Chromatographie par échange d'ions

Source : Laboratoire du Dr B. Jill Venton - University of Virginia

Chromatographie d’échange ionique est un type de chromatographie qui sépare les analytes issu des frais. Une colonne est utilisée qui est remplie d’une phase stationnaire chargée sur un support solide, appelé une résine échangeuse d’ions. Chromatographie échangeuse de cations forts sépare préférentiellement les cations en utilisant une résine chargée négativement, tandis que la chromatographie échangeuse d’anions forts choisit préférentiellement des anions à l’aide d’une résine chargée positivement. Ce type de chromatographie est apprécié pour la préparation de l’échantillon, par exemple dans le nettoyage des protéines ou des acides nucléiques des échantillons.

Chromatographie d’échange ionique est un processus en deux étapes. Dans un premier temps, l’échantillon est chargé sur la colonne dans un tampon de charge. La liaison de l’échantillon chargée à la résine de colonne est basée sur des interactions ioniques de la résine pour attirer l’échantillon de charge opposée. Ainsi, les échantillons chargés de polarité opposée à la résine sont fortement liés. Autres molécules qui ne payent pas ou sont de charge opposée ne sont pas liés et sont lavés par le biais de la colonne. La deuxième étape consiste à éluer l’analyte qui est lié à la résine. Ceci est accompli avec un gradient de sel, où la quantité de sel dans la mémoire tampon est lentement augmentée. Fractions sont encaissées à la fin de la colonne que l’élution se produit et l’échantillon purifié d’intérêt peut être récupéré dans l’une de ces fractions. Une autre technique, telles que la spectroscopie, peut être nécessaire d’identifier quelle fraction contient l’échantillon. Chromatographie d’échange ionique est particulièrement utile dans les études de protéine, d’isoler les protéines d’intérêt qui ont une charge spécifique ou la taille, car la taille permet de déterminer le nombre d’interactions avec la résine.

Chromatographie d’échange ionique est une technique de séparation plus générale que la chromatographie d’affinité, qui est aussi souvent utilisée dans la préparation des échantillons de protéine, où un anticorps est liée à une colonne pour lier un analyte spécifique. Une nouvelle colonne d’affinité doit être achetée pour chaque analyte, tandis que le même type de colonne échangeuse d’ions, souvent atteints de différents troubles élution, peut servir à nettoyer les nombreuses protéines ayant la même charge. Chromatographie échangeuse d’ions peut également servir en conjonction avec d’autres types de chromatographie qui séparent basé sur d’autres propriétés. Par exemple, chromatographie d’exclusion stérique se sépare selon la taille et pourrait être utilisée avant la chromatographie échangeuse d’ions pour choisir composés de seulement une taille donnée.

Chromatographie d’échange ionique est régie par les principes des interactions chimiques ioniques qui mènent à l’adsorption réversible de l’analyte sur la phase stationnaire. La force de la liaison entre l’échantillon et le support solide est régie par le nombre et les types de groupes fonctionnels sur l’échantillon et la résine. Le tampon de charge est généralement faible conductivité afin de promouvoir les interactions entre l’échantillon et la résine. Résines échangeuses de cations forts sont généralement des groupes fonctionnels acide sulfonique tandis que résines échangeuse de cations faibles ont des acides carboxyliques. Résines d’échange anionique fortes contiennent amines quaternaires, tandis que les résines échangeuse d’anions faible amines secondaires ou tertiaires de fonctionnalité. Les termes forts et faibles font référence aux propriétés de la matière de la colonne et pas dans quelle mesure il lie d’un analyte acide/base. Résines faibles sont facturés sur une plage de pH plus petite que des résines solides, mais toujours lient les analytes très efficacement et pourraient être un bon choix si elles sont chargées dans la plage de pH nécessaire. Avant utilisation, colonnes échangeuses d’ions sont équilibrés à un pH à l’aide d’un tampon d’équilibration.

Pour éluer l’échantillon, un gradient de sel est utilisé. Les échantillons qui sont moins étroitement liés à la résine vont éluer tout d’abord, comme le sel se gênent plus facilement leur liaison ionique de la colonne. Les échantillons qui sont plus étroitement lié va éluer plus tard, lorsqu’on utilise des quantités plus élevées de sel. En règle générale, un dégradé linéaire de sel est utilisé, où la concentration en sel augmente au fil du temps de façon linéaire. Toutefois, des gradients de l’étape peuvent être utilisés où la concentration de sel est intensifiée au fil du temps.

Une considération importante pour les expériences d’échange ionique est le pH des tampons. Le pH doit être maintenu pour que l’analyte d’intérêt est chargé et se liera à la résine. Pour les protéines, l’accusation repose sur le point isoélectrique de la protéine, où la protéine est chargée de manière neutre et mesurée comme pI. Le pH en comparaison de la pI de la protéine donne des informations sur l’accusation de protéine attendue. En chromatographie échangeuse de cations, élévation du pH provoque l’analyte à être moins positivement chargée et moins susceptible d’interagir avec la résine chargée négativement. De même, en chromatographie échangeuse d’anions, abaissement du pH provoque l’analyte charge moins négative et moins susceptible d’interagir avec la résine chargée positivement. Ainsi des ajustements de pH permet également à éluer sélectivement les analytes de la colonne. L’utilisation d’ajustements du pH au lieu de sels pourrait être avantageuse pour séparer deux types différents de protéines avec des valeurs différentes de pI.

