用于评估小鼠模型中伤口闭合动力学的数字平面测量法

伤口是一项全球性的健康挑战。本研究开发了一个利用数字平面测量的标准化照相亭，以最大限度地减少伤口测量的可变性。监测小鼠伤口超过 14 天显示伤口面积和周长最初增加，然后逐渐闭合。这种方法可能有助于评估临床前模型中的伤口闭合动力学。

由于慢性伤口的患病率高，是一个严重的全球健康问题。有效的治疗策略可以显着加速愈合，从而降低并发症的风险并减轻医疗保健系统的经济负担。尽管许多实验研究调查了伤口愈合，但大多数都依赖于定性观察或定量直接测量。本研究的目的是使用数字平面测量法标准化间接伤口测量方法，并结合数字缩放和分割。这种方法解决了缺乏准确伤口评估的详细、循序渐进的方法的问题。设计并建造了一个照相记录室，并使用计算机辅助数字平面测量工具来最大限度地减少伤口区域、周长以及从伤口中心到其边缘的距离测量的可变性。在雄性 CD1 小鼠 （n = 4,10 周龄，30-35 g） 肩胛骨水平的背侧中线形成一个圆形创伤伤口 （直径 5 mm）。使用定制设计的照相亭对伤口演变进行了 14 天的照片记录，该照相亭控制照明条件、焦距和受试者位置。使用 ImageJ 软件中的分割进行缩放和伤口测量，并使用统计分析软件进行统计分析。伤口闭合动力学显示，在第 0 天和第 2 天之间，伤口大小和周长略有增加，然后逐渐减少，直到第 14 天完全闭合。照相记录室和计算机辅助数字平面测量法实现了可变性最小的定量测量。总之，这些工具为临床前模型中评估伤口闭合动力学提供了一种可靠且可重复的方法。

创伤性伤口愈合大约需要 21 天，并且有一个明确的序列，分为四个不同的阶段：（1） 止血，（2） 炎症，（3） 增殖，和 （4） 重塑¹。如果伤口愈合的任何阶段延长，都可能导致慢性伤口的发展¹。由于它们的高患病率、潜在的并发症² 和巨大的经济负担，它们被认为是一个全球性的健康问题。

临床前研究旨在通过促进伤口全面再上皮化 ^3,4,5、预防并发症和降低治疗成本来实现更快的愈合。这些研究评估了各种策略，包括生物材料的开发、药物干预和其他再生医学程序 6,7,8,9。

已经开发了多种实验模型用于研究创伤性伤口。有些侧重于肉眼可见的定性特征，例如大小、炎症指标、肉芽组织的存在、分泌物和结痂形成⁵。其他研究则分析定量数据，包括面积、周长、半径、直径、颜色、深度以及从伤口中心到边缘的距离。

在这方面，大多数体内研究直接测量伤口半径和深度。然而，在宏观图像中手动描绘伤口边缘可能会在测量¹⁰ 中引入偏差。其他研究使用机械平面测量法，使用透明的网格塑料片，其中伤口边缘是预先划定的;在这两种情况下，获取面积或周长都需要手动工具，例如尺子或数字平面尺。如今，计算机辅助数字平面测量法允许对伤口或塑料片的宏观图像进行计算机化分析。原位作和宏观图像的质量是一个限制，但是，该工具 11,12,13,14 大大减少了面积和周长测量之间的差异。

与现有技术相比，这种提出的方法在评估小鼠伤口闭合方面具有显着优势 15,16,17,18,19,20。虽然照片记录被认为是评估伤口闭合动力学的准确且一致的工具，但之前的研究^21,22 强调了手动伤口测量的局限性，例如由于照明和相机定位不一致而导致的观察者偏差和可变性。目前的方法通过定制的展位标准化成像条件来解决这些问题，从而提高可重复性和精度。此外，计算机化数字平面测量法能够进行更准确的定量评估，加强对治疗干预的评估并最大限度地减少测量误差，正如其他比较手动和数字技术的研究所证明的那样^12,22 使其特别适用于小鼠模型中伤口闭合动力学的研究，允许通过严格控制图像采集条件来精确评估治疗。

