Planimétrie numérique pour l’évaluation de la cinétique de fermeture des plaies dans un modèle murin

Les plaies représentent un défi de santé mondial. Cette étude a mis au point un photomaton standardisé utilisant la planimétrie numérique pour minimiser la variabilité des mesures des plaies. Le suivi des plaies chez la souris pendant 14 jours a révélé une augmentation initiale de la surface et du périmètre de la plaie, suivie d’une fermeture progressive. Cette méthodologie peut aider à évaluer la cinétique de fermeture des plaies dans des modèles précliniques.

Les plaies chroniques, en raison de leur prévalence élevée, constituent un grave problème de santé mondial. Des stratégies thérapeutiques efficaces peuvent accélérer considérablement la guérison, réduisant ainsi le risque de complications et allégeant le fardeau économique des systèmes de santé. Bien que de nombreuses études expérimentales aient porté sur la cicatrisation des plaies, la plupart reposent sur des observations qualitatives ou des mesures directes quantitatives. L’objectif de cette étude était de standardiser une méthode de mesure indirecte des plaies à l’aide de la planimétrie numérique, intégrant la mise à l’échelle et la segmentation numériques. Cette approche remédie au manque de méthodologies détaillées, étape par étape, pour une évaluation précise des plaies. Une cabine de photodocumentation a été conçue et construite, et des outils de planimétrie numérique assistés par ordinateur ont été utilisés pour minimiser la variabilité des mesures de la zone de la plaie, du périmètre et de la distance entre le centre de la plaie et ses bords. Une plaie traumatique circulaire (5 mm de diamètre) a été créée sur la ligne médiane dorsale au niveau de l’omoplate de souris CD1 mâles (n = 4, âgées de 10 semaines, 30-35 g). L’évolution de la plaie a été photodocumentée pendant 14 jours à l’aide du photomaton conçu sur mesure, qui contrôlait les conditions d’éclairage, la distance focale et le positionnement du sujet. Les mesures de détartrage et de plaie ont été effectuées à l’aide de la segmentation dans le logiciel ImageJ, et l’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. La cinétique de fermeture de la plaie a montré une légère augmentation de la taille et du périmètre de la plaie entre le jour 0 et le jour 2, suivie d’une diminution progressive jusqu’à la fermeture complète au jour 14. La cabine de photodocumentation et la planimétrie numérique assistée par ordinateur ont permis des mesures quantitatives avec une variabilité minimale. En conclusion, ces outils fournissent une méthode fiable et reproductible pour évaluer la cinétique de fermeture des plaies dans des modèles précliniques.

La cicatrisation traumatique des plaies prend environ 21 jours et comporte une séquence bien définie de quatre phases distinctes : (1) hémostase, (2) inflammation, (3) prolifération et (4) remodelage¹. Si une phase de cicatrisation des plaies est prolongée, elle peut entraîner le développement de plaies chroniques¹. En raison de leur prévalence élevée, de leurs complications potentielles² et de leur fardeau économique important, ils sont considérés comme un problème de santé mondial.

Les études précliniques visent à accélérer la cicatrisation en favorisant la réépithélialisation complète des plaies ^3,4,5, en prévenant les complications et en réduisant les coûts de traitement. Ces études évaluent diverses stratégies, y compris le développement de biomatériaux, d’interventions pharmacologiques et d’autres procédures de médecine régénérative 6,7,8,9.

De multiples modèles expérimentaux ont été développés pour l’étude des plaies traumatiques. Certains se concentrent sur des caractéristiques qualitatives macroscopiquement visibles telles que la taille, les indicateurs d’inflammation, la présence de tissu de granulation, les sécrétions et la formation de croûtes⁵. D’autres analysent des données quantitatives, notamment la surface, le périmètre, le rayon, le diamètre, la couleur, la profondeur et les distances entre le centre et les bords des plaies.

À cet égard, la plupart des investigations in vivo mesurent directement le rayon et la profondeur de la plaie. Cependant, la délimitation manuelle des bords de la plaie dans une image macroscopique peut introduire des biais dans la mesure¹⁰. D’autres études utilisent la planimétrie mécanique, à l’aide de feuilles de plastique transparentes quadrillées, où les bords de la plaie sont préalablement délimités ; Dans les deux cas, l’obtention de l’aire ou du périmètre nécessite des instruments manuels tels que des règles ou des planimètres numériques. De nos jours, la planimétrie numérique assistée par ordinateur permet l’analyse informatisée d’images macroscopiques de plaies ou de feuilles de plastique. La manipulation in situ et la qualité de l’image macroscopique sont une limitation, cependant, cet outil 11,12,13,14 réduit considérablement la variabilité entre les mesures de surface et de périmètre.

