Spectrométrie de fluorescence des rayons X

Source : Laboratoire de Dr. Lydia Finney, Argonne National Laboratory

Fluorescence des rayons x est un induit, émis un rayonnement qui peut être utilisé pour générer l’information spectroscopique. Microscopie de fluorescence de rayons x est une technique d’imagerie non destructifs qui utilise l’émission de fluorescence induite des métaux d’identifier et de quantifier leur répartition spatiale.

Tout d’abord, les échantillons doivent être préparés qui sont minces, plate et sèche (sauf si un étage cryogénique spécial est disponible pour le microscope). Ensuite, un faisceau de rayons x monochromatique concentré est scannée raster dans l’ensemble de l’échantillon. Le faisceau de rayons x permet de surmonter l’énergie de liaison de certains des électrons aux atomes de métal coque intérieure, et quand les électrons coquille externe tombent dans les postes vacants, une deuxième radiographie est émise par l’échantillon. À chaque instant de ce raster-scan, un spectre d’émission de x-ray fluorescence sont recueilli par le détecteur.

Dans cette partie du spectre, la longueur d’onde et l’intensité de tous les rayons x émis par l’échantillon est enregistrée. Basé sur l’énergie caractéristique (en raison de l’espacement des orbitales de l’atome), de la fluorescence émise et de l’intensité relative caractéristique de K_α et_β K (par exemple, qui sont tous deux reconnus), le spectre d’émission permet de déterminer l’identité des métaux présents ainsi que la quantité.

Cette vidéo vous expliquera le processus de préparation d’un échantillon mince et sec des cellules adhérentes pour imagerie par fluorescence. Le processus d’analyse des échantillons sera expliqué brièvement, et décrit une image par exemple.

1. préparer les fenêtres de nitrure de silicium

1. Utiliser des pinces inversées pour ramasser une fenêtre (nitrure de silicium windows seront brisera en cas de chute).
2. Placer la fenêtre sur une lame de verre, côté plat vers le haut.
3. Respecter les petits morceaux de Scotch sur les côtés de la fenêtre et utilisez-les pour respecter les fenêtres vers le bas de la boîte de Pétri.
4. Stériliser les fenêtres de Pétri avec les rayons UV. Ceci peut être accompli avec le paramètre auto-crosslink sur une armoire UV-réticulation, suivie par l’irradiation UV supplémentaire sous la lampe UV dans la hotte à flux laminaire pendant environ 1 h.

2. les cellules sur les vitres de nitrure de silicium stérilisé de placage

1. Tenir le plat avec elle inclinée à un angle de 45°.
2. Ajouter des éléments multimédias en pipettant également, du côté du plat et soulager lentement l’angle d’inclinaison pour enrober la fenêtre avec les médias.
3. Ajouter des cellules à la boîte de Petri, de la même manière et incuber.
4. Observer les cellules occasionnellement à l’aide d’un microscope optique pour déterminer quand ils sont prêts à l’emploi.

3. la fixation et le séchage des cellules

1. Dans une hotte à flux laminaire, retirez le support en aspirant doucement tout en inclinant le plat tel que décrit ci-dessus.
2. Ajouter PBS, pipetage vers le côté du plat en le tenant à angle. Lentement, soulager l’angle d’inclinaison pour enrober la fenêtre avec du PBS.
3. Supprimer les PBS avec aspirant doucement.
4. Pipetage vers le côté du plat et en tenant à un angle, ajoutent 4 % PFA/PBS, pH 7 pour couvrir les cellules. Garder dans cette solution pendant 20 min à température ambiante.
5. Retirer le mélange PFA/PBS et jeter comme des matières dangereuses.
6. Ajouter PBS, pipetage comme décrit ci-dessus.
7. Répétez les étapes 3.5 et 3.6 deux fois.
8. Supprimer les PBS en aspirant doucement.
9. Ajouter des tuyaux de 20 mM, saccharose de 200 mM, pH 7.
10. Enlever le tuyaux/saccharose en aspirant doucement.
11. Répétez les étapes 2.8 et 2.9 deux fois.
12. Rapidement les bords de la tache et mise en retrait de la fenêtre avec un Kimwipe en arrière, puis définir la fenêtre sur une surface propre, comme un tapis de caoutchouc grille, sécher.

