Enregistrement du courant de potassium voltage-dépendant sur les cardiomyocytes H9C2 via la technique de patch-clamp à cellules entières

Le présent protocole décrit une méthode efficace pour l’acquisition dynamique et en temps réel des courants des canaux potassiques voltage-dépendants (Kv) dans les cardiomyocytes H9c2 en utilisant la technique de patch-clamp à cellules entières.

Les canaux potassiques sur la membrane cellulaire du myocarde jouent un rôle important dans la régulation des activités électrophysiologiques cellulaires. Étant l’un des principaux canaux ioniques, les canaux potassiques voltage-dépendants (Kv) sont étroitement associés à certaines maladies cardiaques graves, telles que les lésions myocardiques induites par les médicaments et l’infarctus du myocarde. Dans la présente étude, la technique de patch-clamp à cellules entières a été utilisée pour déterminer les effets de 1,5 mM de 4-aminopyridine (4-AP, un inhibiteur des canaux potassiques à large spectre) et d’aconitine (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM et 200 μM) sur le courant du canal Kv (I_Kv) dans les cardiomyocytes H9c2. Il a été constaté que la 4-AP inhibait le I Kv d’environ 54%, tandis que l’effet inhibiteur de l’AC sur le I_Kv montrait une tendance dose-dépendante (aucun effet pour 25 μM, taux inhibiteur de 30% pour 50 μM, taux inhibiteur de 46% pour 100 μM et taux inhibiteur de 54% pour 200 μM). En raison des caractéristiques de sensibilité et de précision plus élevées, cette technique favorisera l’exploration de la cardiotoxicité et des effets pharmacologiques de l’ethnomédecine ciblant les canaux ioniques.

Les canaux ioniques sont des protéines intégrées spéciales intégrées dans la bicouche lipidique de la membrane cellulaire. En présence d’activateurs, les centres de ces protéines intégrées spéciales forment des pores hydrophiles hautement sélectifs, permettant aux ions d’une taille et d’une charge appropriées de passer à travers de manière passive¹. Les canaux ioniques sont à la base de l’excitabilité cellulaire et de la bioélectricité et jouent un rôle clé dans une variété d’activités cellulaires². Le cœur fournit du sang à d’autres organes par des contractions régulières résultant d’un processus couplé excitation-contraction initié par des potentiels d’action³. Des études antérieures ont confirmé que la génération de potentiels d’action dans les cardiomyocytes est causée par le changement de la concentration d’ions intracellulaires, et l’activation et l’inactivation des canaux ioniques Na+, Ca²+ et K⁺ dans les cardiomyocytes humains conduisent à la formation de potentiels d’action dans une certaine séquence 4,5,6. Les courants perturbés des canaux potassiques voltage-dépendants (Kv) (I_Kv) pourraient modifier le rythme cardiaque normal, entraînant des arythmies, qui sont l’une des principales causes de décès. Par conséquent, l’enregistrement de l’I_Kv est essentiel pour comprendre les mécanismes des médicaments pour traiter les arythmies potentiellement mortelles⁷.

Le canal Kv est un composant important du canal potassique. La fonction de coordination du canal Kv joue un rôle important dans l’activité électrique et la contractilité myocardique du cœur des mammifères ^8,9,10. Dans les cardiomyocytes, l’amplitude et la durée des potentiels d’action dépendent de la co-conduction des courants K⁺ sortants par plusieurs sous-types de canaux Kv¹¹. La régulation de la fonction du canal Kv est très importante pour la repolarisation normale du potentiel d’action cardiaque. Même le moindre changement de conductance Kv a un impact considérable sur la repolarisation cardiaque et augmente la possibilité d’arythmie^12,13.