所有涉及实验小鼠的实验程序均按照墨西哥官方标准 （NOM-062-ZOO-1999） 中制定的实验动物处理和护理的道德标准和规定进行。该方案由国家核研究所 （ININ） 的实验动物护理和使用内部委员会 （CICUAL） 审查和批准，参考编号为 CICUAL-01-23。本研究使用雄性 CD1 小鼠 （n = 4），10 周龄，体重在 28-32 g 之间。选择所有动物以确保品系、年龄、性别和体重的一致性，从而最大限度地减少实验结果的变异性。材料表中列出了所用试剂和所用设备的详细信息。

1. 用于采集宏观图像的照相亭建设

注意：使用许可的 SolidWorks 软件（2015 版）设计照相亭以消除外部光源。一个 40 厘米× 40 厘米的立方体是使用一英寸厚的白色铝型材构建的。立方体由三个部分组成，按顺序组装：屋顶、侧壁和地板（图 1A）。

1. 屋顶施工
   注意：屋顶被区域化为前边缘 （A）、后边缘 （B） 和侧边缘 （C 和 D） 以定向（图 1B）。
   1. 在屋顶侧边（C 和 D）的内部区域固定一个 1.5 厘米宽、2.51 厘米厚和 34.9 厘米长的开槽铝型材（设计用于固定玻璃）（图 1B）。
   2. 将两块 34.5 厘米长 x 13 厘米宽的矩形铝板放在每个屋顶型材的凹槽中，中间有聚乙烯（ 图 1C 中的板 1 和 2），以便滑过两个型材的凹槽。
   3. 使用双面胶带将色温范围为 2500-9000 K（图 1C）的 20 厘米 RGB LED 灯管以 45° 角安装在面板 1 的下侧边缘。
   4. 在屋顶板 1 和 2 上安装一个 32 厘米 x 12 厘米的矩形泡沫板，中央有一个直径为 7.82 厘米的圆形切口，以允许安装相机镜头（图 1C）。
2. 地板的构造
   1. 将一块 40 厘米 x 40 厘米见方的白色泡沫板放在地板区域型材的顶部。从泡沫板的每个角切割边长为 2.54 厘米的正方形（图 1E）。
3. 侧墙施工
   1. 切割四块 40 厘米 x 40 厘米的四边形泡沫板。
   2. 在 C 面和 D 面上用硅胶粘合两个面板，以形成左侧和右侧壁（图 1F）。
   3. 将钩环紧固件条连接到铝型材 A 和 B，以便轻松作内部照相亭元件。此外，将距离一排粘合紧固件边缘 1 厘米处连接到一侧的两个泡沫纸板方块上，并将它们放置在前后墙上（图 1F）。
4. 参考基地的构建
   注意：在麻醉期间和伤口演变的整个记录过程中，将鼠标保持在俯卧位需要一个参考基础。使用 PLA 材料和 3D 打印机 ^23,24 使用熔融沉积建模 （FDM） 技术设计和制造^3D 组件。
   1. 3D 打印底座宽、长、高为 2 cm 的面罩，并将其放置在距离预切的 40 cm x 28 cm 白色泡沫板矩形边缘 11.5 cm 处，以保持小鼠处于吸入麻醉状态（图 1D，红色）。
   2. 3D 打印具有四个挤压区域的矩形平台（9 厘米长、5 厘米宽、2.5 厘米高），以在图像采集过程中对齐鼠标背侧。这些区域支撑头部、四肢和腹部区域以保持俯卧位。将此平台粘在参考底座的中心（图 1D，绿色）。
   3. 3D 打印标尺块（2 厘米宽、8 厘米长、2.5 厘米高）并将其固定在距离鼠标底座左侧 1 厘米的位置，以放置数字图像处理所需的测量参考元件（图 1D，蓝色）。
   4. 将 15 厘米不锈钢刻度尺连接到标尺块上，并将整个参考底座安装在小屋内以进行图像缩放（图 1D）。

