Planimetría digital para evaluar la cinética de cierre de heridas en un modelo de ratón

Las heridas representan un desafío para la salud mundial. Este estudio desarrolló un fotomatón estandarizado que utiliza planimetría digital para minimizar la variabilidad de la medición de heridas. El seguimiento de las heridas en ratones durante 14 días reveló un aumento inicial en el área y el perímetro de la herida, seguido de un cierre gradual. Esta metodología puede ayudar a evaluar la cinética de cierre de heridas en modelos preclínicos.

Las heridas crónicas, debido a su alta prevalencia, son un grave problema de salud mundial. Las estrategias terapéuticas eficaces pueden acelerar significativamente la curación, reduciendo así el riesgo de complicaciones y aliviando la carga económica de los sistemas sanitarios. Aunque numerosos estudios experimentales han investigado la cicatrización de heridas, la mayoría se basan en observaciones cualitativas o mediciones directas cuantitativas. El objetivo de este estudio fue estandarizar un método de medición de heridas indirectas utilizando planimetría digital, incorporando escalamiento y segmentación digital. Este enfoque aborda la falta de metodologías detalladas y paso a paso para una evaluación precisa de las heridas. Se diseñó y construyó una cabina de fotodocumentación, y se emplearon herramientas de planimetría digital asistida por computadora para minimizar la variabilidad en las mediciones del área de la herida, el perímetro y la distancia desde el centro de la herida hasta sus bordes. Se creó una herida traumática circular (5 mm de diámetro) en la línea media dorsal a nivel del omóplato de ratones machos CD1 (n = 4, 10 semanas de edad, 30-35 g). La evolución de la herida se fotodocumentó durante 14 días utilizando el fotomatón diseñado a medida, que controló las condiciones de iluminación, la distancia focal y la posición del sujeto. Las mediciones de raspado y heridas se realizaron mediante segmentación en el software ImageJ, y el análisis estadístico se realizó mediante el software de análisis estadístico. La cinética de cierre de la herida mostró un ligero aumento en el tamaño y el perímetro de la herida entre el día 0 y el día 2, seguido de una disminución gradual hasta el cierre completo el día 14. La cabina de fotodocumentación y la planimetría digital asistida por ordenador permitieron realizar mediciones cuantitativas con una variabilidad mínima. En conclusión, estas herramientas proporcionan un método fiable y reproducible para evaluar la cinética de cierre de heridas en modelos preclínicos.

La cicatrización de heridas traumáticas tarda aproximadamente 21 días y tiene una secuencia bien definida de cuatro fases distintas: (1) hemostasia, (2) inflamación, (3) proliferación y (4) remodelación¹. Si alguna fase de la cicatrización de la herida se prolonga, puede conducir al desarrollo de heridas crónicas¹. Debido a su alta prevalencia, posibles complicaciones² y una importante carga económica, se consideran un problema de salud mundial.

Los estudios preclínicos tienen como objetivo lograr una cicatrización más rápida al promover la reepitelización integral de la herida ^3,4,5, prevenir complicaciones y reducir los costos del tratamiento. Estos estudios evalúan diversas estrategias, incluyendo el desarrollo de biomateriales, intervenciones farmacológicas y otros procedimientos de medicina regenerativa 6,7,8,9.

Se han desarrollado múltiples modelos experimentales para el estudio de las heridas traumáticas. Algunos se centran en las características cualitativas macroscópicamente visibles, como el tamaño, los indicadores de inflamación, la presencia de tejido de granulación, las secreciones y la formación de costras⁵. Otros analizan datos cuantitativos, como el área, el perímetro, el radio, el diámetro, el color, la profundidad y las distancias desde el centro hasta los bordes de las heridas.

En este sentido, la mayoría de las investigaciones in vivo miden directamente el radio y la profundidad de la herida. Sin embargo, la delineación manual de los bordes de la herida en una imagen macroscópica puede introducir sesgos en la medición¹⁰. Otros estudios utilizan planimetría mecánica, utilizando láminas de plástico cuadriculadas transparentes, donde se delinean previamente los bordes de la bobina; En ambos casos, la obtención del área o perímetro requiere de instrumentos manuales como reglas o planímetros digitales. Hoy en día, la planimetría digital asistida por ordenador permite el análisis computarizado de imágenes macroscópicas de heridas o láminas de plástico. La manipulación in situ y la calidad de la imagen macroscópica son una limitación, sin embargo, esta herramienta 11,12,13,14 reduce considerablemente la variabilidad entre las mediciones de área y perímetro.

