العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

هذا البروتوكول الفيديو يوضح طريقة الفحص neurosphere لتوليد وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية من المنطقة المحيطة بالبطين الماوس الكبار ، ويقدم رؤى التقنية لضمان تحقيق الثقافات يمكن لأحد أن neurosphere استنساخه.

وكان أول وصف العزلة والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية المفترضة (NSCs) من دماغ الفئران رينولدز الكبار بحلول عام 1992 وايس توظيف المعرفة كيميائيا منظومة الثقافة المصل الحرة المعروفة باسم مقايسة neurosphere (NSA). في هذا الاختبار ، فإن غالبية أنواع الخلايا المتمايزة تموت في غضون بضعة أيام للثقافة ولكن مجموعة صغيرة من الخلايا السليفة عامل النمو استجابة الخضوع الانتشار النشط في وجود عامل نمو البشرة (EGF) و / عامل النمو الأساسي ليفية (bFGF). هذه الخلايا شكل مستعمرات خلايا غير متمايزة تسمى neurospheres ، والذي بدوره يمكن subcultured توسيع مجموعة من الخلايا الجذعية العصبية. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن يكون ذلك حافزا للتمييز الخلايا ، توليد ثلاثة أنواع رئيسية من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي أي ، النجمية ، وoligodendrocytes. هذا الاختبار يوفر أداة لا تقدر بثمن لتوريد متناسقة ، مصدر متجدد السلائف CNS غير متمايزة ، والتي يمكن استخدامها في المختبر في الدراسات ، وكذلك لأغراض علاجية.

هذا الفيديو يوضح طريقة لإنشاء وكالة الامن القومي وتوسيع NSCs من المنطقة المحيطة بالبطين الماوس الكبار ، ويقدم رؤى التقنية لضمان تحقيق الثقافات يمكن لأحد أن neurosphere استنساخه. الإجراء يشمل حصاد الدماغ من الماوس الكبار ، والتشريح الدقيقة في المنطقة المحيطة بالبطين ، وإعداد الأنسجة والثقافة في وكالة الامن القومي. هو أول الأنسجة التي تحصد هضمها كيميائيا باستخدام التربسين - EDTA ثم فصلها آليا في مجلس الأمن القومي لتحقيق المتوسطة تعليق خلية واحدة ومطلي أخيرا في وكالة الامن القومي. بعد 7-10 أيام في الثقافة ، مما أدى neurospheres الأولية مستعدون للثقافة فرعية للوصول الى كمية من الخلايا المطلوبة لإجراء التجارب في المستقبل.

الجزء 1 : عاديه إعداد قبل الشروع في تشريح :

متوسطة الحجم المناسب لمجلس الأمن القومي الشامل ، عن طريق المزج NeuroCult NSC بصل متوسطة والمكملات NeuroCult انتشار NSC بنسبة 9:1 ، على التوالي. ويمكن أيضا أن يكون مجلس الأمن القومي المتوسطة المحرز في المختبر ، استنادا للنمو تشكيل مجلس الأمن القومي المتوسطة المنشورة في الأدبيات ¹. إذا كان المختبر الخاص لا يملك الكثير من الخبرة مع جعل المتوسط ​​، ونحن نوصي بشدة لاستخدام المتوسطة المتوفرة تجاريا التي تم السيطرة النوعية للنمو NSCs قبل بيعها (والذي هو الحال بالنسبة لNeuroCult ، Technolgies الخلايا الجذعية).
1. هو حرارة متوسطة وتصل في حمام ماء C ° 37.
الباردة HEPES - مخزنة المتوسطة الأساسية الدنيا (HEM) مع نسبة عالية من المضادات الحيوية (10 ٪) لغرض التشريح والغسيل. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا NSC المتوسطة القاعدية مع مكملات المضادات الحيوية يمكن استخدامها لهذا الغرض. 30-40 مل من HEM الباردة تحتوي على مضادات حيوية في أنابيب معقمة 50 مل لجمع الدماغ. البلاستيك 10cm عدة أطباق بتري لاجراء تشريح دماغ واحد خلال 10cm طبق بتري معقمة الزجاج لاجراء تشريح الأنسجة. الأدوات الجراحية اللازمة لإزالة المخ (مقص كبير ، وأشار مقص صغير ، ملقط كبير ، ملقط صغير منحن ، وملعقة صغيرة) أو لتشريح الأنسجة (ملقط صغير ، ملقط غرامة المنحني ، ومشرط) باستخدام الزجاج حبة معقمة في 250 درجة مئوية أو غيرها من وسائل تعقيم المتاحة. مجهر تشريح مع الكحول 70 ٪ واقامة داخل غطاء PC2.