图 1：宏观图像采集柜的构造图。 （A） 机舱的各个部分（屋顶、侧壁、地板）。（二）形成屋顶的型材的方向;前 （A）、后 （B） 和侧面（截面内侧以红色“C，D”）显示。（C） 屋顶板 1 和 2、LED 灯管的安装、相机镜头板和地板的安装。（D） 安装麻醉面罩 （RED）、鼠标平台 （GREEN） 和矩形平台，用于将测量尺 （BLUE） 定位在参考底座上。（五） 引用基础的最终位置。（F） 侧面、前墙和后墙的安装。 请单击此处查看此图的较大版本。

2. 动物饲养

1. 获得机构生物伦理委员会的动物试验授权。使用 CD1 小鼠 （n = 4），10 周龄，体重 28-32 g。
2. 在标准条件下饲养小鼠：保持 21 °C 的温度，12/12 小时的光照/黑暗循环，45% 湿度， 并随意获取 水和食物，照片记录期间除外。

3. 创伤性伤口的产生

1. 手术前将小鼠禁食 8 小时。用 65 mg/kg²⁵ 的腹膜内戊巴比妥钠麻醉小鼠（遵循机构批准的方案）。
   1. 通过检查指间捏合期间是否缺乏撤退反射来确认麻醉深度。将眼药膏涂抹在眼睛上，以防止麻醉时干燥。在手术和恢复期间（20 分钟），将小鼠保持在 37 °C 的稳定温度下。
2. 将鼠标置于腹侧卧位，并使用手术刀片从颈部区域尾部剥离 2.5 厘米 x 3 厘米的区域。拉伸皮肤以避免撕裂伤。使用交替使用聚维酮碘和无菌水冲洗进行无菌和消毒。
3. 使用无菌的 5 毫米活检打孔器，并以圆周运动施加压力，在肩胛骨水平创建一个真皮-表皮切口。用锯齿镊子取下皮瓣，用虹膜尖剪刀剪断（图 2A）。
4. 如果伤口中存在出血点，请用电烙装置进行电工电击以实现止血。
5. 使用 Jeweler 镊子在伤口上放置一层直径为 1 厘米的圆形真皮膜，以防止污染和收缩。
6. 在无菌条件下进行所有存活手术。用聚维酮碘等消毒剂准备手术部位。戴上无菌手套和口罩，并在整个手术过程中使用无菌器械并尽量减少与非无菌表面的接触，以保持无菌。
   1. 手术后，将小鼠置于24°C的单个笼子中并监测它们，直到它们恢复足够的意识以维持胸骨位置。确保在手术期间和手术后控制体温，以通过使用外部热源防止体温过低。
7. 通过在饮用水中以 5 mg/kg²⁶ 的浓度稀释酮咯酸，进行镇痛直至第 4 天。
8. 14 天后，当健康啮齿动物的伤口通常达到愈合的晚期时，按照国际标准在 CO₂ 室中通过 O₂ 替代物对小鼠实施安乐死。这标志着研究的终点。

4. 宏观图像采集

1. 连续 14 天每天采集伤口图像，以监测伤口闭合的连续动力学。使用半专业或专业相机;将镜头穿过照相亭屋顶上的圆形开口。
   注意：根据实验条件根据需要调整时间表。
2. 在相关色温 （CCT） 模式下使用 RGB LED 灯管，设置为 9000 K 和 100% 亮度进行照明。
3. 将参考基座放在 Photo Booth 地板的中央。
4. 将鼠标放入吸入麻醉室中 3 分钟（图 2B）。
5. 诱导麻醉后，将鼠标俯卧置于鼠标平台上。将鼻子固定在七氟烷麻醉面罩内，以 1.5 L/min 的氧气流速输送 5% 七氟烷（图 2C）。
6. 在拍摄图像之前，使用 Jeweller 镊子从伤口中取出真皮膜，并将参考底座与相机镜头对齐。
7. 安装照相亭的前墙，使用以下设置拍摄宏观图像：光圈 f/3.2，曝光时间 1/200 秒，ISO 感光度 80，焦距 4mm。
8. 使用 Jeweller 镊子，在取下麻醉面罩之前，在伤口上放置一层直径为 1 厘米的真皮膜。将小鼠转移到各个笼子中并观察直到运动恢复。