Esta metodología propuesta ofrece ventajas significativas sobre las técnicas existentes para evaluar el cierre de heridas en ratones 15,16,17,18,19,20. Si bien la documentación fotográfica se ha considerado una herramienta precisa y consistente para evaluar la cinética de cierre de heridas, estudios previos^21,22 han destacado las limitaciones de la medición manual de heridas, como el sesgo del observador y la variabilidad debido a la iluminación y el posicionamiento inconsistentes de la cámara. El enfoque actual aborda estos problemas mediante la estandarización de las condiciones de imagen a través de una cabina personalizada, lo que mejora la reproducibilidad y la precisión. Además, la planimetría digital computarizada permite evaluaciones cuantitativas más precisas, mejorando la evaluación de las intervenciones terapéuticas y minimizando los errores de medición, como se evidencia en otros estudios que comparan técnicas manuales y digitales^12,22, lo que la hace particularmente adecuada para estudios de cinética de cierre de heridas en modelos murinos, permitiendo una evaluación precisa de los tratamientos al mantener un control estricto sobre las condiciones de adquisición de imágenes.

Todos los procedimientos experimentales con ratones de laboratorio se llevaron a cabo de acuerdo con las normas éticas y regulaciones establecidas en la Norma Oficial Mexicana (NOM-062-ZOO-1999) para el manejo y cuidado de animales de laboratorio. El protocolo fue revisado y aprobado por el Comité Interno para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL) del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (ININ) bajo el número de referencia CICUAL-01-23. En este estudio se utilizaron ratones machos CD1 (n = 4), de 10 semanas de edad, con un peso corporal que osciló entre 28 y 32 g. Todos los animales fueron seleccionados para asegurar la uniformidad en la cepa, edad, sexo y peso corporal, minimizando la variabilidad en los resultados experimentales. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Construcción de fotomatón para la adquisición de imágenes macroscópicas

NOTA: Se utilizó el software con licencia SolidWorks (versión 2015) para diseñar un fotomatón con el fin de eliminar las fuentes de iluminación externas. Se construyó un cubo de 40 cm × 40 cm utilizando un perfil de aluminio blanco de una pulgada de grosor. El cubo constaba de tres secciones, ensambladas secuencialmente: el techo, las paredes laterales y el suelo (Figura 1A).

1. Construcción de tejados
   NOTA: El techo se regionalizó como borde delantero (A), borde trasero (B) y bordes laterales (C y D) para orientarse (Figura 1B).
   1. Fije en el área interna del borde lateral del techo (C y D) un perfil de aluminio ranurado (diseñado para sostener vidrio) de 1,5 cm de ancho, 2,51 cm de espesor y 34,9 cm de largo (Figura 1B).
   2. Coloque dos placas rectangulares de aluminio de 34,5 cm de largo x 13 cm de ancho con polietileno en el centro en la ranura de cada perfil de techo (Placa 1 y 2 en la Figura 1C) para permitir el deslizamiento a través de la ranura de ambos perfiles.
   3. Instale un tubo de luz LED RGB de 20 cm con un rango de temperatura de color de 2500-9000 K (Figura 1C) en un ángulo de 45° en el borde inferior del panel 1 con cinta adhesiva de doble cara.
   4. Monte en los paneles de techo 1 y 2 un panel rectangular de tablero de espuma de 32 cm x 12 cm con un recorte circular central de 7,82 cm de diámetro para permitir la instalación de la lente de la cámara (Figura 1C).
2. Construcción del suelo
   1. Coloque una pieza cuadrada de tablero de espuma blanca de 40 cm x 40 cm encima de los perfiles del área del piso. Corte cuadrados con una longitud lateral de 2,54 cm de cada esquina del tablero de espuma (Figura 1E).
3. Construcción de muros laterales
   1. Corta cuatro paneles cuadrangulares de cartón pluma de 40 cm x 40 cm.
   2. Pegue dos paneles con silicona en los lados C y D para formar las paredes laterales izquierda y derecha (Figura 1F).
   3. Fije las tiras de cierre de gancho y bucle a los perfiles de aluminio A y B para facilitar la manipulación de los elementos internos del fotomatón. Además, fije a 1 cm del borde de una línea de sujetadores adhesivos a dos cuadrados de cartón espuma en un lado y colóquelos en las paredes delantera y trasera (Figura 1F).
4. Construcción de la base de referencia
   NOTA: Fue necesaria una base de referencia para mantener al ratón en posición prona durante la anestesia y durante toda la documentación de la evolución de la herida. Los componentes 3D se diseñaron y fabricaron utilizando la técnica de Modelado por Deposición Fundida (FDM) con material PLA y una impresora 3D ^23,24.
   1. Imprime en 3D la mascarilla con una base de 2 cm de ancho, largo y alto y colócala a 11,5 cm del borde de un rectángulo de cartón pluma blanco precortado de 40 cm x 28 cm para mantener a los ratones bajo anestesia inhalatoria (Figura 1D, color rojo).
   2. Imprime en 3D la plataforma rectangular (9 cm de largo, 5 cm de ancho, 2,5 cm de alto) con cuatro áreas extruidas para alinear el dorso del ratón durante la adquisición de la imagen. Estas áreas sostenían la cabeza, las extremidades y la región abdominal para mantener la posición prona. Pegue esta plataforma al centro de la base de referencia (Figura 1D, color verde).
   3. Imprima en 3D el bloque de la regla (2 cm de ancho, 8 cm de largo, 2,5 cm de alto) y fíjelo a 1 cm del lado izquierdo de la base del ratón para colocar el elemento de referencia de medición necesario para el procesamiento digital de la imagen (Figura 1D, color azul).
   4. Coloque una regla graduada de acero inoxidable de 15 cm en el bloque de la regla e instale toda la base de referencia dentro de la cabina para escalar la imagen (Figura 1D).

