verwendung eines chemisch definierten serumfreien System als Neurosphäre Assay (NSA) bekannt. In diesem Test, sterben die meisten differenzierte Zelltypen innerhalb weniger Tage der Kultur, sondern eine kleine Population von Wachstumsfaktor reagieren Vorläuferzellen unterziehen aktive Proliferation in Anwesenheit des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) und / basic Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF). Diese Zellen bilden Kolonien von undifferenzierten Zellen, die sogenannten Neurosphären, was wiederum subkultiviert, um den Pool der neuralen Stammzellen erweitern können. Darüber hinaus können die Zellen induziert, um zu unterscheiden, die Erzeugung der drei großen Zelltypen des ZNS, dh Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Dieser Test liefert ein wertvolles Werkzeug, um eine konsistente, erneuerbare undifferenzierten ZNS-Vorstufen, die in vitro-Studien und auch für therapeutische Zwecke genutzt werden könnten versorgen.

Dieses Video zeigt die NSA-Methode zu generieren und zu erweitern NSCs aus der adulten Maus periventrikulären Region und erbringt technische Erkenntnisse, um sicherzustellen, kann man reproduzierbare Neurosphäre Kulturen zu erreichen. Das Verfahren schließt die Gewinnung der Gehirn der adulten Maus, Mikro-Dissektion der periventrikulären Region, Gewebe und-kultur in der NSA. Die geernteten Gewebe wird zunächst chemisch verdaut unter Verwendung von Trypsin-EDTA und anschließend mechanisch dissoziiert in NSC Medium auf eine einzelne Zelle Suspension zu erzielen und schließlich in der NSA überzogen. Nach 7-10 Tagen in Kultur, sind die resultierenden primären Neurosphären bereit für Subkultur, die Menge an Zellen für zukünftige Experimente erforderlich zu erreichen.

Teil 1: Grundlagen, bevor Sie fortfahren, um Dissektion gesetzt:

1. Entsprechende Volumen von kompletten NSC Medium wird hergestellt, indem NeuroCult NSC Basal Medium und NeuroCult NSC Proliferation Supplements bei einem 9:1-Verhältnis, bzw. vorbereitet. NSC Medium kann auch im Labor basierend auf NSC Wachstumsmedium Zusammensetzung in der Literatur veröffentlichten gemacht werden ¹. Wenn Ihr Labor nicht viel Erfahrung mit der Herstellung Medium, empfehlen wir dringend, im Handel erhältlichen Mittel, die Qualität für NSCs Wachstum vor gesteuert werden, um verkauft werden (das ist der Fall für NeuroCult, Stem Cell Technolgies) verfügt.
2. Das Medium wird in einem 37 ° C Wasserbad erwärmt.
3. Cold HEPES-gepufferte Minimum Essential Medium (HEM) mit einer hohen Konzentration von Antibiotika (10%) ist für die Präparation und Waschen Zweck vorbereitet. Alternativ können NSC Basalmedium mit Antibiotika-Supplementierung ebenfalls für diesen Zweck verwendet werden.
4. 30-40 ml kaltem HEM mit Antibiotika ist in sterile 50 ml Röhrchen für Gehirn-Sammlung verzichtet.
5. Mehrere 10cm Petrischalen aus Kunststoff sind notwendig, um das Gehirn während der Präparation und einer 10cm sterile Glas-Petrischale zu seziert Hautgewebe zu halten.
6. Die chirurgische Werkzeuge benötigt, um das Gehirn (große Schere, kleine spitze Schere, Pinzette großen, kleinen gebogenen Pinzette und einem kleinen Spatel) oder für die Gewebe-Dissektion (kleine Pinzette, gebogen feinen Pinzette und Skalpell) entfernt werden sterilisiert mit Glasperlen Sterilisator bei 250 ° C oder anderen verfügbaren Autoklav-Verfahren.
7. Dissection Mikroskop ist mit 70% Alkohol abgewischt und setzen sich im Inneren des PC2 Kapuze.