5. 图像处理

1. 生成宏观图像的备份副本。使用 ImageJ 软件处理图像。
2. 按照路径在 ImageJ 中打开备份图像： 文件 > 打开 > 搜索 在图像中，然后单击 打开.
3. 按参考缩放图像：最大化图像，选择 直线 工具，使用 + 键放大鼠标旁边的标尺，在标尺图像上画一条 10 毫米的直线，然后转到 分析 > 设置比例 > 输入“10” 为 已知距离 > 将 长度单位 设置为 mm，然后单击 Ok.这决定了宏观图像的像素与距离比（图 2D）。
4. 将伤口区域与图像分开：使用矩形工具选择伤口周围的区域（w = 150，h = 150）。记录 X 和 Y 值，右键单击 矩形 > 复制 > 命名主题 > 按 Enter。在新图像中，按 + 两次放大（图 2E）。
5. 按照以下路径存储裁剪后的图像： 文件 > 另存为 > Tiff > 输入名称 > 存储。
6. 创建裁剪图像的副本以避免在分割过程中进行修改：右键单击 裁剪后的图像> 复制 > 命名 ，方法是在末尾添加“分段”。接下来，按 Enter。在新图像中，按 + 两次可放大。
7. 按照以下路径将图像分成颜色通道： 图像> Type > RGB Stack。在红色通道图像（1/3 红色）中，右键单击 复制，然后按 OK 在 复制 窗口中。
8. 分割红色通道图像。单击红色通道图像， 图像>调整阈值>。接下来，选择 Default > Apply （图 2F）。
9. 校正感兴趣区域 （ROI） 以确保伤口完全覆盖并避免分割失真。
   注意：如果分割中不包括伤口周围的区域，请转到 处理 > 二进制 > 填充孔。要去除伤口外的黑点，请转到 处理 > 二进制> Erode。如果 Erode 命令减小了伤口大小，请使用 Process > Binary > Dilate 进行校正。
10. 标记 ROI 的周长： Edit > Selection > Create Selection。ROI 将以黄色轮廓显示。按照 Edit > Selection > Add to Manager （图 2G）将其添加到 ROI Manager（图 2G）。
11. 验证分段：打开 ROI Manager 窗口，然后选择要查看的 ROI：More > Translate。输入步骤 4 中记录的 X 和 Y 值，然后按 OK。
    1. 最大化原始图像，然后在 ROI 管理器中选择 ROI。使用箭头键调整 ROI，直到它与伤口对齐（图 2H）。如果 ROI 与伤口匹配，则分割成功。否则，请从步骤 2 开始重复。
12. 确认分割后，获取伤口测量值： Analyze > Measure。结果表将显示面积、周长和 X/Y 位置值。将这些值复制到 SPSS 软件以进行记录和统计分析（图 2I）。

图 2：使用数字平面测量和分割技术的伤口测量工作流程。 （A） 使用无菌 5 mm 活检打孔器进行皮肤表皮切口。（B） 将鼠标置于吸入麻醉室中 3 分钟。（C） 通过将麻醉的鼠标放置在照相亭中并将其鼻子固定在七氟烷面罩内来进行照片记录。（D） 在 ImageJ 中打开获得的图像并使用标尺作为参考进行缩放。（E） 使用矩形工具提取伤口区域。（F） 将图像分离为 RGB 通道并处理红色通道。（G） 概述和管理感兴趣区域 （ROI）。（H） 通过将 ROI 与伤口匹配来验证分割。（I） 测量伤口参数并记录结果以进行统计分析。 请单击此处查看此图的较大版本。