Cette méthodologie proposée offre des avantages significatifs par rapport aux techniques existantes d’évaluation de la fermeture de la plaie chez la souris 15,16,17,18,19,20. Bien que la documentation photographique ait été considérée comme un outil précis et cohérent pour évaluer la cinétique de fermeture des plaies, des études antérieures^21,22 ont mis en évidence les limites de la mesure manuelle des plaies, telles que le biais de l’observateur et la variabilité dues à un éclairage et à un positionnement incohérents de la caméra. L’approche actuelle répond à ces problèmes en standardisant les conditions d’imagerie à l’aide d’une cabine construite sur mesure, améliorant ainsi la reproductibilité et la précision. De plus, la planimétrie numérique informatisée permet des évaluations quantitatives plus précises, améliorant l’évaluation des interventions thérapeutiques et minimisant les erreurs de mesure, comme en témoignent d’autres études comparant les techniques manuelles et numériques^12,22, ce qui la rend particulièrement adaptée aux études de la cinétique de fermeture des plaies dans des modèles murins, permettant une évaluation précise des traitements en maintenant un contrôle strict des conditions d’acquisition d’images.

Toutes les procédures expérimentales impliquant des souris de laboratoire ont été menées conformément aux normes et règlements éthiques établis dans la norme officielle mexicaine (NOM-062-ZOO-1999) pour la manipulation et les soins des animaux de laboratoire. Le protocole a été examiné et approuvé par le Comité interne pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (CICUAL) de l’Institut national de recherche nucléaire (ININ) sous la référence CICUAL-01-23. Des souris CD1 mâles (n = 4), âgées de 10 semaines, avec un poids corporel variant de 28 à 32 g, ont été utilisées dans cette étude. Tous les animaux ont été sélectionnés pour assurer l’uniformité de la souche, de l’âge, du sexe et du poids corporel, minimisant ainsi la variabilité des résultats expérimentaux. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Construction d’un photomaton pour l’acquisition d’images macroscopiques

REMARQUE : Le logiciel SolidWorks sous licence (version 2015) a été utilisé pour concevoir un photomaton afin d’éliminer les sources d’éclairage externes. Un cube de 40 cm × 40 cm a été construit à l’aide d’un profilé en aluminium blanc d’un pouce d’épaisseur. Le cube se composait de trois sections, assemblées séquentiellement : le toit, les parois latérales et le sol (Figure 1A).

1. Construction de toiture
   REMARQUE : Le toit a été régionalisé en fonction du bord avant (A), du bord arrière (B) et des bords latéraux (C et D) pour s’orienter (figure 1B).
   1. Fixez sur la zone intérieure du bord latéral du toit (C et D) un profilé en aluminium fendu (conçu pour retenir le verre) de 1,5 cm de large, 2,51 cm d’épaisseur et 34,9 cm de long (Figure 1B).
   2. Placez deux plaques d’aluminium rectangulaires de 34,5 cm de long x 13 cm de large avec du polyéthylène au centre dans la rainure de chaque profil de toit (plaques 1 et 2 de la figure 1C) pour permettre le glissement à travers la rainure des deux profilés.
   3. Installez un tube LED RVB de 20 cm avec une plage de température de couleur de 2500 à 9000 K (Figure 1C) à un angle de 45° sur le bord inférieur du panneau 1 à l’aide de ruban adhésif double face.
   4. Montez sur les panneaux de toit 1 et 2 un panneau rectangulaire en mousse de 32 cm x 12 cm avec une découpe circulaire centrale de 7,82 cm de diamètre pour permettre l’installation de l’objectif de la caméra (Figure 1C).
2. Construction du sol
   1. Placez un morceau carré de 40 cm x 40 cm de panneau de mousse blanche sur les profilés de la surface de sol. Découpez des carrés d’une longueur de côté de 2,54 cm à chaque coin du panneau de mousse (Figure 1E).
3. Construction des parois latérales
   1. Découpez quatre panneaux de mousse quadrangulaires de 40 cm x 40 cm.
   2. Collez deux panneaux avec du silicone sur les côtés C et D pour former les parois latérales gauche et droite (Figure 1F).
   3. Fixez des bandes de fixation auto-agrippantes aux profilés en aluminium A et B pour faciliter la manipulation des éléments internes du photomaton. De plus, fixez à 1 cm du bord d’une ligne d’attaches adhésives deux carrés de carton mousse sur un côté et placez-les sur les parois avant et arrière (Figure 1F).
4. Construction de la base de référence
   REMARQUE : Une base de référence était nécessaire pour maintenir la souris en position couchée pendant l’anesthésie et tout au long de la documentation de l’évolution de la plaie. Les composants 3D ont été conçus et fabriqués à l’aide de la technique de modélisation par dépôt de fil en fusion (FDM) avec un matériau PLA et une imprimante 3D^23,24.
   1. Imprimez en 3D le masque avec une base de 2 cm de largeur, de longueur et de hauteur et placez-le à 11,5 cm du bord d’un rectangle prédécoupé en carton mousse blanc de 40 cm x 28 cm pour maintenir les souris sous anesthésie par inhalation (Figure 1D, couleur rouge).
   2. Imprimez en 3D la plate-forme rectangulaire (9 cm de long, 5 cm de large, 2,5 cm de haut) avec quatre zones extrudées pour aligner le dos de la souris lors de l’acquisition de l’image. Ces zones soutenaient la tête, les membres et la région abdominale pour maintenir la position couchée. Collez cette plate-forme au centre de la base de référence (Figure 1D, couleur verte).
   3. Imprimez en 3D le bloc de règle (2 cm de large, 8 cm de long, 2,5 cm de haut) et fixez-le à 1 cm du côté gauche de la base de la souris pour y placer l’élément de référence de mesure nécessaire au traitement numérique de l’image (Figure 1D, couleur bleue).
   4. Fixez une règle graduée en acier inoxydable de 15 cm au bloc de règle et installez l’intégralité de la base de référence à l’intérieur de la cabine pour la mise à l’échelle de l’image (Figure 1D).

