Quantification des micro-organismes et des virus environnementaux à l'aide de la qPCR

Source : Laboratoires du Dr Ian poivre et Dr Charles Gerba - Université de l’Arizona
Auteur mettant en évidence : Bradley Schmitz

Réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR), également connu sous le nom de PCR en temps réel, est une technique moléculaire largement utilisé pour la numération des microorganismes dans l’environnement. Avant cette approche, quantification des microorganismes se limitait essentiellement à des techniques classiques de culture-basée. Cependant, la mise en culture de microbes d’échantillons environnementaux peut être particulièrement difficile, et il est généralement jugé qu’aussi peu que 1 à 10 % des micro-organismes présents dans les échantillons environnementaux sont détectables à l’aide de ces techniques. L’avènement de qPCR en recherche en microbiologie environnementale a avancé donc considérablement le domaine en tenant compte de la détermination plus précise des concentrations de microorganismes pathogènes tels que les agents pathogènes dans les échantillons environnementaux. Toutefois, une limitation importante de qPCR comme une technique microbiologique appliquée est que les populations vivantes et viables ne peuvent être distinguées des populations inactives ou non vivant.

Cette vidéo illustre l’utilisation de qPCR pour détecter les virus doux de marbrure du poivre d’un échantillon d’eau de l’environnement.

Les principes de base derrière qPCR est le même que PCR régulière – répété des cycles d’apprêt recuit au modèle, allongement du produit PCR et la dénaturation du produit de modèle, conduisant à l’exponentielle amplification d’une séquence cible des intérêts, connu comme le « amplicon », auprès d’un pool de matière première. L’innovation de qPCR est dans l’ajout de produits chimiques fluorescents dans la réaction, ce qui permet la synthèse du produit PCR à chaque cycle à visualiser directement en « temps réel » par thermocycleurs spécialisés, permettant de quantifier la quantité de séquence de modèle dans l’échantillon original. La quantité est habituellement mesurée en ce qui concerne le cycle seuil (C_t, également connu sous le nom cycle de quantification ou C_q), qui correspond au cycle PCR à partir duquel la quantité de produits fluorescents dépasse le niveau de fond.

Quantification peut être relative, où la valeur de_t C d’une seule séquence est comparée à celle d’une autre séquence standard ou contrôle. Sinon, si une série d’ADN de quantité connue est longent les échantillons dans la réaction, une « courbe d’étalonnage » en comparant la valeur de fluorescence à la quantité d’ADN peut être produite et permet à l’ADN de l’échantillon être dosée absolument.

Dans une méthode de qPCR, une petite portion d’ADN, connu comme une sonde, est conçue contre une séquence cible spécifique d’intérêt. La sonde est liée chimiquement à un colorant fluorescent, mais aussi une molécule « extincteur » qui supprime le signal de fluorescence de la teinture quand à proximité. L’enzyme polymérase, qui synthétise le produit de l’ADN, a une activité capables de dégrader l’ADN qui causerait la molécule fluorescente d’être libéré de la sonde, donc qui la sépare de la teinture de l’extincteur et permettant de détecter le signal de fluorescence. Les niveaux de fluorophore sont mesurés quantitativement après chaque PCR cycle, avec force de signal croissant corrélant aux niveaux supérieurs de séquences cibles amplifié (appelés « amplicons ») présents dans l’échantillon environnemental.

1. le prélèvement

1. Recueillir le sol à l’aide d’une tarière ou pelle à une profondeur déterminée. Si collecte du sol de la rhizosphère, ne recueillons sol intérieur 7 mm autour des racines de la plante, en frappant des excès de saleté hors de la racine et grattage sol souhaité dans un tonneau de collection.
2. Placez une bouteille Nalgene stérile en trempant le bâtonnet. Tenez l’extrémité du bâton et de recueillir l’eau en immergeant la bouteille. Placer la bouteille dans une glacière avec de la glace.
3. Transfert des échantillons au laboratoire.