Teil 2: Die Ernte erwachsenen Gehirn der Maus und Mikro-Dissektion:

1. 2-4 Erwachsenen (5-8 Wochen alt) Mäuse betäubt nach einem institutionellen genehmigt Tier-Protokoll mit 3-4% Isofluran oder durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (120 mg / kg).
2. Genickbruch wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Tier nicht leidet Schmerzen und Leiden.
3. Die narkotisierten Maus ist auf dem Bauch auf einem saugfähigen Papiertuch gelegt und der Kopf ist mit 70% Ethanol gespült, um den Bereich zu sterilisieren.
4. Große Schere werden verwendet, um das Tier knapp oberhalb des zervikalen Rückenmarks Region zu enthaupten.
5. Kleine spitze Schere werden verwendet, um eine mediane caudal-rostralen Schnitt zu machen und den Schädel zu entlarven.
6. Die Schnittkanten der Haut werden verwendet, um den Kopf halten und dann jedes Blatt einer kleinen Schere ist in jeder Augenhöhle platziert, um einen koronalen Schnitt zwischen den Umlaufbahnen zu machen.
7. Mit dem Foramen magnum als Einstiegspunkt, ist ein Längsschnitt durch den Schädel entlang der Pfeilnaht gemacht und zwei seitliche Schnitte sind auch am Übergang der Seitenwände und die Basis des Schädels gemacht. Vorsicht ist geboten, nicht auf die zugrunde liegende Gehirn durch kleine Schnitte und die Sicherstellung der Winkel der Schaufeln ist so flach wie möglich zu beschädigen.
8. Der Schädel liegenden jeder Hemisphäre begriffen und nach außen mit einer gebogenen Pinzette in das Gehirn freizulegen, dann mit einem kleinen Spatel benetzt geschält, ist das Gehirn in eine 50 ml Tube mit HEM geschöpft.
9. Dieser Vorgang wird solange wiederholt, bis alle Gehirne geerntet worden sind.
10. Die Köpfe sind die PC2 Haube übertragen und dreimal mit genug Volumen kalten sterilen HEM, um mögliche Verunreinigungen wie Blut und Haare zu entfernen. Die Gehirne werden dann zu einer 10cm Petrischale mit HEM übertragen.
11. Um das Vorderhirn periventrikulären Region sezieren, ist die Schale mit den Gehirnen unter dem Binokular mit geringer Vergrößerung gelegt. Die Gehirne werden dann positioniert auf ihrem ventralen Oberfläche flach und gehalten von der kaudalen Seite mit feinen gebogenen Pinzette. Ein weiterer Satz von einer gebogenen Pinzette wird verwendet, um den Riechkolben zu entfernen.
12. Nach dem Entfernen der Riechkolben, sind die Köpfe gedreht, um den ventralen aussetzen.
13. A 90 ° koronalen Schnitt ist auf der Ebene des Chiasma gemacht und die Schwanzflosse Aspekte des Gehirns werden verworfen.
14. Dieser Vorgang wird solange wiederholt, bis alle Köpfe geschnitten werden.
15. Bei höherer Vergrößerung werden die rostralen Aspekte der Gehirne so gedreht, dass der Schnittfläche nach oben zeigt. Zuerst wird das Septum entfernt und entsorgt mit einer feinen gebogenen Mikro-Schere oder gebogene, spitze Pinzette, und dann die dünne Schicht des umgebenden Gewebes der Seitenwand der Ventrikel wird geschnitten, mit Ausnahme des Striatum Parenchym und des Corpus Callosum. Dissected Gewebe wird in einem sterilen Glas 10cm Petrischale zusammengeführt.
16. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis alle Gehirne Mikro-seziert werden.

Teil 3: Tissue Vorbereitung und Beschichtung Zellen:

1. Die gepoolten Gewebe wird für ca. 1-2 Minuten mit einem Skalpell zerkleinert, bis nur noch sehr kleine Stücke bleiben.
2. Ein Gesamtvolumen von 3 ml% 0,05 Trypsin-EDTA verwendet wird und alle zerkleinerte Gewebe wird in einen 15-ml-Gefäß überführt. 3ml Trypsin-EDTA ist genug für eine gute Verdauung von Geweben aus bis zu 8 Mäusen geerntet.
3. Das Rohr wird für 7 min bei 37 ° C Wasserbad inkubiert.
4. Am Ende der enzymatischen Inkubation wird das Rohr auf der Motorhaube zurück und ein gleiches Volumen Sojabohnentrypsininhibitor wird hinzugefügt, um Trypsin zu stoppen.
5. Die Suspension wird und pipettiert bis Trypsin Inaktivierung zu gewährleisten und dann durch Zentrifugation bei 700 rpm (110 g) für 5min.
6. Der Überstand wird verworfen, und die Gewebestücke werden in 150 ul sterilem NSC Basalmedium resuspendiert. Das Zurücksetzen der Pipette auf 200 ul, sind die Klumpen dissoziiert durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren (3-7 mal), bis eine glatte milchig einzigen Zellsuspension erreicht ist. Die Zahl der pipettieren Schritte direkt abhängig von der Größe der Partikel in das zerkleinerte Gewebe (es ist besser, das Gewebe in sehr kleine Stücke hacken so wie die Fläche für Trypsin Tätigkeit zu erhöhen). Lange und kräftige mechanische Dissoziation könnte zu reduzierten Sphäre Bildung durch neuronale Stamm-und Vorläuferzellen Zelltod führen.
7. Um Ablagerungen und un-dissoziierten Teile zu entfernen, ist basal NSC Medium, um die dissoziierte Zellsuspension hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 10-15ml zu erreichen. Die Zellsuspension wird durch einen 40 um Zelle Sieb in eine geeignete Größe Rohr geleitet und dann durch Zentrifugation bei 700 rpm (110 g) für 5min.
8. Zur weiteren entfernen Sie die Rückstände, ist es empfehlenswert, das Pellet in 10-15 ml Medium resuspendieren und NSC-Zentrifuge der Zellsuspension bei 700 rpm (110 g) für 5min.
9. Der Überstand wird verworfen. Dann werden die Zellen in ausreichender Menge von kompletten NSC Medium mit 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF und 1μl/ml von 0,2% Heparin ergänzt resuspendiert.
10. Getrennte Gewebe von einem Gehirn ist in eine T25-Kolben (mit 5 ml Vollmedium) setzen. Die Zellen werden dann bei 37 ° C, 5% CO inkubiert ₂ Für 7-10 Tage, um die Zeit Neurosphären gebildet haben sollte. Tissue von einem Gehirn geerntet kann in der Regel generieren 400-600 Neurosphären.

Teil 4: Die Passage und Expansion von NSCs:

1. Wenn die Neurosphären bereit für Subkultur (150-200 &mgr; m Durchmesser) sind, ist das Medium, mit hängenden Kugeln aus den Flaschen entfernt, in einer angemessenen Größe sterile Zellkulturgefäß und zentrifugiert bei 700 rpm (110 g) für 5 min bei Raumtemperatur.
2. Der Überstand wird verworfen und die Kugeln sind in 1 ml% 0,05 Trypsin-EDTA resuspendiert. Alternativ kann auch Neurosphären passagiert durch mechanische oder chemische Dissoziation Methoden werden in der Literatur beschrieben ^2,3.
3. Die Zellsuspension wird bei 37 ° C im Wasserbad für 2-3 min, dann ein gleiches Volumen Sojabohnentrypsininhibitor verwendet wird, um das Trypsin zu stoppen.
4. Die Zellsuspension wird vorsichtig nach oben und unten pipettiert, um sicherzustellen, dass die Trypsin wurde komplett inaktiviert.
5. Die Zellsuspension wird bei 700 rpm für 5 min zentrifugiert. Dann wird der Überstand abgenommen und die Zellen werden in 1 ml der NSC-Medium resuspendiert.
6. 10 &mgr; l der Zellsuspension mit 90μl des Trypanblau auf eine Zellzahl führen gemischt.
7. Die Zellen werden in einer Konzentration von 5x10 verzinkt ⁴ Zellen / ml in kompletten NSC Medium mit 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF und 1μl/ml von 0,2% Heparin in einer angemessenen Größe Zellkulturflasche ergänzt. Verwenden Sie 5ml Medium für T25, 20 ml für T75 und 40 ml für T175 Flaschen.
8. Secondary Neurosphären sind in 5-7 Tagen gebildet werden, wenn bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO ₂.