Figure 1 : Schéma de construction de l’armoire d’acquisition d’images macroscopiques. (A) Sections de la cabine (toit, parois latérales, sol). (B)Orientation des profilés formant le toit ; avant (A), arrière (B) et côtés (face intérieure des profilés en rouge « C,D »). (C) Panneaux de toit 1 et 2, installation du tube lumineux LED, de la plaque d’objectif de la caméra et installation au sol. (D) Installation du masque d’anesthésie (ROUGE), de la plate-forme de la souris (VERT) et de la plate-forme rectangulaire pour le positionnement de la règle de mesure (BLEU) sur la base de référence. (E) Emplacement final de la base de référence. (F) Installation des parois latérales, avant et arrière. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Entretien des animaux

1. Obtenir l’autorisation du comité de bioéthique de l’établissement pour les expérimentations animales. Utiliser des souris CD1 (n = 4), âgées de 10 semaines, pesant de 28 à 32 g.
2. Hébergez les souris dans des conditions standard : maintenez une température de 21 °C, des cycles lumière/obscurité de 12/12 h, 45 % d’humidité, et fournissez un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, sauf pendant les séances de photodocumentation.

3. Génération de plaies traumatiques

1. Faites jeûner les souris pendant 8 h avant la procédure. Anesthésier les souris avec du pentobarbital sodique intrapéritonéal à 65 mg/kg²⁵ (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
   1. Confirmez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant l’absence de réflexe de retrait lors d’un pincement interdigital. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant l’anesthésie. Maintenez les souris à une température stable de 37 °C pendant la chirurgie et la récupération (20 min).
2. Placez la souris en position de décubitus ventral et épilez une zone de 2,5 cm x 3 cm de la région cervicale par voie caudale à l’aide de lames chirurgicales. Étirez la peau pour éviter les lacérations. Effectuez l’asepsie et l’antisepsie en alternant des rinçages à la povidone iodée et à l’eau stérile.
3. Utilisez un poinçon de biopsie stérile de 5 mm et appliquez une pression avec des mouvements circulaires pour créer une incision dermo-épidermique au niveau de l’omoplate. Retirez le rabat à l’aide d’une pince dentelée et coupez-le à l’aide de ciseaux à pointe d’iris (Figure 2A).
4. En cas de présence de points de saignement dans la plaie, appliquez un choc électrique avec un appareil d’électrocautérisation pour obtenir l’hémostase.
5. Placez un film dermique circulaire de 1 cm de diamètre sur la plaie à l’aide d’une pince Jeweler pour éviter la contamination et la contraction.
6. Effectuer toutes les chirurgies de survie dans des conditions stériles. Préparez le site chirurgical avec des désinfectants comme la povidone iodée. Portez des gants stériles et un masque, et maintenez la stérilité tout au long de l’intervention en utilisant des instruments stériles et en minimisant le contact avec les surfaces non stériles.
   1. Après l’opération, placez les souris dans des cages individuelles à 24 °C et surveillez-les jusqu’à ce qu’elles retrouvent une conscience suffisante pour maintenir la position sternale. Assurez-vous que la température corporelle est contrôlée pendant et après la chirurgie pour prévenir l’hypothermie en utilisant des sources de chaleur externes.
7. Administrer l’analgésie jusqu’au jour 4 en diluant le kétorolac dans l’eau de boisson à 5 mg/kg²⁶.
8. Après 14 jours, lorsque les plaies chez les rongeurs sains atteignent généralement des stades avancés de cicatrisation, euthanasiez les souris par remplacement de l’O2 dans une chambre de CO₂ conformément aux normes internationales. Cela marque le point final de l’étude.