Figura 1: Diagrama para la construcción del gabinete de adquisición de imágenes macroscópicas. (A) Secciones de la cabina (techo, paredes laterales, piso). (B)Orientación de los perfiles que forman la cubierta; delantero (A), trasero (B) y laterales (lado interior de los perfiles en rojo "C,D"). (C) Paneles de techo 1 y 2, instalación del tubo de luz LED, placa de lente de la cámara e instalación en el piso. (D) Instalación de la máscara de anestesia (ROJA), la plataforma del ratón (VERDE) y la plataforma rectangular para el posicionamiento de la regla de medición (AZUL) en la base de referencia. (E) Ubicación final de la base de referencia. (F) Instalación de paredes laterales, frontales y traseras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Mantenimiento de animales

1. Obtener la autorización del comité de bioética de la institución para la experimentación con animales. Utilice ratones CD1 (n = 4), de 10 semanas de edad, con un peso de 28-32 g.
2. Aloje a los ratones en condiciones estándar: mantener una temperatura de 21 °C, ciclos de luz/oscuridad de 12/12 h, 45% de humedad y proporcionar acceso ad libitum al agua y a los alimentos, excepto durante las sesiones de fotodocumentación.

3. Generación de heridas traumáticas

1. Ayuna a los ratones durante 8 h antes del procedimiento. Anestesiar a los ratones con pentobarbital sódico intraperitoneal a 65 mg/kg²⁵ (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
   1. Confirme la profundidad de la anestesia comprobando la falta de reflejo de retirada durante un pellizco interdigital. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para prevenir la sequedad durante la anestesia. Mantener los ratones a una temperatura estable de 37 °C durante la cirugía y la recuperación (20 min).
2. Coloque el ratón en posición de decúbito ventral y depílelo caudalmente en un área de 2,5 cm x 3 cm de la región cervical con cuchillas quirúrgicas. Estirar la piel para evitar laceraciones. Realizar asepsia y antisepsia alternando enjuagues con povidona yodada y agua estéril.
3. Utilice un punzón de biopsia estéril de 5 mm y aplique presión con movimientos circulares para crear una incisión dermoepidérmica a nivel del omóplato. Retire el colgajo con pinzas dentadas y corte con unas tijeras con punta de iris (Figura 2A).
4. En caso de presencia de puntos sangrantes en la herida, aplique una descarga eléctrica con un dispositivo de electrocauterización para lograr la hemostasia.
5. Coloque una película dérmica circular de 1 cm de diámetro sobre la herida con pinzas Jeweler para evitar la contaminación y la contracción.
6. Realizar todas las cirugías de supervivencia en condiciones estériles. Prepare el sitio quirúrgico con desinfectantes como povidona yodada. Use guantes estériles y una mascarilla, y mantenga la esterilidad durante todo el procedimiento mediante el uso de instrumentos estériles y minimizando el contacto con superficies no estériles.
   1. Después de la cirugía, coloque a los ratones en jaulas individuales a 24 °C y manténgalos monitoreados hasta que recuperen la conciencia suficiente para mantener la posición esternal. Asegúrese de controlar la temperatura corporal durante y después de la cirugía para prevenir la hipotermia mediante el uso de fuentes de calor externas.
7. Administrar analgesia hasta el día 4 diluyendo ketorolaco en agua de bebida a 5 mg/kg²⁶.
8. Después de 14 días, cuando las heridas en roedores sanos suelen alcanzar etapas avanzadas de curación, se sacrifica a los ratones mediante un reemplazo de_O2 en una cámara de CO₂ siguiendo los estándares internacionales. Esto marca el punto final del estudio.