6. 术后安乐死

注意：该研究在 14 天后结束，此时健康啮齿动物的伤口通常会达到愈合的高级阶段。在这个阶段，按照既定的机构批准的安乐死程序对小鼠进行人道安乐死。

1. 准备设备。确保安乐死室清洁、干燥且大小合适，以容纳小鼠而不会过度拥挤。将腔室连接到带有流量调节器的医用级 CO₂ 供应。
2. 轻轻地将小鼠转移到腔室中，以尽量减少压力。确保他们处于一个平静的环境中，外部干扰最小。
3. 将 CO₂ 流速设置为每分钟腔室体积的 20%-30%，如 AVMA 动物安乐死指南所建议。逐渐增加 CO₂ 浓度，以避免引起小鼠的痛苦或不适。
4. 在手术过程中密切观察小鼠。寻找逐渐失去意识的迹象，包括活动和呼吸减少，然后是呼吸暂停和心脏骤停。
5. 一旦小鼠不再呼吸且没有运动迹象，确认死亡;再等待 1-2 分钟以确保重要功能完全停止。通过确认无反射（例如角膜反射）和心脏活动来验证死亡。
6. 将尸体转移到指定的生物危险废物容器中。遵循安全处理动物遗骸的机构规程和国家准则。
7. 记录被安乐死的动物数量、日期和任何相关观察结果，以确保符合道德和机构标准。

在 ImageJ 软件中缩放图像后，通过数字分割获得伤口的平均周长（表 1）和面积（表 2）以及它们各自的标准差。这些值是从第 0 天到第 14 天 （D0-D14） 记录的。

表 1：伤口的周长测量值（第 0-14 天）。 值表示每天 （D_0-14） 的伤口周长测量值 （mm） 作为平均值±标准差 （SD）。

表 2：伤口面积测量（第 0-14 天）。 值将每天 （D_0-14） 的伤口面积测量值 （mm²） 显示为标准差 （SD） ±平均值。

伤口面积和周长最初从第 0 天到第 3 天增加，表明炎症反应暂时扩大了伤口大小，超出了其原始测量值。然而，从第 3 天到第 6 天，面积和周长都逐渐减少，到第 7 天观察到显着减少。此时，伤口的测量值小于其原始大小，表明愈合速度很强。

为了探测伤口闭合动力学，使用面积数据通过 Robson 方程^27,28（方程 1）计算伤口愈合的百分比：

其中，%Δ A 对应于评估日（面积 _{第 x 天}）伤口面积相对于零日初始面积（面积_{第 0 天}）的百分比减少。

表 3：伤口闭合百分比（Robson 方程）。 值表示伤口面积减少的平均百分比，由 Robson 方程（方程 1）计算为平均值±标准差 （SD）。

当从该方程获得的百分比为正（表 3）时，它们表示伤口闭合，而负值表示伤口大小增加（图 3A）。为了计算从伤口边缘到中心的缩回距离，使用面积和周长数据以及 Gilmam 方程 29,30,31（方程 2）：

其中，D 是从边缘到伤口中心的平均线性推进距离，以毫米为单位，A₀ 是治疗开始时（_{第 0} 天）的伤口面积，A_i 是测量时的伤口面积，P₀ 是开始时伤口的周长（_{第 0} 天）， P_i 测量时的周长。

表 4：伤口边缘回缩（Gilmam 方程）。 值按时间顺序显示从伤口边缘到中心的平均回缩 （mm），以平均值±标准差 （SD） 表示。

与伤口闭合百分比匹配， 公式 2 中的正值表示伤口边缘越来越近，表明收缩（表 4）。相反，负值反映了该距离的增加（图 3B）。最初，在第 0 天，伤口直径测量为 5 毫米，导致从边缘到中心的伤口直径为 2.5 毫米± 0.0425 毫米。该初始距离用作计算平均每日伤口回缩率的基线。然后从初始距离中减去计算出的回缩率，以生成表 5 中所示的合成伤口闭合率。