4. Acquisition d’images macroscopiques

1. Capturez des images des plaies quotidiennement pendant 14 jours consécutifs pour surveiller la cinétique continue de la fermeture de la plaie. Utiliser un appareil photo semi-professionnel ou professionnel ; Positionnez l’objectif à travers l’ouverture circulaire dans le toit du photomaton.
   REMARQUE : Ajustez le calendrier si nécessaire en fonction des conditions expérimentales.
2. Utilisez un tube lumineux LED RVB en mode CCT (Correlated Colour Temperature), réglé sur 9000 K et une luminosité de 100 % pour l’éclairage.
3. Positionnez la base de référence au centre du sol du photomaton.
4. Placez la souris dans la chambre d’anesthésie inhalée pendant 3 min (Figure 2B).
5. Après avoir induit l’anesthésie, placez la souris en position couchée sur la plate-forme de la souris. Fixez le museau à l’intérieur du masque d’anesthésie au sévoflurane et délivrez 5 % de sévoflurane à un débit d’oxygène de 1,5 L/min (figure 2C).
6. Avant de capturer des images, retirez le film dermique de la plaie à l’aide d’une pince Jeweller et alignez la base de référence avec l’objectif de l’appareil photo.
7. Installez la paroi avant du photomaton et capturez des images macroscopiques avec les paramètres suivants : ouverture f/3.2, temps d’exposition 1/200s, sensibilité ISO 80, distance focale 4mm.
8. À l’aide d’une pince Jeweller, placez un film dermique de 1 cm de diamètre sur la plaie avant de retirer le masque d’anesthésie. Transférez les souris dans des cages individuelles et observez jusqu’à la récupération motrice.

5. Traitement d’image

1. Générez une copie de sauvegarde des images macroscopiques. Traitez les images à l’aide du logiciel ImageJ.
2. Ouvrez l’image de sauvegarde dans ImageJ en suivant le chemin d’accès : Fichier > Ouvrir > Rechercher dans les images, puis cliquez sur Ouvrir.
3. Mettez l’image à l’échelle par référence : Agrandissez l’image, sélectionnez l’outil Ligne droite , zoomez sur la règle à côté de la souris à l’aide de la touche +, tracez une ligne droite de 10 mm sur l’image de la règle, puis allez dans Analyser > Définir l’échelle > Entrez « 10 » pour la distance connue > Définir l’unité de longueur en mm, puis cliquez sur Ok. Cela détermine le rapport pixels/distance de l’image macroscopique (Figure 2D).
4. Séparez la zone de la plaie de l’image : utilisez l’outil rectangle pour sélectionner la zone autour de la plaie (w = 150, h = 150). Enregistrez les valeurs X et Y, faites un clic droit sur le rectangle > Dupliquez > Nommez le sujet > Appuyez sur Entrée. Dans la nouvelle image, appuyez deux fois sur + pour effectuer un zoom avant (Figure 2E).
5. Enregistrez l’image recadrée en suivant le chemin d’accès : Fichier > Enregistrer sous > Tiff > Entrez le nom > Enregistrer.
6. Créez un duplicata de l’image recadrée pour éviter toute modification lors de la segmentation : Faites un clic droit sur l’image recadrée > Dupliquez > Nommez-la en ajoutant « Segmentation » à la fin. Ensuite, appuyez sur Entrée. Dans la nouvelle image, appuyez deux fois sur + pour effectuer un zoom avant.
7. Séparez l’image en couches de couleur en suivant le chemin suivant : Image > Type > Pile RVB. Dans l’image du canal rouge (1/3 rouge), faites un clic droit sur Dupliquer, puis appuyez sur OK dans la fenêtre Dupliquer.
8. Segmentez l’image du canal rouge. Cliquez sur l’image du canal rouge, Image > Ajuster > seuil. Ensuite, sélectionnez Par défaut > Appliquer (Figure 2F).
9. Rectifiez la région d’intérêt (ROI) pour assurer une couverture complète de la plaie et éviter les distorsions de segmentation.
   REMARQUE : Si les zones autour de la plaie ne sont pas incluses dans la segmentation, passez à la section Traiter > Binaire > Remplir les trous. Pour supprimer les points noirs à l’extérieur de la plaie, allez dans Traiter > Binary > Erode. Si la commande Erode réduit la taille de la plaie, corrigez-la à l’aide de Traiter > Binaire > Dilater.
10. Marquez le périmètre du retour sur investissement : Modifier > sélection > Créer une sélection. Le retour sur investissement sera décrit en jaune. Ajoutez-le au gestionnaire de retour sur investissement en suivant les > Modifier > Sélection (Edit Add to Manager (Figure 2G).
11. Validez la segmentation : Ouvrez la fenêtre Gestionnaire de ROI et sélectionnez le ROI à examiner : Plus > Traduire. Entrez les valeurs X et Y enregistrées à l’étape 4, puis appuyez sur OK.
    1. Maximisez l’image d’origine, puis sélectionnez le retour sur investissement dans le gestionnaire de retour sur investissement. Ajustez le retour d’intérêt à l’aide des touches fléchées jusqu’à ce qu’il s’aligne avec l’enroulement (Figure 2H). Si le ROI est à la hauteur de la plaie, la segmentation a été réussie. Sinon, répétez l’opération à partir de l’étape 2.
12. Une fois la segmentation confirmée, obtenez les mesures de la plaie : Analyser > Mesurer. Un tableau de résultats affichera les valeurs de surface, de périmètre et de position X/Y. Copiez ces valeurs dans le logiciel SPSS à des fins de documentation et d’analyse statistique (Figure 2I).