4. Adquisición de imágenes macroscópicas

1. Capture imágenes de las heridas diariamente durante 14 días consecutivos para monitorear la cinética continua del cierre de la herida. Utilice una cámara semiprofesional o profesional; Coloque la lente a través de la abertura circular en el techo del fotomatón.
   NOTA: Ajuste el horario según sea necesario en función de las condiciones experimentales.
2. Utilice un tubo de luz LED RGB en modo de temperatura de color correlacionada (CCT), ajustado a 9000 K y 100% de brillo para la iluminación.
3. Coloque la base de referencia en el centro del suelo del fotomatón.
4. Coloque al ratón en la cámara de anestesia inhalada durante 3 min (Figura 2B).
5. Después de inducir la anestesia, coloque el ratón en posición prona sobre la plataforma del ratón. Asegure el hocico dentro de la máscara de anestesia de sevoflurano, administrando sevoflurano al 5% a un caudal de oxígeno de 1,5 L/min (Figura 2C).
6. Antes de capturar imágenes, retire la película dérmica de la herida con pinzas Jeweller y alinee la base de referencia con la lente de la cámara.
7. Instale la pared frontal del fotomatón y capture imágenes macroscópicas con los siguientes ajustes: apertura f/3.2, tiempo de exposición 1/200s, velocidad ISO 80, distancia focal 4mm.
8. Con unas pinzas Jeweller, coloque una película dérmica de 1 cm de diámetro sobre la herida antes de retirar la mascarilla anestésica. Transfiera los ratones a jaulas individuales y observe hasta la recuperación motora.

5. Procesamiento de imágenes

1. Genere una copia de seguridad de las imágenes macroscópicas. Procese las imágenes con el software ImageJ.
2. Abra la imagen de copia de seguridad en ImageJ siguiendo la ruta: Archivo > Abrir > Buscar en las imágenes, luego haga clic en Abrir.
3. Escalar la imagen por referencia: Maximice la imagen, seleccione la herramienta de línea recta , amplíe la regla junto al mouse con la tecla +, dibuje una línea recta de 10 mm en la imagen de la regla, luego vaya a Analizar > Establecer escala > Ingrese " 10" para Distancia conocida > Establecer Unidad de longitud en mm, y luego haga clic en Aceptar. Esto determina la relación píxeles-distancia de la imagen macroscópica (Figura 2D).
4. Separe el área de la herida de la imagen: Utilice la herramienta de rectángulo para seleccionar el área alrededor de la herida (w = 150, h = 150). Registre los valores X e Y, haga clic con el botón derecho en el rectángulo > Duplicar > Asigne un nombre al asunto > presione Enter. En la nueva imagen, presione + dos veces para acercar (Figura 2E).
5. Guarde la imagen recortada siguiendo la ruta: Archivo > Guardar como > Tiff > Introduzca el nombre > Guardar.
6. Cree un duplicado de la imagen recortada para evitar modificaciones durante la segmentación: Haga clic con el botón derecho en la imagen recortada > Duplicar > asígnele un nombre agregando "Segmentación" al final. A continuación, presione Enter. En la nueva imagen, presione + dos veces para acercar.
7. Separe la imagen en canales de color siguiendo esta ruta: Tipo de imagen > > pila RGB. En la imagen del canal rojo (1/3 rojo), haga clic con el botón derecho en Duplicar y presione OK en la ventana Duplicar.
8. Segmente la imagen del canal rojo. Haga clic en la imagen del canal rojo, Imagen > Ajustar > umbral. A continuación, seleccione Predeterminado > Aplicar (Figura 2F).
9. Rectifique la región de interés (ROI) para garantizar una cobertura completa de la herida y evitar distorsiones en la segmentación.
   NOTA: Si las áreas alrededor de la herida no están incluidas en la segmentación, vaya a Procesar > Binario > Rellenar Agujeros. Para eliminar los puntos negros fuera de la herida, vaya a Procesar > Binario > Erosionar. Si el comando Erosionar reduce el tamaño de la herida, corríjalo utilizando Procesar > binario > dilatar.
10. Marque el perímetro del ROI: Editar > selección > Crear selección. El retorno de la inversión se delineará en amarillo. Agréguelo al Administrador de ROI siguiendo Editar > Selección > Agregar al Administrador (Figura 2G).
11. Validar la segmentación: Abra la ventana Administrador de ROI y seleccione el ROI para revisar: Más > Traducir. Introduzca los valores X e Y registrados en el paso 4 y pulse OK.
    1. Maximiza la imagen original y, a continuación, selecciona el ROI en el Administrador de ROI. Ajuste el ROI con las teclas de flecha hasta que se alinee con la herida (Figura 2H). Si el retorno de la inversión coincide con la herida, la segmentación fue exitosa. De lo contrario, repita desde el paso 2.
12. Una vez confirmada la segmentación, obtenga las medidas de la herida: Analizar > Medir. Una tabla de resultados mostrará los valores de área, perímetro y posición X/Y. Copie estos valores en el software SPSS para su documentación y análisis estadístico (Figura 2I).