表 5：伤口闭合率 （mm）。 值显示伤口随时间的回缩。这是通过从初始距离 （2.5 mm ± 0.0425） 减去每个时间点与伤口边缘的距离作为标准差 （SD） ±平均值来获得的。

闭合百分比是使用 Robson 方程³² （图 3A）计算的，通常用于糖尿病神经病变溃疡闭合的连续测量，而 Gillman 方程³³ （图 3B）通常用于监测伤口愈合进度。

第 0 天，初始手术伤口（直径 5 毫米，表示 100%）在第 2 天显着增加至 138.04%，这可能是由于伤口周围的初始炎症过程 ^4,34。在此期间，中性粒细胞和巨噬细胞迁移，释放细胞因子和生长因子²⁸。炎症期通常持续一到三天³⁵。尽管如此，在大面积受伤、感染增加、既往病症或修复机制延迟的老年人的情况下，它可以延长数周。

这些结果突出了这种方法的有效性，该方法结合了照相亭、数字分割和数字平面测量法的使用，以准确捕捉伤口闭合动力学的动态变化。在该模型中，炎症可能导致伤口边缘回缩，导致伤口面积和周长最初增加。此外，我们确定宏观成像的最佳照明条件是在 CCT 模式下以 9000 K 和 100% 强度使用 RGB LED 灯管实现的，理想的相机距离设置为距离鼠标 18 厘米。

图 3： 伤口愈合动力学。 （A） 使用 Robson 方程计算的伤口闭合百分比。（B） 显示由 Gillman 方程确定的 14 天进化期内的愈合速率。两个方程中的负值表示伤口大小增加，而正值与伤口闭合相关。两个面板都代表愈合动力学，标准差 （SD） 由误差线显示，旁边照片说明了 14 天 （D_0-14） 的伤口演变。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3A 显示了使用 Robson 方程计算的伤口闭合百分比， 图 3B 显示了由 Gillman 方程³³ 确定的 14 天进化期内的愈合率。

在临床前模型中，由于伤口大小、局部炎症反应³⁴、位置和/或作等因素，定量分析临床前模型中创伤伤口的演变面临挑战。这些测量存在直接手动³⁶ 和间接数字^{11、16、37、38} 平面测量方法。与使用手动方法的研究相比，手动方法经常受到观察者偏差和照明条件变化的影响，我们的研究采用了标准化的数字平面测量法。使用手动测量的研究报告了伤口大小^10,38 的更高可变性，而我们的技术随着时间的推移显示出更高的一致性。此外，与其他数字方法 11,16,37,38 相比，这种受控照明和定位系统可实现更准确的测量。

由于缺乏详细的分步方法来测量伤口面积和周长，导致开发了一种使用数字平面测量、缩放和分割的标准化间接测量方法。为了实现这一目标，设计并建造了一个照相记录室。通过控制照明条件、受试者位置和相机距离，确保了宏观图像采集的一致性，从而最大限度地减少了伤口测量中的偏差。对啮齿动物的研究报告称，从零开始伤口持续闭合，这归因于在手术过程中在病灶周围使用了硅胶环^39,16，可能防止了炎症期间伤口的回缩和扩张。相反，另一项评估具有碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF） 的人造真皮产品的研究报告称，伤口面积和周长增加²⁰。

伤口愈合包括四个连续的阶段：止血（1-24 小时）⁴⁰、炎症（1-3 天）⁴¹、增殖（3-21 天）³⁴ 和巩固（21-60 天）⁴，尽管这些阶段可以重叠 ^4,34。在这项研究中，炎症从第 3-6 天主观进展，过渡到增殖期。

这个过渡阶段对愈合至关重要，因为它通过减少中性粒细胞和增加巨噬细胞³²、促进血管生成⁴²、胶原蛋白合成和成纤维细胞活化来减少炎症反应。成纤维细胞迁移到伤口部位，启动细胞外基质合成并沉积纤连蛋白³⁴、胶原蛋白、蛋白聚糖、透明质酸和糖胺聚糖，这些对于支架和随后的细胞粘附至关重要⁴³。从第 2-6 天开始，该模型显示伤口大小从 138.04% 减少到 108.21%，表明炎症减轻。