Teil 5: Repräsentative Ergebnisse:

Bei der primären Erwachsenen NSC Kultur, wird die Mehrzahl der Zellen nach 2-3 Tagen aber growth factor reagieren Vorstufe (einschließlich Stamm-und Vorläuferzellen) Zellen vermehren (Abb. 1) sterben und erzeugen Kolonien von undifferenzierten Zellen nach 6-8 Tagen. In diesen Kulturen eine bedeutende Menge von Schutt ist normalerweise, dass eine kugelförmige Gestalt gewinnen könnte, und kann für Neurosphären verwechselt werden. Die Menge der Ablagerungen ist direkt abhängig von der Mikro-Dissektion und Gewebe Präparationstechniken. Wahre Neurosphären werden Phase hell (hell) und werden mehr als sphärische Größe zunimmt (siehe Video). Nach 7-10 Tagen müssen die Kugeln abgerundet, aber nicht verdichtet, und sollte zwischen 150 und 200 um zu messen und sollte auch starre Micro-Spikes an der Peripherie bei hoher Vergrößerung (Abbildung 2). Wenn die Neurosphären erlaubt sind zu groß werden, werden sie zu dunkel in der Farbe durch den Zelltod in der Mitte der Kugeln. Die große Neurosphären sind schwer zu trennen und schließlich beginnen auf das Substrat legen und zu differenzieren.

Abbildung 1. Primary Erwachsenen NSC Kultur 3 Tage nach dem Ausplattieren. Die Pfeile zeigen kleine Kolonien von proliferative NSCs. Original-Vergrößerung, 20x.

Abbildung 2. Passage einen Erwachsenen Neurosphäre 7 Tage nach dem Ausplattieren. Beachten Sie die Mikro-Spikes an der Peripherie der Kugel. Original-Vergrößerung, 20x.

Die Neurosphäre Test ² hat große Aufmerksamkeit in der Forschung nicht nur für die Isolierung und Untersuchung der NSCs aus CNS ^4-5, sondern auch für die Isolierung von anderen Arten von vermeintlichen Stammzellen aus zahlreichen Geweben, wie ^Brust-6 und Herz ⁷ gewonnen und für die Identifizierung von Gehirn-, Brust-und Darmkrebs Tumorstammzellen ^8-9 darauf hindeutet, dass diese Kultur-System eine Reihe von somatischen und Tumor-Vorläuferzellen Zellpopulationen im ganzen Körper angewendet werden kann. Einige der Vorteile dieser Methode sind ihre Einfachheit, Reproduzierbarkeit und die Erzeugung von unbestimmten Anzahl von Zellen aus einem kleinen Stück Gewebe oder sogar eine kleine Anzahl von Zellen in einem chemisch definierten serumfreien Medium.

Es sollte betont werden, dass die Zahl der Neurosphären in Kultur repräsentieren nicht die Anzahl der Stammzellen als Neurosphären entweder von bona fide Stammzellen oder aus mehr eingeschränkt Vorläuferzellen ¹⁰ abgeleitet werden kann. In dieser Hinsicht ein Assay wurde entwickelt, um korrekt aufzählen NSCs in Kultur ^11.

Verschiedene Methoden werden verwendet, um Neurosphären in einzelne Zellsuspension einschließlich der mechanischen und enzymatischen Methoden distanzieren. Obwohl mechanische Methode ist die ursprüngliche Neurosphäre Dissoziation Methode ^2, bedarf es einer Menge Erfahrung und ihre Effizienz variiert je nach Anbieter. Auch diese Methode kann zu erheblichen Zelltod und Schaden, wenn durch einen unerfahrenen Person, die die Genauigkeit des Assays, die auf Neurosphäre Dissoziation ³ berufen Rückgang angewendet. Trypsin-EDTA enzymatische Spaltung hat auch einige Vorteile und Nachteile. Enzymatische Dissoziation von Neurosphären ist einfach, effizient und reproduzierbar, wenn für die entsprechende Länge der Zeit und auf die richtige Größe Neurosphären durchgeführt. Obwohl es kein Nebeneinander Studien zum Vergleich der Wirkungen dieser beiden Methoden der Neurosphäre Dissoziation sind, zeigt unsere Erfahrung, dass eine kurze Inkubationszeit (3-5 Minuten) der Neurosphären (bis 250 um) mit Trypsin-EDTA führt zu einer effizienten Dissoziation ohne störende ihre Lebensfähigkeit, der Vermehrung und Differenzierung Fähigkeiten. Auf der anderen Seite könnte lange Belichtungszeiten von Neurosphären (vor allem für die großen verwilderten Neurosphären) Trypsin-EDTA zu schweren Schäden an Rezeptoren auf der Zelloberfläche, Zellaufschluss und möglicherweise zum Zelltod. Überbelichtung zu Trypsin-EDTA könnte auch mit einer Kugel Bildung und verursachen Zellen stören auf das Substrat legen und zu differenzieren.

Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Overstreet Foundation unterstützt.