2. Extraction des acides nucléiques

1. D’isoler des micro-organismes dans les échantillons recueillis et pour en extraire l’ADN et/ou de l’ARN, s’il vous plaît voir la vidéo de l’enseignement des sciences JoVE sur l’extraction des acides nucléiques communautaire.

3. Transcription inverse

1. Si le matériel génétique étant dosé est RNA, il doit servir à générer l’ADN complémentaire (ADNc) par transcription inverse avant de procéder à la PCR. Pour plus de détails, veuillez consulter JoVE Science Education vidéo sur RT-PCR.

4. mise en place de qPCR

1. Récupérer les réactifs stockés à-20 ° C et les décongeler sur glace ou à température ambiante à l’intérieur d’une hotte propre. Réactifs utilisés dans cet exemple comprennent le mélange réactionnel de qPCR (dépendant de la machine de qPCR utilisé ; contient l’ADN polymérase), amorces et inverses et la sonde TaqMan. Les séquences d’amorce et de sonde sont conçus avec des séquences spécifiques de l’organisme qui est énuméré. Reportez-vous à la documentation actuelle de trouver des séquences d’intérêt. Dans cet exemple, le système de réactif de Roche Light Cycler 480 sondes Mix servira. Virus doux de marbrure du poivre sont énumérées dans l’échantillon d’eau. ^{1, 2} Voir le tableau 1 pour apprêt et sonder les séquences.
2. Dégel extraite (c) l’ADN des échantillons et le contrôle positif ADN (qui se compose de séquences spécifiques d’un organisme clonés dans les plasmides bactériens) à température ambiante.
3. Préparer un modèle de tableau de 96 cellules qui ressemble à la plaque 96 puits qPCR. Étiquetez chaque cellule avec la réaction qui sera chargée sur la plaque. Comprendre les réactions pour chaque échantillon et de la norme en trois exemplaires, ainsi que pour le contrôle positif et un témoin négatif, comme par exemple une réaction non-ADN.
4. Calculer les volumes de réactifs nécessaires à une réaction « master mix », qui comprend tous les réactifs qui sont constants parmi les réactions, basées sur les instructions du fabricant et de la littérature. Préparer suffisamment mélange principal pour les réactions en triple pour tous les échantillons plus de contrôles et une majoration de 10 % pour tenir compte de l’erreur de pipettage. Pour un maître échantillon mélanger recette, reportez-vous au tableau 2.
5. Travaillant à l’intérieur d’une hotte propre, une fois que tous les réactifs sont complètement décongelés, ajouter le montant de chaque réactif dans un tube de microtubes de 1,5 mL basse-liaison pour créer le mélange principal. Vortex et brièvement minicentrifuge chaque réactif avant d’ajouter. Changer de pipette entre chaque réactif pour prévenir la contamination et assurer des concentrations correctes. Après que tous les réactifs ont été ajoutés, vortex et minicentrifuge tube avec master mix afin d’assurer l’homogénéité.
6. Aliquoter le volume approprié de mélange principal dans chacun désigné bien dans la plaque PCR 96 puits.
7. Ajouter le volume approprié d’échantillon d’ADN (c), plasmide contrôle positif et le contrôle négatif (eau de qualité moléculaire) dans les puits désignés.
8. Une fois que tous les échantillons et les contrôles ont été ajoutés, flasque avec feuille d’étanchéité. Utiliser un outil de scellement pour pousser l’air sortir de sous la feuille métallique et éviter les bulles. Déchirez les bords du papier avec soin.
9. Centrifuger la plaque 96 puits scellée dans une centrifugeuse avec un porte-plaque pour rassembler le mélange au fond de chaque puits. Veillez à utiliser une plaque de contrepoids pour faire en sorte que la centrifugeuse sera correctement équilibrée tout en tournant. Impulsion centrifuger jusqu'à 1000 tr/min, puis laissez la centrifugeuse arrêter lentement sans freins.