Figura 2: Flujo de trabajo de la medición de heridas mediante planimetría digital y técnicas de segmentación. (A) Incisión dermoepidérmica con un punzón de biopsia estéril de 5 mm. (B) Colocar al ratón en una cámara de anestesia inhalada durante 3 min. (C) Documentación fotográfica colocando el ratón anestesiado en el fotomatón y asegurando su hocico dentro de una máscara de sevoflurano. (D) Abrir la imagen obtenida en ImageJ y escalarla usando la regla como referencia. (E) Extracción del área de la herida con la herramienta de rectángulo. (F) Separar la imagen en canales RGB y procesar el canal rojo. (G) Esbozar y gestionar la región de interés (ROI). (H) Validar la segmentación haciendo coincidir el ROI con la herida. (I) Medición de los parámetros de la herida y registro de los resultados para el análisis estadístico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Eutanasia post-procedimiento

NOTA: El estudio concluye después de 14 días, momento en el que las heridas en roedores sanos suelen alcanzar etapas avanzadas de curación. En esta etapa, los ratones fueron sacrificados humanamente siguiendo el procedimiento de eutanasia establecido y aprobado institucionalmente.

1. Prepara el equipo. Asegúrese de que la cámara de eutanasia esté limpia, seca y del tamaño adecuado para acomodar a los ratones sin hacinamiento. Conecte la cámara a un suministro de_CO2 de grado médico con un regulador de flujo.
2. Transfiera suavemente los ratones a la cámara para minimizar el estrés. Asegúrese de que estén en un ambiente tranquilo con mínimas perturbaciones externas.
3. Ajuste el caudal de CO₂ al 20%-30% del volumen de la cámara por minuto, según lo recomendado por las Directrices de la AVMA para la eutanasia de animales. Aumente gradualmente la concentración de_CO2 para evitar inducir angustia o malestar en los ratones.
4. Observe a los ratones de cerca durante el procedimiento. Busca signos de pérdida gradual del conocimiento, incluida la disminución de la actividad y la respiración, seguida de apnea y paro cardíaco.
5. Confirmar la muerte una vez que los ratones ya no respiran y no muestran signos de movimiento; Espere 1-2 minutos adicionales para asegurar el cese completo de las funciones vitales. Verificar la muerte confirmando la ausencia de reflejos (p. ej., reflejo corneal) y actividad cardíaca.
6. Transfiera los cadáveres a los contenedores designados para Desechos Biológicos Peligrosos. Seguir los protocolos institucionales y las directrices nacionales para la disposición segura de los restos de animales.
7. Registre el número de animales sacrificados, la fecha y cualquier observación relevante para garantizar el cumplimiento de las normas éticas e institucionales.

Después de escalar las imágenes en el software ImageJ, se obtuvo el perímetro promedio (Tabla 1) y el área (Tabla 2) de las heridas, junto con sus respectivas desviaciones estándar, mediante segmentación digital. Estos valores se registraron desde el día cero hasta el día catorce (D0-D14).