尽管最初伤口大小增加，但这一趋势从第 7 天开始逆转，达到 86.23%，并逐渐愈合，直到第 14 天。这可能对应于增殖期⁴⁴ 和血管生成⁴⁵ 的开始，形成收缩伤口的肉芽组织，如本研究所观察到的那样。啮齿动物研究中也报道了类似的连续闭合模式 ^6,19，表明无论临床干预如何，伤口都会愈合，但闭合速度不同。因此，此模型可用作参考对照。

伤口闭合从第 9-14 天减慢，最终达到 6.60%。值得注意的是，从第 4 天开始，伤口上就形成了结痂，第 10 天从边缘脱落，露出下面的小面积疤痕组织，并在第 14 天完全脱落。

需要注意的是，肉眼闭合的伤口可能表现出显着的微观差异，因此需要进行详细的组织学分析以观察细胞形态和伤口演变。这种方法允许以最小的可变性获得精确的面积和周长数据，从而有助于在分析伤口闭合动力学时使用数学方程。使用 Gillman^{的 33} （图 3B）和 Robson^{的 32} （图 3A）方程计算的结果中观察到的数学行为是一致的。

方案的关键步骤
尽管伤口通常表现出血浆渗出到外部环境中，但这项研究控制了某些也可能影响伤口修复机制的因素。在以前的试验中，观察到适当的止血促进了伤口和真皮膜之间的相互作用，因为过多的出血会改变伤口的几何形状和结痂的大小。

修改和故障排除
所提出的方法允许生成具有更大和更深伤口的小鼠模型。但是，如果伤口位置发生变化，则必须重新定位参考基座，以确保它在宏观图像中保持居中。此外，照片记录的天数和模型的持续时间可以调整。

局限性
这种方法的局限性包括照相记录室的大小，该照相室是为小型、轻便的啮齿动物设计的。然而，通过对小鼠基础的修改，它可以适应更大的啮齿动物。此外，这种方法目前不通过分割来测量伸展性创伤伤口，尽管它可以通过进一步的修改来应用。

该方法相对于现有/替代方法的重要性
伤口测量的各种方法采用数字平面测量法 11,12,13,14。然而，它们通常不会报告照明条件、相机到伤口的距离或伤口演变过程中照片记录位置的可重复性。这就是当前研究的意义所在。

在此型号中，RGB 灯配置在 9000 K 的相关色温 （CCT） 模式下以 100% 的亮度提供最佳照明条件。鼠标底座和相机镜头之间的理想距离为 18 厘米。这些条件使我们能够发现 RGB 堆栈的红色通道分割了伤口区域，而没有捕获肉芽组织边缘，这在以前没有报道过。

最后，考虑到某些方法使用安装在立体镜等设备上的相机¹⁶ ，并非所有实验室都可以使用，因此该照相记录室提供了获得高质量图像以供后续分析的机会。

该方法在特定研究领域的重要性和潜在应用
这种方法的潜在应用和意义在于它能够消除伤口测量中的偏差，生成可靠的数据来跟踪愈合过程。此外，鼠标位置的可重复性允许将来创建一个 ImageJ 宏，以自动分析和描绘感兴趣的区域。此外，如果无法使用半专业或专业相机拍摄高分辨率图像，则可以修改展位以使用手机相机拍照，手机相机可以使用应用程序获取照片，而无需自动色彩校正。

作者声明与本研究不存在利益冲突。

作者要感谢 Consejo Nacional de Humanidades， Ciencias y Tecnologías （CONAHCyT， CVU： 933600） 通过赠款提供资金，并感谢 Laboratorio Nacional de Investigación y Desarrollo de Radiofármacos del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares （LANIDER-ININ） 的支持。此外，图 2 是在 BioRender 软件 （2020） 的帮助下准备的，该软件可在 BioRender.com/p67z056 上获得。