4. imagerie de Fluorescence des cellules de rayons x

1. Une fois que l’échantillon est sec, vérifiez la présence de cellules sur les fenêtres à l’aide d’un microscope optique.
2. Vernis à ongles permet de sécuriser les fenêtres à un titulaire en aluminium fournie par la source de rayonnement.
3. Insérez le support d’aluminium dans une monture cinématique et puis placez-le en position au point focal de l’optique dans le microscope à rayons x et à un angle d’environ 45° du faisceau de rayons x, monté sur les étapes de nanopositionnement échantillon.
4. Sortir de la zone d’instrument microscope à rayons x (habituellement une huche faite des murs de plomb) et ouvrir la trappe. Effectuer les étapes restantes à distance.
5. À l’aide d’une plaque de zone ou miroirs Kirkpatrick-Baez, concentrer le faisceau de rayons x monochromatique (habituellement 10 keV d’énergie) jusqu'à une taille de tache sub-micronique.
6. Utiliser les étapes d’échantillon de nanopositionnement et visualiser la position du faisceau de rayons x sur l’échantillon avec une caméra précalibré scintillateur en aval, déterminent la largeur appropriée et la hauteur du raster scan afin de capturer les données de l’échantillon.
7. Avec le détecteur de dérive de silicium dispersive en longueur d’onde à 90° pour le faisceau incident et environ 3 mm ou moins de l’échantillon, recueillir un spectre pour l’essai avec un temps de pause de 1 à 2 sec.
8. La visualisation du spectre pour l’essai, choisissez une durée appropriée pour l’analyse, pour fournir le signal sur bruit suffisant pour les éléments d’intérêt.
9. Choisissez une résolution appropriée pour l’analyse, ce qui n’est pas significativement plus petite que la taille de tache du faisceau sur l’échantillon, ni plus grand que les caractéristiques d’intérêt dans l’échantillon.
10. Programmer la numérisation dans le logiciel de numérisation et de recueillir l’image.

La carte de fluorescence de rayons x d’une cellule adhérente est illustrée à la Figure 1. Chaque panneau présente la répartition d’un élément particulier (par exemple, cuivre, fer, zinc, etc.) sur la cellule. Le panneau intitulé « s_a » montre l’absorption des rayons x.

Figure 1. Carte de fluorescence de rayons x d’une cellule adhérente. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Imagerie de fluorescence de rayons x peut être un outil utile dans de nombreux domaines, y compris les sciences forensiques, géosciences, biologie, science des matériaux et même dans l’étude de notre patrimoine culturel. En science des matériaux, il peut aider à trouver des défauts en copeaux et catalyseurs faites avec des métaux. Travaux de patrimoine culturel, il a servi à identifier les métaux toxiques dans les cheveux de célébrités mortes (p. ex., Beethoven) et d’identifier la source des peintures utilisées dans l’art. En biologie, il est utilisé pour étudier les métaux naturels qui effectuent la biochimie important. En sciences de la terre, il est souvent utilisé pour étudier les événements relatés dans le dossier rock. Deux caractéristiques particulières qui rendent l’imagerie de fluorescence de rayons x utiles dans donc beaucoup de domaines est 1) son non destructive, ainsi que bon nombre des éléments qui sont rare, ou de valeur élevée peut être photographiée et 2) alors que la préparation des échantillons décrite ici pour les cellules est complexe, car les cellules doivent être séchées-pour nombreux matériaux tels que des roches, art ou autres articles, il y a très peu de préparation échantillon requis , autres qu’il doit être plat et exempt de poussière. Un synchrotron est obligatoire qui est le mieux accessible grâce à la collaboration avec des scientifiques de ces installations, la technique peut être très accessible.