Tabla 1: Mediciones perimetrales de heridas (Días 0-14). Los valores representan las medidas del perímetro de la herida (mm) cada día (D_0-14) como media ± desviación estándar (DE).

Tabla 2: Medidas de área de heridas (Días 0-14). Los valores muestran las mediciones del área de la herida (mm²) cada día (D_0-14) como media ± desviación estándar (DE).

El área y el perímetro de la herida aumentaron inicialmente desde el día 0 hasta el día 3, lo que indica una respuesta inflamatoria que aumentó temporalmente el tamaño de la herida más allá de sus medidas originales. Sin embargo, desde el día 3 hasta el día 6, tanto el área como el perímetro disminuyeron progresivamente, observándose una reducción significativa para el día 7. En este punto, las heridas medían menos que su tamaño original, lo que refleja una curación avanzada.

Con el fin de sondear la cinética de cierre de la herida, se utilizaron datos de área para calcular el porcentaje de cicatrización de la herida con la ecuación de Robson^27,28 (Ecuación 1):

donde, %Δ A corresponde al porcentaje de reducción del área de la herida el día de la evaluación (Área _{Día x}) con respecto al área inicial el día cero (Área_{Día 0}).

Tabla 3: Porcentaje de cierre de la herida (ecuación de Robson). Los valores representan los porcentajes medios de reducción del área de la herida, calculados por la ecuación de Robson (Ecuación 1) como media ± desviación estándar (DE).

Cuando los porcentajes obtenidos de esta ecuación son positivos (Tabla 3), indican cierre de la herida, mientras que los valores negativos indican un aumento en el tamaño de la herida (Figura 3A). Para calcular la distancia de retracción desde los bordes de la herida hasta el centro, se utilizaron datos de área y perímetro con la ecuación 29,30,31 de Gilmam (Ecuación 2):

donde, D es la distancia de avance lineal promedio en mm desde los márgenes hacia el centro de la herida, A₀ es el área de la herida al inicio del tratamiento (Día₀), A_i es el área de la herida en el momento de la medición, P₀ es el perímetro de la herida al comienzo (Día₀), P_i el perímetro en el momento de la medición.

Tabla 4: Retracción de los bordes de la herida (ecuación de Gilmam). Los valores muestran cronológicamente la retracción media (mm) desde el borde hasta el centro de la herida, presentada como media ± desviación estándar (DE).

Coincidiendo con los porcentajes de cierre de la herida, los valores positivos de la Ecuación 2 muestran que los bordes de la herida se acercan, lo que indica contracción (Tabla 4). Por el contrario, los valores negativos reflejan un aumento en esta distancia (Figura 3B). Inicialmente, el día 0, el diámetro de la herida medía 5 mm, lo que resultaba en 2,5 mm ± 0,0425 mm desde el borde hasta el centro. Esta distancia inicial sirvió como referencia para calcular la tasa media diaria de retracción de la herida. La tasa de retracción calculada se restó de la distancia inicial para generar la tasa de cierre de heridas sintéticas que se presenta en la Tabla 5.

Tabla 5: Tasa de cierre de la herida (mm). Los valores muestran la retracción de la herida a lo largo del tiempo. Esto se obtiene restando la distancia desde el borde de la herida en cada punto de tiempo de la distancia inicial (2,5 mm ± 0,0425) como media ± desviación estándar (DE).

El porcentaje de cierre se calculó utilizando la ecuación³² de Robson (Figura 3A), comúnmente utilizada en las mediciones secuenciales del cierre de la úlcera por neuropatía diabética, y la ecuación³³ de Gillman (Figura 3B) se emplea comúnmente para monitorear el progreso de la cicatrización de heridas.

En el día 0, la herida quirúrgica inicial (5 mm de diámetro, representada como 100%) mostró un aumento significativo a 138,04% en el día 2, probablemente debido al proceso inflamatorio inicial alrededor de la herida ^4,34. Durante este período, los neutrófilos y macrófagos migran, liberando citocinas y factores de crecimiento²⁸. La fase inflamatoria suele durar de uno a tres días³⁵. Aun así, puede extenderse varias semanas en casos de lesiones extensas, infecciones añadidas, afecciones preexistentes o en adultos mayores en los que se retrasan los mecanismos de reparación.