الجزء 2 : حصاد مخ الفأر الكبار والتشريح الجزئي :

1. الكبار 2-4 (5-8 أسابيع من العمر) وتخدير الفئران وفقا لأحد المؤسسية المعتمدة باستخدام بروتوكول الحيوان 3-4 ٪ isoflurane أو عن طريق الحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال (120 ملغ / كلغ).
خلع عنق الرحم للتأكد من أن الحيوانات لا تعاني من الألم والضيق. الماوس تخدير على البطن على ورقة ماصة الأنسجة ، ويتم شطف الرأس مع الإيثانول 70 ٪ لتعقيم المنطقة. مقص كبير لقطع رأس الحيوان فقط فوق منطقة النخاع الشوكي عنق الرحم. مقص صغير وأشار إلى جعل متوسط ​​الذيلية ، وخفض منقاري لفضح الجمجمة. وقطع حواف الجلد للاحتفاظ الرأس ومن ثم يتم وضع كل شفرة من مقص صغير في تجويف كل المدارية لاجراء خفض الاكليلية بين المدارات.
2. استخدام ماغنوم الثقبة كمدخل ، يتم قطع طولية من خلال الجمجمة على طول الدرز السهمي وتتم أيضا اثنين من التخفيضات الجانبية عند تقاطع الجدران الجانبية وقاعدة الجمجمة. وينبغي اتخاذ الحذر بعدم الدماغ الكامنة من خلال جعل الجروح الصغيرة وضمان زاوية من ريش ضحل ممكن.
3. يتم اغتنامها الجمجمة تغمر كل الكرة الأرضية ومقشر الخارج باستخدام الملقط منحنية لفضح الدماغ ، ثم باستخدام ملعقة صغيرة المبللة ، وحصد في الدماغ في أنبوب 50 مل تحتوي على HEM.
4. ويتكرر هذا الإجراء حتى يتم حصادها كل العقول.
5. يتم نقلها إلى أدمغة هود PC2 وغسلها ثلاث مرات مع حجم ما يكفي من HEM العقيمة البارد لإزالة الملوثات المحتملة مثل الدم والشعر. ثم يتم نقلها إلى أدمغة 10cm طبق بتري تحتوي HEM.
6. لتشريح المنطقة المحيطة بالبطين الدماغ الأمامي ، يوضع طبق يحتوي على العقول تحت المجهر تشريح مع التكبير منخفضة. ثم يتم وضع العقول المسطحة على سطحها البطني ، وعقد من الجانب الذيلية باستخدام الملقط منحني الغرامة. وتستخدم مجموعة أخرى من منحني ملقط لإزالة بصيلات الشم.
7. بعد إزالة بصيلات الشم ، ويتم تناوب العقول لفضح الجانب البطني.
8. يتم إجراء خفض 90 ° الاكليلية على مستوى chiasm البصرية ويتم تجاهل الجوانب الذيلية من العقول.
9. ويتكرر هذا الإجراء حتى يتم كل العقول مقطوع.
10. وفي تضخم أعلى ، والجوانب منقاري من العقول بحيث يتم تناوب على سطح قطع تواجه التصاعدي. أولا ، يتم إزالة الحاجز والتخلص منها باستخدام غرامة منحني الدقيقة مقص أو منحنية ، ملقط مدبب ، ومن ثم يتم قطع طبقة رقيقة من الأنسجة المحيطة الجدار الجانبي من البطينين ، باستثناء لحمة الجسم المخطط والجسم الثفني. تشريح الأنسجة غير مجمعة في 10cm العقيمة الزجاج طبق بتري.
11. ويتكرر هذا الإجراء حتى يتم كل العقول الصغيرة تشريح.

الجزء 3 : إعداد الأنسجة والخلايا تصفيح :

