Isolement des bactéries fécales à partir des échantillons d'eau par filtration

Source : Laboratoires du Dr Ian poivre et Dr Charles Gerba - Université de l’Arizona
Démonstration d’auteur : Luisa Ikner

La qualité des eaux destinée à une utilisation dans des milieux agricoles, récréative et domestique est d’une grande importance en raison du risque de flambées de maladies d’origine hydrique. Les agents microbiens impliqués dans ces événements incluent des parasites, bactéries et virus qui sont détachent en grand nombre dans les selles des personnes infectées et des animaux. Transmission aux hôtes nouveaux et sensibles peut alors se produire par voie fécale-orale après ingestion d’eau contaminée. Par conséquent, la capacité de surveiller les sources d’eau pour la présence de microorganismes pathogènes est importante afin d’assurer la santé publique.

En raison de la multiplicité et la variété potentiellement pathogènes fécale-orale qui peuvent être présents dans l’eau et leurs concentrations variables, il est peu pratique et coûteux d’analyser directement pour chacun d’eux sur une base régulière. Par conséquent, les essais microbiologiques pour la surveillance de la qualité de l’eau emploient des bactéries indicatrices coliformes. Coliformes fécaux constituent en partie, la microflore intestinale normale de mammifères à sang chaud, n’est pas pathogènes et est constamment excrétés dans les fèces. Par conséquent, la détection de coliformes dans l’eau signifie qu’un communiqué de selles s’est produite, et que les micro-organismes pathogènes nuisibles peuvent aussi être présents.

La technique de filtration sur membrane est utilisée pour évaluer la qualité microbiologique de l’eau en testant des bactéries fécales indicatrices. Une quantité d’eau (par exemple 100 mL) est passé à travers une membrane spécialisée avec une taille de pore moyenne minimale de 0,45 µm, facilitant la capture des bactéries, car ils sont environ 1 µm en taille. Après filtration, la membrane est soigneusement appliquée à un milieu de culture spécialisés d’agarose et incubée dans les conditions appropriées à la culture des micro-organismes de la cible.

Lorsqu’il est appliqué pour une utilisation dans la surveillance de la qualité de l’eau, filtration sur membrane est idéale pour les sources de faible turbidité comme eau potable, eaux récréatives naturelles telles que les lacs et les réservoirs et piscines. Les eaux riches en particules (par exemple les eaux usées brutes) seront traduira par l’encrassement du filtre ; donc, seulement de petits volumes (par exemple 100 mL) peut être analysé. Filtration sur membrane n’est pas pratique pour les sources d’eau par des bactéries de grand nombre d’arrière-plan (ou non coliformes), qui peuvent augmenter la difficulté d’énumérer les bactéries coliformes cible sur la moyen d’agarose après incubation.

Cette vidéo montre la collection d’échantillons d’eau environnementale et de l’eau potable, la filtration sur membrane des échantillons et l’énumération de plusieurs types de colonies bactériennes fécal indicateur à l’aide de milieux de culture d’agarose spécialisées y compris les coliformes totaux, coliformes fécaux et les entérocoques fécaux. Essais supplémentaires afin de vérifier les colonies présumées sont également indiqués.

1. prélèvement d’échantillons et de traitement de l’eau

1. Recueillir plusieurs échantillons de 1 L eau de la source d’eau de test (p. ex. les fontaines d’eau, piscines, réservoirs, systèmes de distribution d’eau, des eaux usées brutes ou traitées) et le transport sur la glace au laboratoire pour analyse microbienne.
2. Stériliser ou désinfecter l’ensemble collecteur de filtration membranaire avant utilisation par autoclavage, l’exposition à l’inflammation de rayonnement (2 min) ou éthanol-flamme UV.
3. Lors du refroidissement de toutes les parties, brancher correctement le collecteur à un flacon pompe à vide et le vide de déchets par des filtration, contenant l’eau de Javel.
4. Éthanol-flamme stériliser une paire de pinces et avec eux, retirer un filtre à membrane stérile, quadrillées de son emballage. Membranes de 47 mm de diamètre avec une taille de pores de 0,45 µm sont généralement utilisés. Toutefois, autres diamètres et la taille des pores peut être utilisée sous réserve que la taille des pores peut piéger suffisamment les microorganismes de la cible, et au moins 70 % de la zone de filtre se compose de l’espace poral.
5. Placez le filtre sur le centre de la zone de filtration membranaire du collecteur et placer un entonnoir filtre stérile sur l’unité et le fixer en place.
6. Mesurer le volume d’eau désiré (par exemple 100 mL) et l’ajouter à l’entonnoir (une marque de 100 mL est visible sur l’entonnoir).
7. Appliquer un vide partiel [pression différentielle de 34 à 51 kPa (kiloPascals)] afin d’en tirer l’échantillon d’essai à travers le filtre. Total des matières solides en suspension, y compris les bactéries et la décomposition de la matière organique, plus grande que le filtre moyenne taille des pores de 0,45 µm sont pris au piège sur le filtre. Les particules plus petites y compris les virus et solides tels que de petites quantités de matière organique et sels dissous va passer à travers la membrane et dans la fiole à vide poubelle contenant l’eau de Javel.
8. La suite complète passage de l’échantillon à travers le filtre, rincez l’intérieur de l’entonnoir avec deux ou trois volumes de 20 à 30 mL d’eau stérile.
9. L’aspirateur hors tension et retirez l’entonnoir de la tubulure après la fermeture du rinçage final.
10. Avec une pince stérile éthanol-flamme, retirez immédiatement la membrane filtrante de l’appareil et le placer rapidement sur le milieu approprié d’agarose pour le microorganisme cible (le tableau 1 répertorie les conditions de médias et d’incubation de croissance recommandées pour chacun).
11. Appliquer le filtre de membrane à la surface d’agarose par un mouvement de type à rouleau pour assurer le contact complet de la membrane avec le milieu de croissance et pour éviter le piégeage de bulles d’air.
12. Remplacer l’entonnoir de filtration utilisé avec une unité stérile entre le traitement de chaque échantillon et éthanol-assainissez le collecteur en acier inoxydable afin de prévenir la contamination croisée.