Estos resultados ponen de manifiesto la eficacia de esta metodología, que combina el uso del fotomatón, la segmentación digital y la planimetría digital para capturar con precisión los cambios dinámicos en la cinética del cierre de heridas. En este modelo, la inflamación probablemente causó la retracción del borde de la herida, lo que llevó a un aumento inicial en el área y el perímetro de la herida. Además, identificamos que las condiciones óptimas de iluminación para la imagen macroscópica se lograron utilizando un tubo de luz LED RGB en modo CCT a 9000 K y 100% de intensidad, con la distancia ideal de la cámara establecida en 18 cm del mouse.

Figura 3: Cinética de cicatrización de heridas. (A) El porcentaje de cierre de la herida calculado utilizando la ecuación de Robson. (B) Mostrar la tasa de curación durante el período de evolución de 14 días según lo determinado por la ecuación de Gillman. Los valores negativos en ambas ecuaciones indican un aumento en el tamaño de la herida, mientras que los valores positivos se asocian con el cierre de la herida. Ambos paneles representan la cinética de cicatrización, con desviaciones estándar (DE) mostradas por barras de error junto con fotografías que ilustran la evolución de la herida durante 14 días (D_0-14). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

La Figura 3A presenta el porcentaje de cierre de la herida calculado utilizando la ecuación de Robson, y la Figura 3B muestra la tasa de cicatrización durante el período de evolución de 14 días según lo determinado por la ecuación³³ de Gillman.

En los modelos preclínicos, el análisis cuantitativo de la evolución de las heridas traumáticas en modelos preclínicos se enfrenta a retos debido a factores como el tamaño de la herida, la respuesta inflamatoria localizada³⁴, la localización y/o la manipulación. Existen métodos de planimetría manual directa³⁶ e indirecta digital 11,16,37,38 para estas mediciones. A diferencia de los estudios que utilizan métodos manuales, que a menudo sufren de sesgo del observador y variabilidad en las condiciones de iluminación, nuestro estudio empleó planimetría digital estandarizada. Los estudios que utilizaron la medición manual reportan una mayor variabilidad en el tamaño de la herida^10,38, mientras que nuestra técnica mostró una mayor consistencia en el tiempo. Además, en comparación con otros métodos digitales 11,16,37,38, este sistema de iluminación y posicionamiento controlado dio como resultado mediciones más precisas.

La falta de metodologías detalladas paso a paso para medir el área y el perímetro de la herida llevó al desarrollo de un método de medición indirecta estandarizado que utiliza planimetría, escalado y segmentación digitales. Para ello, se diseñó y construyó una cabina de fotodocumentación. Al controlar las condiciones de iluminación, la posición del sujeto y la distancia de la cámara, se garantizó la consistencia en la adquisición de imágenes macroscópicas, minimizando el sesgo en las mediciones de la herida. Estudios en roedores han reportado el cierre continuo de la herida desde el día cero, atribuido al uso de anillos de silicona alrededor de las lesiones durante el procedimiento quirúrgico^39,16, posiblemente evitando la retracción y expansión de la herida durante la inflamación. Por el contrario, otro estudio que evaluó productos de dermis artificial con factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) informó un aumento en el área y el perímetro de la herida²⁰.

La cicatrización de heridas implica cuatro fases secuenciales: hemostasia (1-24 h)⁴⁰, inflamación (1-3 días)⁴¹, proliferación (3-21 días)³⁴ y consolidación (21-60 días)⁴, aunque estas pueden^{solaparse 4,34}. En este estudio, la inflamación progresó subjetivamente desde el día 3 hasta el día 6, pasando a la fase proliferativa.

Esta fase de transición es crucial para la cicatrización, ya que reduce la respuesta inflamatoria al disminuir los neutrófilos y aumentar los macrófagos³², promoviendo la angiogénesis⁴², la síntesis de colágeno y la activación de fibroblastos. Los fibroblastos migran al sitio de la herida, iniciando la síntesis de la matriz extracelular y depositando fibronectina³⁴, colágeno, proteoglicanos, ácido hialurónico y glicosaminoglicanos, esenciales para el andamiaje y la posterior adhesión celular⁴³. Del día 2 al 6, este modelo mostró una reducción del tamaño de la herida del 138,04% al 108,21%, lo que indica una disminución de la inflamación.

A pesar del aumento inicial del tamaño de la herida, esta tendencia se revirtió a partir del séptimo día, alcanzando el 86,23%, y se curó progresivamente hasta el día 14. Esto probablemente corresponde a la fase proliferativa⁴⁴ y al inicio de la angiogénesis⁴⁵, formando tejido de granulación que contrae la herida, como se observó en este estudio. Se han reportado patrones de cierre continuo similares en estudios con roedores ^6,19, lo que indica que las heridas cicatrizan independientemente de las intervenciones clínicas, con diferencias en la velocidad de cierre. Por lo tanto, este modelo podría servir como control de referencia.