1. هو المفروم النسيج المجمعة لحوالي 1-2 دقائق باستخدام شفرة المشرط ، حتى قطعة صغيرة جدا لا تزال قائمة.
2. A الحجم الإجمالي من 3 مل من 0.05 ٪ ويستخدم التربسين - EDTA ويتم نقل جميع الأنسجة المفروم في أنبوب 15 مل. 3ml التربسين - EDTA غير كافية لهضم جيد للأنسجة التي تحصد ما يصل إلى 8 من الفئران.
3. يتم تحضين الأنبوب لمدة 7 دقائق في حمام ماء C ° 37.
4. في نهاية الحضانة الأنزيمية ، يتم إرجاع أنبوب لغطاء المحرك وإضافة حجم مساو من مثبط التربسين فول الصويا لوقف النشاط التربسين.
5. هو pipetted التعليق صعودا وهبوطا لضمان تعطيل التربسين ومكعبات ثم بواسطة الطرد المركزي عند 700 دورة في الدقيقة (110 غ) ل5min.
6. يتم تجاهل وطاف ، ومعلق في قطعة النسيج في 150 ميكرولتر من معقمة متوسطة القاعدية مجلس الأمن القومي. إعادة تعيين إلى 200 ميكرولتر ماصة ، ويتم فصله من قبل كتل pipetting بلطف صعودا وهبوطا (3-7 مرات) حتى يتم التوصل إلى سلسة حليبي تعليق خلية واحدة. عدد من الخطوات pippetting يعتمد بشكل مباشر على حجم الجزيئات في الأنسجة المفروم (من الأفضل أن نسيج اللحم المفروم إلى قطع صغيرة جدا وذلك لزيادة المساحة السطحية للنشاط التربسين). قد تفارق الميكانيكية طويلة وقوية تؤدي إلى تشكيل المجال بسبب انخفاض الجذعية العصبية والسلف موت الخلية.
7. لإزالة الحطام وقطع من الامم المتحدة وفصلها ، يضاف القاعدية NSC المتوسطة إلى تعليق خلية نأت للوصول إلى إجمالي حجم 15ml - 10. يتم تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة 40μm الخلية في أنبوب الحجم المناسب ، ومكعبات ثم بواسطة الطرد المركزي عند 700 دورة في الدقيقة (110 غ) ل5min.
8. لإزالة مزيد من الحطام ، فمن المستحسن أن resuspend بيليه في 10-15 مل من أجهزة الطرد المركزي ومجلس الأمن القومي المتوسطة تعليق خلية عند 700 دورة في الدقيقة (110 غ) ل5min.
9. يتم تجاهل وطاف. ثم يتم معلق الخلايا في الحجم المناسب للمتوسطة NSC كاملة تستكمل مع EGF 20ng/ml ، bFGF 10ng/ml و1μl/ml الهيبارين 0.2 ٪.
فصل الأنسجة من المخ إلى واحد T25 قارورة (التي تحتوي على 5 مل من المتوسط ​​كاملة). ثم يتم تحضين الخلايا في 37 ° C ثاني ، و 5 ٪ ₂ لمدة 7-10 أيام التي neurospheres الوقت يجب أن يكون تشكيلها. الأنسجة التي تحصد من الدماغ يمكن أن تولد عادة neurospheres 400-600.

الجزء 4 : الركض وتوسيع NSCs :

1. عندما neurospheres مستعدون للثقافة فرعية (150-200 ميكرون في القطر) ، تتم إزالة المتوسطة المجالات مع وقف التنفيذ من قوارير ، وضعت في حجم الأنسجة المعقمة المناسبة أنبوب الثقافة ، وطرد في الدقيقة 700 (110 غ) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. يتم تجاهل وطاف ومعلق المجالات في 1 مل من 0.05 ٪ التربسين - EDTA. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا أن تكون neurospheres passaged باستخدام طرق كيميائية أو ميكانيكية التفكك وصفها في الأدب ^2،3.
3. يتم تحضين تعليق خلية عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 2-3 دقيقة ، ثم يتم استخدام حجم مساو من مثبط التربسين فول الصويا لوقف النشاط التربسين.
الخلية تعليق صعودا وهبوطا لضمان أنه تم التربسين المعطل تماما. الخلية عند 700 دورة في الدقيقة تعليق لمدة 5 دقائق. ثم تتم إزالة طاف ومعلق الخلايا في 1 مل من المتوسطة مجلس الأمن القومي. 10μl لتعليق الخلية مع 90μl التريبان الأزرق لإجراء تعداد خلايا.
4. يتم مطلي الخلايا بتركيز 5x10 ⁴ خلايا / مل في المتوسط ​​تستكمل مع مجلس الأمن القومي الشامل. EGF 20ng/ml ، bFGF 10ng/ml و1μl/ml الهيبارين بنسبة 0.2 ٪ في دورق حجم مناسب زراعة الأنسجة. استخدام المتوسط ​​5ml لT25 20 مل ، لT75 و 40 مل T175 القوارير.
neurospheres الثانوية في 5-7 أيام عندما حضنت في 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ ₂.