Figure 2 : Déroulement de la mesure de la plaie à l’aide de techniques de planimétrie numérique et de segmentation. (A) Incision dermo-épidermique à l’aide d’un poinçon de biopsie stérile de 5 mm. (B) Placer la souris dans une chambre d’anesthésie inhalée pendant 3 min. (C) Documentation photographique en positionnant la souris anesthésiée dans le photomaton et en fixant son museau dans un masque au sévoflurane. (D) Ouvrir l’image obtenue dans ImageJ et la mettre à l’échelle en utilisant la règle comme référence. (E) Extraire la zone de la plaie à l’aide de l’outil rectangle. (F) Séparation de l’image en canaux RVB et traitement du canal rouge. (G) Définir et gérer la région d’intérêt (ROI). (H) Valider la segmentation en faisant correspondre le retour sur investissement avec la plaie. (I) Mesurer les paramètres de la plaie et enregistrer les résultats pour l’analyse statistique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Euthanasie post-opératoire

REMARQUE : L’étude se termine après 14 jours, moment auquel les plaies chez les rongeurs sains atteignent généralement des stades avancés de guérison. À ce stade, les souris ont été euthanasiées sans cruauté selon la procédure d’euthanasie établie et approuvée par l’établissement.

1. Préparez l’équipement. Assurez-vous que la chambre d’euthanasie est propre, sèche et de taille appropriée pour accueillir les souris sans surpeuplement. Connectez la chambre à une alimentation en CO₂ de qualité médicale à l’aide d’un régulateur de débit.
2. Transférez doucement les souris dans la chambre pour minimiser le stress. Assurez-vous qu’ils sont dans un environnement calme avec un minimum de perturbations externes.
3. Réglez le débit de CO₂ à 20 % à 30 % du volume de la chambre par minute, comme recommandé par les directives de l’AVMA pour l’euthanasie des animaux. Augmentez progressivement la concentration de CO₂ pour éviter d’induire une détresse ou une gêne chez les souris.
4. Observez attentivement les souris pendant la procédure. Recherchez des signes de perte de conscience progressive, y compris une activité et une respiration réduites, suivies d’une apnée et d’un arrêt cardiaque.
5. Confirmez la mort une fois que les souris ne respirent plus et ne montrent aucun signe de mouvement ; Attendez 1 à 2 minutes supplémentaires pour assurer un arrêt complet des fonctions vitales. Vérifier la mort en confirmant l’absence de réflexes (p. ex., réflexe cornéen) et d’activité cardiaque.
6. Transférer les carcasses dans des conteneurs de déchets biologiques dangereux désignés. Suivre les protocoles institutionnels et les directives nationales pour l’élimination sécuritaire des restes d’animaux.
7. Consigner le nombre d’animaux euthanasiés, la date et toute observation pertinente afin de s’assurer du respect des normes éthiques et institutionnelles.

Après mise à l’échelle des images dans le logiciel ImageJ, le périmètre moyen (tableau 1) et la surface (tableau 2) des plaies, ainsi que leurs écarts-types respectifs, ont été obtenus par segmentation numérique. Ces valeurs ont été enregistrées du jour zéro au quatorzième jour (J0-J14).

Tableau 1 : Mesures du périmètre des plaies (jours 0 à 14). Les valeurs représentent les mesures du périmètre de la plaie (mm) chaque jour (D_0-14) en moyenne ± écart-type (ET).