El cierre de heridas se ralentizó del día 9 al 14, alcanzando finalmente el 6,60%. En particular, se formaron costras sobre las heridas a partir del día 4, que se desprendieron de los bordes hacia el día 10, revelando pequeñas áreas de tejido cicatricial debajo y se desprendieron por completo el día catorce.

Es crucial tener en cuenta que una herida cerrada macroscópicamente puede exhibir diferencias microscópicas significativas, lo que requiere un análisis histológico detallado para observar la morfología celular y la evolución de la herida. Esta metodología permite obtener datos precisos de área y perímetro con una variabilidad mínima, lo que facilita el uso de ecuaciones matemáticas en el análisis de la cinética de cierre de heridas. El comportamiento matemático observado en los resultados calculados utilizando las ecuaciones³³ (Figura 3B) de Gillman y³² (Figura 3A) de Robson fue consistente.

Pasos críticos del protocolo
Aunque las heridas suelen exhibir transudación plasmática al medio externo, este estudio controló ciertos factores que también podrían influir en los mecanismos de reparación de las heridas. En ensayos previos, se observó que una hemostasia adecuada promueve la interacción entre la herida y la película dérmica, ya que el sangrado excesivo altera la geometría de la herida y el tamaño de la costra.

Modificaciones y solución de problemas
La metodología propuesta permite la generación de modelos murinos con heridas más grandes y profundas. Sin embargo, si se cambia la ubicación de la herida, la base de referencia debe reposicionarse para garantizar que permanezca centrada en la imagen macroscópica. Además, se pueden ajustar los días para la fotodocumentación y la duración del modelo.

Limitaciones
Las limitaciones de este método incluyen el tamaño de la cabina de fotodocumentación, que está diseñada para roedores pequeños y livianos. Sin embargo, con modificaciones en la base del ratón, podría adaptarse para roedores más grandes. Además, este método no mide actualmente las heridas traumáticas extensionales mediante segmentación, aunque se puede aplicar con más modificaciones.

Importancia del método con respecto a los métodos existentes/alternativos
Diversas metodologías para la medición de heridas emplean planimetría digital 11,12,13,14. Sin embargo, a menudo no informan sobre las condiciones de iluminación, la distancia entre la cámara y la bobina o la repetibilidad de la posición de la fotodocumentación a lo largo de los días de evolución de la herida. Aquí es donde el estudio actual es significativo.

En este modelo, la configuración de la lámpara RGB proporciona condiciones de iluminación óptimas en el modo de temperatura de color correlacionada (CCT) a 9000 K con un brillo del 100%. La distancia ideal entre la base del ratón y la lente de la cámara es de 18 cm. Estas condiciones nos permitieron encontrar que el canal rojo de la pila RGB segmenta el área de la herida sin capturar los bordes del tejido de granulación, lo que no se había reportado anteriormente.

Por último, teniendo en cuenta que algunas metodologías utilizan cámaras¹⁶ montadas en equipos como los estereoscopios, que no son accesibles a todos los laboratorios, esta cabina de fotodocumentación ofrece la oportunidad de obtener imágenes de alta calidad para su posterior análisis.

Importancia y posibles aplicaciones del método en áreas específicas de investigación
Las posibles aplicaciones y la importancia de esta metodología radican en su capacidad para eliminar los sesgos en las mediciones de heridas, generando datos fiables para el seguimiento del proceso de curación. Además, la repetibilidad de la posición del ratón permite la creación futura de una macro ImageJ que analiza y delinea automáticamente las regiones de interés. Además, si no se dispone de acceso a una cámara semiprofesional o profesional para imágenes de alta resolución, la cabina puede modificarse para tomar fotografías con la cámara de un teléfono móvil, que puede utilizar una aplicación para adquirir fotos sin corrección automática del color.

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses relacionados con esta investigación.

Los autores agradecen al Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCyT, CVU: 933600) por la subvención para el financiamiento, y al Laboratorio Nacional de Investigación y Desarrollo de Radiofármacos del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (LANIDER-ININ) por su apoyo. Además, la Figura 2 se preparó con la ayuda del software BioRender (2020), disponible en BioRender.com/p67z056.