الجزء 5 : نتائج الممثل :

في الابتدائي الكبار NSC الثقافة ، فإن الغالبية العظمى من الخلايا تموت بعد 2-3 أيام ولكن النمو السلائف عامل الاستجابة (بما في ذلك الخلايا الجذعية والسلف) وسوف تتكاثر الخلايا (الشكل 1) وإنشاء مستعمرات خلايا غير متمايزة بعد 6-8 أيام. في هذه الثقافات على كمية كبيرة من الحطام عادة الحالية التي قد الحصول على شكل كروي ، ويمكن أن يكون مخطئا لneurospheres. كمية من الحطام وتعتمد اعتمادا مباشرا على التشريح الجزئي وتقنيات إعداد الأنسجة. neurospheres الحقيقية هي مرحلة مشرقة (مضيئة) ، وتصبح أكثر كروية كما يزيد من حجم (انظر الفيديو). بعد 7-10 أيام ، لا بد من تقريب المجالات ولكن لا ضغط ، وينبغي أن تقيس ما بين 150 و 200 ميكرون ، وكذلك يجب أن يكون جامدة المسامير الصغيرة الواقعة على المحيط الخارجي في التكبير عالية (الشكل 2). إذا سمح للneurospheres أن تنمو كبيرة جدا ، فإنها تصبح داكنة اللون بسبب موت الخلايا في وسط المجالات. وneurospheres كبيرة يصعب فصل وتبدأ في نهاية المطاف إلى أن ترفق الركيزة وتمييزه.

الشكل 1. الثقافة الابتدائية NSC الكبار 3 أيام بعد الطلاء. الأسهم تظهر مستعمرات صغيرة من NSCs التكاثري. التكبير الأصلي ؛ 20X.

الشكل 2. neurosphere الممر بالغ واحد 7 أيام بعد الطلاء. لاحظ المسامير الصغيرة في محيط الكرة. التكبير الأصلي ؛ 20X.

اكتسبت مقايسة neurosphere ² اهتماما واسعا في الأوساط البحثية ، ليس فقط لعزل ودراسة الجهاز العصبي المركزي من NSCs ^4-5 ولكن أيضا لعزل أنواع أخرى من الخلايا الجذعية من الأنسجة المفترضة عديدة ، مثل سرطان الثدي والقلب ^{6 7} و للتعرف على سرطان الثدي والمخ والخلايا الجذعية السرطانية القولون ^8-9 مما يشير إلى أن يمكن تطبيق هذا النظام الثقافة لعدد من السكان الجسدية وورم الخلايا السليفة في جميع أنحاء الجسم. بعض من مزايا هذه الطريقة تشمل في البساطة ، واستنساخ جيل من عدد غير محدد من الخلايا من قطعة صغيرة من الأنسجة أو حتى عدد قليل من الخلايا في وسيلة تعريف كيميائيا مجانا المصل.

وينبغي التأكيد على أن عدد neurospheres في الثقافة لا يمثل عدد الخلايا الجذعية ويمكن أن تستمد من neurospheres إما بحسن نية أو الخلايا الجذعية من أكثر الخلايا الاصلية يقتصر ^10. في هذا الصدد تم وضع مقايسة تعداد صحيح NSCs في الثقافة ^11.

وتستخدم أساليب مختلفة لفصل neurospheres في تعليق خلية واحدة بما في ذلك الطرق الميكانيكية والأنزيمية. على الرغم من الطريقة الميكانيكية هي الطريقة الأصلية تفارق neurosphere ² ، فإنه يتطلب الكثير من الخبرة والكفاءة فيها تختلف تبعا للمشغل. هذا الأسلوب قد يسبب موت الخلايا كبيرة أيضا والأضرار إذا ما طبقت من قبل فرد عديم الخبرة ، والتي يمكن أن تقلل من دقة المقايسات التي تعتمد على تفكك neurosphere ^3. التربسين - EDTA تفارق الأنزيمية أيضا بعض مزايا وعيوب. تفارق الأنزيمية من neurospheres غير سهلة وفعالة وقابلة للتكرار إذا أجريت لمدة زمنية مناسبة وعلى neurospheres في الحجم الصحيح. على الرغم من أنه لا توجد جنبا إلى جنب الدراسات المقارنة بين آثار هذه الأساليب اثنين من التفكك neurosphere ، فإن تجربتنا تبين أن حضانة قصيرة (3-5 دقائق) من neurospheres (تصل إلى 250 ميكرون) مع التربسين - EDTA النتائج في كفاءة تفارق من دون إزعاج لهم البقاء والانتشار وتمايز القدرات. من ناحية أخرى ، قد طويلة من التعرض neurospheres (وخاصة بالنسبة للneurospheres متضخمة كبير) لالتربسين - EDTA تسبب ضررا خطيرا للمستقبلات سطح الخلية ، والهضم الخلية وموت الخلايا المحتملة. قد التعرض المفرط لالتربسين - EDTA تتداخل أيضا مع تشكيل الخلايا ويسبب المجال لإرفاق الركيزة وتمييزه.

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مؤسسة Overstreet.