Tableau 2 : Mesures de l’aire des plaies (jours 0 à 14). Les valeurs indiquent les mesures quotidiennes de la surface de la plaie (mm²) (J_0-14) sous forme de moyenne ± d’écart-type (ET).

La zone et le périmètre de la plaie ont d’abord augmenté du jour 0 au jour 3, indiquant une réponse inflammatoire qui a temporairement élargi la taille de la plaie au-delà de ses mesures initiales. Cependant, du jour 3 au jour 6, la surface et le périmètre ont diminué progressivement, avec une réduction significative observée au jour 7. À ce stade, les plaies mesuraient moins que leur taille d’origine, reflétant une cicatrisation avancée.

Afin de sonder la cinétique de fermeture de la plaie, des données surfaciques ont été utilisées pour calculer le pourcentage de cicatrisation de la plaie avec l’équation^27,28 de Robson (équation 1) :

où %Δ A correspond au pourcentage de réduction de la surface de la plaie le jour de l’évaluation (aire _{Jour x}) par rapport à la surface initiale au jour zéro (aire_Jour0).

Tableau 3 : Pourcentage de fermeture de la plaie (équation de Robson). Les valeurs représentent les pourcentages moyens de réduction de la surface de la plaie, calculés par l’équation de Robson (équation 1) comme moyenne ± écart-type (ET).

Lorsque les pourcentages obtenus à partir de cette équation sont positifs (tableau 3), ils indiquent la fermeture de la plaie, tandis que les valeurs négatives indiquent une augmentation de la taille de la plaie (figure 3A). Pour calculer la distance de rétraction entre les bords de la plaie et le centre, les données de surface et de périmètre ont été utilisées avec l’équation de Gilmam 29,30,31 (équation 2) :

où, D est la distance d’avancement linéaire moyenne en mm à partir des marges vers le centre de la plaie, A₀ est la surface de la plaie au début du traitement (jour₀), A_i est la surface de la plaie au moment de la mesure, P₀ est le périmètre de la plaie au début (jour₀), P_i le périmètre au moment de la mesure.

Tableau 4 : Rétraction des bords de la plaie (équation de Gilmam). Les valeurs montrent chronologiquement la rétraction moyenne (mm) du bord vers le centre de la plaie, présentée sous forme de moyenne ± d’écart-type (ET).

En correspondant aux pourcentages de fermeture de la plaie, les valeurs positives de l’équation 2 montrent que les bords de la plaie se rapprochent, ce qui indique une contraction (tableau 4). À l’inverse, les valeurs négatives reflètent une augmentation de cette distance (Figure 3B). Initialement, le jour 0, le diamètre de la plaie mesurait 5 mm, ce qui donnait 2,5 mm ± 0,0425 mm du bord vers le centre. Cette distance initiale a servi de référence pour calculer le taux quotidien moyen de rétraction de la plaie. Le taux de rétraction calculé a ensuite été soustrait de la distance initiale pour générer le taux de fermeture de la plaie synthétique présenté dans le tableau 5.

Tableau 5 : Taux de fermeture de la plaie (mm). Les valeurs montrent la rétraction de la plaie au fil du temps. Ceci est obtenu en soustrayant la distance du bord de l’enroulement à chaque point temporel de la distance initiale (2,5 mm ± 0,0425) en tant que moyenne ± écart-type (ET).

Le pourcentage de fermeture a été calculé à l’aide de l’équation³² de Robson (figure 3A), couramment utilisée dans les mesures séquentielles de la fermeture de l’ulcère de la neuropathie diabétique, et l’équation³³ de Gillman (figure 3B) est couramment utilisée pour surveiller la progression de la cicatrisation des plaies.

Le jour 0, la plaie chirurgicale initiale (5 mm de diamètre, soit 100 %) a montré une augmentation significative à 138,04 % au jour 2, probablement en raison du processus inflammatoire initial autour de la plaie ^4,34. Au cours de cette période, les neutrophiles et les macrophages migrent, libérant des cytokines et des facteurs^{de croissance 28}. La phase inflammatoire dure généralement de un à trois jours³⁵. Pourtant, il peut s’étendre sur plusieurs semaines en cas de blessures étendues, d’infections supplémentaires, de conditions préexistantes ou chez les personnes âgées où les mécanismes de réparation sont retardés.

Ces résultats mettent en évidence l’efficacité de cette méthodologie, qui combine l’utilisation du photomaton, de la segmentation numérique et de la planimétrie numérique pour capturer avec précision les changements dynamiques de la cinétique de fermeture des plaies. Dans ce modèle, l’inflammation a probablement provoqué une rétraction du bord de la plaie, entraînant une augmentation initiale de la surface et du périmètre de la plaie. De plus, nous avons identifié que les conditions d’éclairage optimales pour l’imagerie macroscopique ont été obtenues à l’aide d’un tube lumineux LED RVB en mode CCT à 9000 K et à une intensité de 100 %, avec une distance idéale de la caméra réglée à 18 cm de la souris.