5. qPCR opération

1. Introduisez plaque à 96 puits scellé dans machine de qPCR. S’assurer que la machine indique il est prêt à démarrer.
2. Suivez les instructions de machine de qPCR pour entrer correctement toutes les informations nécessaires par le logiciel, puis définissez qPCR machine à courir.
3. Après que la machine complète exécution, le logiciel sera en mesure d’utiliser les concentrations connues du contrôle positif pour calculer la quantité de l’ADNc dans chaque réaction. La quantité de virus dans l’échantillon original peut alors être calculée, basé sur la dilution, filtration, concentration, amplification et/ou les procédés d’extraction effectuées pour obtenir l’échantillon d’ADN.

Réactif	Séquence (5' → 3')	Volume (μL / bien)	Finale conc.
Primer avant	GAGTGGTTTGACCTTAACGTTTGA	2.25	900 nM
Inverser l’apprêt	TTGTCGGTTGCAATGCAAGT	2.25	900 nM
Sonde	FAM-CCTACCGAAGCAAATG-BHQ1	1.0	200 nM

Le tableau 1. Séquences d’amorce et de sonde échantillon pour détecter les virus doux de marbrure de poivre.

Réactif	Volume (μL / bien)	Nombre de puits	Master Mix Volume (μL)
Mélanger LC 480	12,5	26	325
Moléculaire H2O	4.5		117
Primer avant	2.25		58,5
Inverser l’apprêt	2.25		58,5
Sonde	1.0		26
Total	22,5		585

Le tableau 2. Volumes de réactifs pour la réaction individuelle et mélange principal.

La capacité de quantifier la cible segment génomique exemplaires en utilisant la technique de qPCR sont important dans un certain nombre de domaines scientifiques. Exemples d’applications incluent :

(1) énumérant les agents pathogènes dans l’eau, sol, aliments, surfaces, etc..

PCR en temps réel est utilisé pour énumérer les agents pathogènes dans des environnements variés. Lors d’épidémies, des échantillons de l’eau et le sol peuvent être analysés pour l’agent pathogène de l’intérêt de trouver la source de la propagation. Ensuite, la source peut être davantage analysée pour énumérer la concentration de l’agent pathogène et de déterminer le degré de saleté. Par exemple, pendant une épidémie de norovirus sur un bateau de croisière qui a causé la gastro-entérite sévère, des vomissements et diarrhée pour les passagers, échantillons d’eau et de nourriture peuvent être soumis à la PCR en temps réel pour identifier la source du virus, par exemple, l’eau n’était pas correctement traitée et contenu haute contamination fécale.

(2) mesure la réduction des microbes pathogènes de traitement des eaux usées

Eaux usées brutes contient une abondance de pathogène micro-organismes et, par conséquent, doivent être traitées afin de protéger la santé publique. Échantillons d’eau peuvent être prélevés à différents points le long d’un train de traitement des eaux usées et analysées à l’aide de qPCR pour déterminer la réduction des niveaux de micro-organismes pathogènes, y compris les virus. Les réductions calculées ensuite fournissent des informations précieuses quant à l’efficacité des procédés de traitement des eaux usées et les applications potentielles de réutilisation de l’eau.

(3) la mesure des marqueurs de gène fonctionnel dans l’environnement

Des communautés microbiennes sont soumis à des modifications de la composition et les fluctuations dans l’activité en raison de pressions sur l’environnement. Ces changements peuvent être surveillés par l’intermédiaire de l’analyse des gènes fonctionnels peuvent être activés par des agresseurs environnementaux particuliers. PCR en temps réel peut être utilisé pour quantifier l’expression de ces gènes dans des échantillons de surveiller les changements dans l’activité de la communauté microbienne. Par exemple, qPCR permet aux écologistes microbiennes quantifier l’expression des gènes activés pour voies de biodégradation en présence de contaminants d’origine humaine présents dans les sols.