1. préparation de l’échantillon et la colonne

1. Dans cette démonstration, un mélange de 2 protéines est séparé sur une colonne échangeuse de cations : hémoglobine et le cytochrome C. Ajouter 0,2 mL équilibration tampon (pH 8,1) dans l’échantillon de la protéine et les vortex pour bien mélanger. Centrifuger pendant 2 min enlever toute la mousse.
2. Placer la colonne échangeuse de cations dans un tube à essai pendant 5 min permettre à la résine pour s’installer. Fixer le tube à essai avec la colonne sur un trépied anneau pour s’assurer que c’est en position verticale.
3. Ouvrez le capuchon supérieur de la colonne, puis le couvercle inférieur. Laisser le tampon dans la colonne à s’écouler dehors par gravité dans le tube à essai.
4. Laver la colonne avec un colonne-volume (dans ce cas le volume de la colonne est 0,3 mL) de tampon de l’équilibration. Laissez la première colonne-volume (0,3 mL) d’équilibration tampon goutte à goutte sur le flacon des déchets avant d’ajouter la deuxième colonne-volume. Cette étape permet la colonne équilibrer avec le tampon de l’équilibration. Ajouter lentement le tampon d’équilibration dans cette étape ne pas déranger la résine.

2. exécuter un échantillon de protéine à travers une colonne échangeuse de cations

1. Mettre la colonne dans un tube à centrifuger 2 mL étiqueté « Unbound 1 ». Soigneusement charger 0,1 mL de l’échantillon de protéines sur le haut de la colonne.
2. Une fois que l’échantillon a été chargé sur le dessus de la colonne, lavez-le avec 0,3 mL de tampon de l’équilibration en ajoutant de la mémoire tampon dans la partie supérieure de la colonne et laissez-le s’égoutter complètement. Répétez cette étape 4 x (pour un total de 5 lavages) et recueillir chaque lavage dans un tube à centrifuger séparée, de 2 mL. Marquer les tubes comme « Unbound 1-5 ».
3. Pour les 2 derniers lavages, centrifuger pendant 10 s à 1 000 x g pour s’assurer que toutes les espèces non consolidés sont détacher de la colonne. Tout échantillon qui se lie à la colonne ne doit pas être dans ces lavages, mais échantillon qui ne lie pas lavera consignes. Centrifugation fournit plus de force pour les matériaux non lié au large de la colonne de lavage.
4. Mettre la colonne dans un nouveau tube de prélèvement de centrifugeuse 2 mL étiqueté « Bound 1 ». Mettre 0,3 mL de tampon d’élution (haut sel, pH 5,5) sur le dessus de la colonne. Centrifuger l’éluant qui en résulte pour 10 s à 1 000 x g.
5. Répéter l’étape d’élution 2 fois plus en plaçant la colonne dans un nouveau tube à centrifuger, ajouter 0,3 mL, et centrifugation pendant 10 s. étiquette ces « Bound 2 et 3 ».
6. Enregistrer tous les changements de couleur ou observations sur les fractions. L’hémoglobine est une protéine de couleur qui ressemble brun-rougeâtre, tandis que le cytochrome C est de couleur rougeâtre.

3. résultats : Échangeuse de cations de l’hémoglobine et du Cytochrome C

1. Cytochrome C a un pI de 10,5 et hémoglobine un pI de 6,8. Ainsi, lorsqu’on utilise un tampon de l’équilibration du pH 8.1, l’hémoglobine ne lie pas à la colonne parce qu’il est chargé négativement. Cytochrome C est chargé positivement à ce pH et soit lié à la colonne car le pH < pI.
2. L’hémoglobine est observée dans les fractions non liées, car il n’est pas lié à la colonne.
3. Cytochrome C est observée dans les fractions liées, parce qu’elle était liée à la colonne échangeuse de cations.

La figure 1. Photo de la fraction libre (hémoglobine) et la fraction liée (cytochrome C).

Chromatographie d’échange ionique est largement utilisée en biochimie pour isoler et purifier les échantillons de protéines. Les protéines ont plusieurs acides aminés avec groupes fonctionnels qui sont facturés. Les protéines sont séparées basé sur la charge nette, qui dépend de la pH. Certaines protéines sont facturés plus positivement tandis que d’autres portent une charge plus négative. En outre, balises de peptide peuvent être génétiquement ajoutés à une protéine pour lui donner un point isoélectrique qui n'est pas dans la gamme des protéines normales, rendant possible de séparer complètement. Chromatographie échangeuse d’ions est utile pour séparer des complexes de protéines multimériques, comme différentes configurations aurait différentes quantités de charge et les différentes interactions.

Une autre application majeure de chromatographie échangeuse d’ions est analyse de l’eau. Chromatographie échangeuse d’anions peut être utilisée pour mesurer la concentration des anions, y compris des sulfates, de nitrates, de nitrites, de fluorure et de chlorure. Chromatographie échangeuse de cations est utilisée pour mesurer la concentration de cations tels que sodium, potassium, calcium et magnésium. Un type de chromatographie échangeuse d’ions est également utilisé dans la purification de l’eau, comme la plupart adoucisseurs d’eau filtrer les ions calcium et du magnésium dans l’eau dure en les liant à une résine, qui libère le sodium dépendant. Métaux lourds comme le cuivre ou le plomb, peut également être retirés de l’eau à l’aide de la chromatographie échangeuse d’ions.

Chromatographie d’échange ionique est également utile dans la purification de métal. Il peut être utilisé pour purifier les actanides, comme le plutonium et retirez-la de barres de combustible irradié des réacteurs nucléaires. Il peut également servir à récupérer l’uranium et retirez-la de l’eau ou d’autres échantillons environnementaux.