Figure 3 : Cinétique de cicatrisation des plaies. (A) Le pourcentage de fermeture de la plaie calculé à l’aide de l’équation de Robson. (B) Affichage du taux de guérison sur la période d’évolution de 14 jours tel que déterminé par l’équation de Gillman. Les valeurs négatives dans les deux équations indiquent une augmentation de la taille de la plaie, tandis que les valeurs positives sont associées à la fermeture de la plaie. Les deux panneaux représentent la cinétique de cicatrisation, les écarts-types (ET) étant indiqués par des barres d’erreur à côté de photographies illustrant l’évolution de la plaie sur 14 jours (D_0-14). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

La figure 3A présente le pourcentage de fermeture de la plaie calculé à l’aide de l’équation de Robson, et la figure 3B montre le taux de cicatrisation au cours de la période d’évolution de 14 jours, déterminé par l’équation de Gillman³³.

Dans les modèles précliniques, l’analyse quantitative de l’évolution des plaies traumatiques dans les modèles précliniques se heurte à des défis en raison de facteurs tels que la taille de la plaie, la réponse inflammatoire localisée³⁴, la localisation et/ou la manipulation. Des méthodes de planimétrie manuelles directes³⁶ et numériques indirectes 11,16,37,38 existent pour ces mesures. Contrairement aux études utilisant des méthodes manuelles, qui souffrent souvent d’un biais d’observateur et d’une variabilité des conditions d’éclairage, notre étude a utilisé une planimétrie numérique standardisée. Des études utilisant des mesures manuelles font état d’une plus grande variabilité de la taille de la plaie^10,38, tandis que notre technique a montré une plus grande cohérence dans le temps. De plus, par rapport à d’autres méthodes numériques 11,16,37,38, ce système d’éclairage et de positionnement contrôlé a permis d’obtenir des mesures plus précises.

L’absence de méthodologies détaillées, étape par étape, pour mesurer la surface et le périmètre de la plaie a conduit à la mise au point d’une méthode de mesure indirecte normalisée utilisant la planimétrie, la mise à l’échelle et la segmentation numériques. Pour ce faire, un stand de photodocumentation a été conçu et construit. En contrôlant les conditions d’éclairage, le positionnement du sujet et la distance de la caméra, la cohérence de l’acquisition d’images macroscopiques a été assurée, minimisant ainsi le biais dans les mesures de la plaie. Des études chez les rongeurs ont rapporté une fermeture continue de la plaie dès le jour zéro, attribuée à l’utilisation d’anneaux en silicone autour des lésions pendant l’intervention chirurgicale^39,16, empêchant peut-être la rétraction et l’expansion de la plaie pendant l’inflammation. À l’inverse, une autre étude évaluant des produits de derme artificiel avec le facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF) a rapporté une augmentation de la surface de la plaie et du périmètre²⁰.

La cicatrisation des plaies comporte quatre phases séquentielles : l’hémostase (1 à 24 h)⁴⁰, l’inflammation (1 à 3 jours)⁴¹, la prolifération (3 à 21 jours)³⁴ et la consolidation (21 à 60 jours)⁴, bien que celles-ci puissent se chevaucher ^4,34. Dans cette étude, l’inflammation a progressé subjectivement du 3e au 6e jour, passant à la phase proliférative.

Cette phase de transition est cruciale pour la guérison, car elle réduit la réponse inflammatoire en diminuant les neutrophiles et en augmentant les macrophages³², favorisant l’angiogenèse⁴², la synthèse du collagène et l’activation des fibroblastes. Les fibroblastes migrent vers le site de la plaie, initiant la synthèse de la matrice extracellulaire et déposant de la fibronectine³⁴, du collagène, des protéoglycanes, de l’acide hyaluronique et des glycosaminoglycanes, essentiels à l’échafaudage et à l’adhésion cellulaire ultérieure⁴³. Du jour 2 au 6, ce modèle a montré une réduction de la taille de la plaie de 138,04 % à 108,21 %, indiquant une diminution de l’inflammation.

Malgré l’augmentation initiale de la taille de la plaie, cette tendance s’est inversée à partir du septième jour, atteignant 86,23 %, et a progressivement guéri jusqu’au 14e jour. Cela correspond probablement à la phase proliférative⁴⁴ et au début de l’angiogenèse⁴⁵, formant un tissu de granulation qui contracte la plaie, comme observé dans cette étude. Des modèles de fermeture continue similaires ont été rapportés dans des études sur des rongeurs ^6,19, indiquant que les plaies guérissent indépendamment des interventions cliniques, avec des différences dans la vitesse de fermeture. Ainsi, ce modèle pourrait servir de contrôle de référence.