2. colonie Enumeration

1. Après la période d’incubation, enlever les plaques de croissance de l’incubateur pour l’énumération.
2. Idéalement, effectuer les comptages de colonies sous grossissement de faible puissance à l’aide d’une source de lumière froide, blanche.
3. Coliformes totaux
   1. Des colonies de coliformes totales sont généralement roses à rouge foncé en couleur avec une surface métallique brillant. L’éclat lui-même peut partiellement ou complètement couvrir la colonie. Morphologies atypiques colonies de coliformes totales peuvent être rouge sombre, mucoïde ou nucléée sans reflet.
   2. Les colonies qui sont rose, bleu, blanc ou incolore tout en manquant de brillance sont considérés comme non-coliformes.
4. Les coliformes fécaux
   1. Les colonies de coliformes les apparaissent dans plusieurs nuances de bleu.
   2. Les colonies de coliformes fécales sont gris à la crème de couleur.
5. Entérocoques fécaux
   1. Gamme de colonies les entérocoques fécaux du rose au rouge foncé en couleur.

3. colonie vérification

1. Coliformes totaux
   1. Pour une vérification de la présence-absence, tamponner la membrane toute en utilisant une boucle inoculation stérile. Pour les colonies, il est préférable de vérifier au moins cinq chacun des morphologies typiques et atypiques.
   2. Transvaser la colonie sélectionnée dans un récipient en verre contenant du bouillon lauryl tryptose avec un tube de Durham. Incuber les tubes inoculés à 35±0.5 ° C pendant 48 h. La présence de croissance indicateur de turbidité parallèlement à la production de gaz vérifie la colonie comme un coliforme.
2. Les coliformes fécaux
   1. Transférer des colonies de couleur bleues aseptiquement dans les récipients en verre contenant stérile milieu EC avec un tube de Durham. Incuber les tubes inoculés à 44,5 ± 0,2 ° C pendant 24 h. La présence de croissance indicateur de turbidité parallèlement à la production de gaz vérifie la colonie comme un coliforme fécal.
3. Entérocoques fécaux
   1. Grève des colonies caractérisant la morphologie les entérocoques fécaux pour isolement aseptiquement sur cerveau-cœur Infusion Agar (BHIA) et incuber à 35 ± 0,5 ° C pendant 24 à 48 h.
   2. Transférer la croissance d’une colonie isolée sur BHIA sur deux lames de verre préalablement nettoyé.
   3. Ajouter deux à trois gouttes d’eau oxygénée à 3 % de frottis préparés sur les diapositives. L’apparition rapide de bulles indique un résultat de « catalase positive » et l’isolat n’est pas une bactérie streptocoque fécal.
   4. Effectuer une coloration de Gram pour les isolats essais comme « catalase négative » (pas de bulles observées). Les entérocoques fécaux sont Gram-positif, ovoïdes et apparaissent surtout en paires ou en courtes chaînes.

Le tableau 1. Milieux de culture culture couramment utilisés pour la détection des indicateurs bactériens les dans les échantillons environnementaux
¹ tel que recommandé par les Méthodes Standard pour l’examen de l’eau et des eaux usées (American Public Health Association et l’American Water Works Association, 22^ème édition, 2012)

Filtration sur membrane est utilisée dans la capture de virus et de la concentration de l’eau. Les virus pathogènes humains portent une charge nette négative dans les solutions aquatiques et sont souvent présents en faibles quantités dans les sources d’eau. Par conséquent, elles doivent être concentrées avant l’analyse. Filtration sur membrane est mais une capture méthode à cet effet et emploie un filtre charge négative. Les échantillons d’eau (par exemple 1 L) d’intérêt sont modifiés avec une solution saline (par exemple. chlorure de magnésium) pour donner une charge positive aux virus, ce qui facilite leur adsorption sur le filtre à membrane HA charge négative car l’eau est filtrée. Une solution d’acide faible concentration sert à rincer la membrane et débarrasser de sels excédentaires. Une faible concentration et volume d’hydroxyde de sodium est ensuite utilisée pour libérer les virus du filtre avant supplémentaire de concentrations et d’analyses (par exemple cellule culture infectiosité et dosages ou PCR quantitative).

Filtration sur membrane est également utilisée dans la production d’eau de grande pureté processus à usage industriel. Beaucoup d’industries ont besoin d’eau ultra-pure pour leurs processus opérationnels. Filtration sur membrane (p. ex. nano-filtration) sert à éliminer les métaux dissous et les sels de l’eau. Filtration sur membrane est également utilisée dans le dessalement de l’eau salée pour produire de l’eau potable.