La fermeture de la plaie a ralenti du 9e au 14e jour, pour finalement atteindre 6,60 %. Notamment, des croûtes se sont formées sur les plaies à partir du 4e jour, se détachant des bords au 10e jour, révélant de petites zones de tissu cicatriciel en dessous et se détachant complètement au quatorzième jour.

Il est crucial de noter qu’une plaie macroscopiquement fermée peut présenter des différences microscopiques significatives, nécessitant une analyse histologique détaillée pour observer la morphologie cellulaire et l’évolution de la plaie. Cette méthodologie permet d’obtenir des données précises sur la surface et le périmètre avec une variabilité minimale, ce qui facilite l’utilisation d’équations mathématiques dans l’analyse de la cinétique de fermeture des plaies. Le comportement mathématique observé dans les résultats calculés à l’aide des équations³³ de Gillman (figure 3B) et³² de Robson (figure 3A) était cohérent.

Étapes critiques du protocole
Bien que les plaies présentent généralement une transsudation plasmatique vers l’environnement extérieur, cette étude a contrôlé certains facteurs qui pourraient également influencer les mécanismes de réparation des plaies. Dans des essais précédents, il a été observé qu’une hémostase correcte favorise l’interaction entre la plaie et le film dermique, car un saignement excessif modifie la géométrie de la plaie et la taille de la croûte.

Modifications et dépannage
La méthodologie proposée permet de générer des modèles murins avec des plaies plus grandes et plus profondes. Cependant, si l’emplacement de la plaie est modifié, la base de référence doit être repositionnée pour s’assurer qu’elle reste centrée dans l’image macroscopique. De plus, les jours de photodocumentation et la durée du modèle peuvent être adaptés.

Limitations
Les limites de cette méthode incluent la taille de la cabine de photodocumentation, qui est conçue pour les petits rongeurs légers. Cependant, avec des modifications apportées à la base de la souris, elle pourrait être adaptée aux rongeurs plus grands. De plus, cette méthode ne mesure pas actuellement les plaies traumatiques extensionnelles par segmentation, bien qu’elle puisse être appliquée avec d’autres modifications.

Importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes ou alternatives
Diverses méthodologies de mesure des plaies utilisent la planimétrie numérique 11,12,13,14. Cependant, ils ne rendent souvent pas compte des conditions d’éclairage, de la distance entre l’appareil photo et la bobine ou de la répétabilité de la position de la photodocumentation au cours des jours d’évolution de la plaie. C’est là que l’étude actuelle est importante.

Dans ce modèle, la configuration de la lampe RVB offre des conditions d’éclairage optimales en mode CCT (Correlated Colour Temperature) à 9000 K avec une luminosité de 100 %. La distance idéale entre la base de la souris et l’objectif de l’appareil photo est de 18 cm. Ces conditions nous ont permis de constater que le canal rouge de l’empilement RVB segmente la zone de la plaie sans capturer les bords du tissu de granulation, ce qui n’a pas été signalé auparavant.

Enfin, considérant que certaines méthodologies utilisent des caméras¹⁶ montées sur des équipements tels que des stéréoscopes, qui ne sont pas accessibles à tous les laboratoires, ce stand de photodocumentation offre la possibilité d’obtenir des images de haute qualité pour des analyses ultérieures.

Importance et applications potentielles de la méthode dans des domaines de recherche spécifiques
Les applications potentielles et l’importance de cette méthodologie résident dans sa capacité à éliminer les biais dans les mesures des plaies, générant ainsi des données fiables pour le suivi du processus de guérison. De plus, la répétabilité de la position de la souris permet la création future d’une macro ImageJ qui analyse et délimite automatiquement les régions d’intérêt. De plus, si l’accès à un appareil photo semi-professionnel ou professionnel pour des images haute résolution n’est pas disponible, le stand peut être modifié pour prendre des photos à l’aide d’un appareil photo de téléphone portable, qui peut utiliser une application pour acquérir des photos sans correction automatique des couleurs.

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts liés à cette recherche.

Les auteurs tiennent à remercier le Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCyT, CVU : 933600) par le biais de la subvention pour le financement, ainsi que le Laboratorio Nacional de Investigación y Desarrollo de Radiofármacos del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (LANIDER-ININ) pour leur soutien. De plus, la figure 2 a été préparée à l’aide du logiciel BioRender (2020), disponible à l’BioRender.com/p67z056.