Représentant une méthode fondamentale dans la recherche électrophysiologique cellulaire, un joint à haute résistance entre une petite zone de la membrane cellulaire et une pointe de pipette pour l’enregistrement de patch-clamp à cellules entières peut être établi en appliquant une pression négative. La pression négative continue fait que la membrane cellulaire entre en contact avec l’embout de la pipette et colle à la paroi interne de la pipette. Le circuit électrique complet résultant permet d’enregistrer n’importe quel courant de canal ionique unique à travers la surface de la membrane cellulaire¹⁴. Cette technique a une très grande sensibilité pour le courant du canal ionique de la membrane cellulaire et peut être utilisée pour détecter des courants dans tous les canaux ioniques, et les applications sont extrêmement larges¹⁵. De plus, par rapport au marquage fluorescent et au marquage radioactif, le patch-clamp a une autorité et une précision plus élevées¹⁶. À l’heure actuelle, la technique de patch-clamp à cellules entières a été utilisée pour détecter les composants de la médecine traditionnelle chinoise agissant sur les courants du canal Kv^17,18,19. Par exemple, Wang et al. ont utilisé la technique du patch-clamp à cellules entières et ont confirmé que le composant efficace de la graine de lotus pourrait atteindre l’inhibition du canal Kv4.3 en bloquant les canaux d’état^{activés 19}. L’aconitine (AC) est l’un des ingrédients efficaces et actifs des espèces d’Aconitum, telles que Aconitum carmichaeli Debx et Aconitum pendulum Busch. De nombreuses études ont montré que les surdoses de CA peuvent provoquer des arythmies et même un arrêt cardiaque²⁰. L’interaction entre l’AC et les canaux ioniques voltage-dépendants conduit à la perturbation de l’homéostasie ionique intracellulaire, qui est le mécanisme clé de la cardiotoxicité²¹. Par conséquent, dans cette étude, la technique de patch-clamp à cellules entières est utilisée pour déterminer les effets de l’AC sur le I_Kv des cardiomyocytes.

Les cardiomyocytes H9c2 de rat obtenus commercialement (voir le tableau des matières) ont été incubés dans du DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂. La technique de patch-clamp à cellules entières a ensuite été utilisée pour détecter les changements dans I_Kv dans les cellules H9c2 normales et les cellules traitées 4-AP- ou AC (Figure 1 et Figure 2).

1. Préparation de la solution

1. Préparer le milieu de culture cellulaire DMEM contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine (voir le tableau des matières).
2. Préparer une solution de 4-AP de 1,5 M en ajoutant 14,1165 mg de 4-AP à 100 μL de solution de DMSO (voir le tableau des matériaux). Diluer 1,5 M4-AP à 1,5 mM en ajoutant la solution extracellulaire (étape 1.5).
3. Préparer 400 mM de courant alternatif en ajoutant 5 mg de courant alternatif à 19,36 μL de solution de DMSO (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: Toutes les solutions ci-dessus ont été stockées dans un réfrigérateur à 4 ° C et la concentration finale du DMSO ne doit pas dépasser 0,1% (v / v).
4. Préparer 50 mL de solution intracellulaire en ajoutant 0,4100 g de KCl (110,0 mM), 0,0120 g de MgCl2 (1,2 mM), 0,1270 g de Na₂ ATP (5,0 mM), 0,1190 g de HEPES (10,0 mM) et 0,1900 g d’EGTA (10,0 mM) dans 50 mL d’eau bidistillée_(voir le tableau 1 et le tableau des matières).
   NOTE: La valeur du pH de la solution intracellulaire a été ajustée à 7,2 en utilisant 1 M KOH et a été aliquote en petits volumes (1,5-2 mL) et stockée à -20 °C.
5. Préparer 50 mL de solution extracellulaire en ajoutant 0,0185 g de KCl (5,0 mM), 0,3945 g de NaCl (135,0 mM), 0,0203 g de MgCl 2·6H2O (_2,0 mM), 0,0595 g de HEPES (5,0 mM) et 0,0990 g de D-glucose (10,0 mM) dans 50 mL d’eau bidistillée (voir le tableau 1 et le tableau des matières).
   REMARQUE: La solution extracellulaire doit être préparée pour une utilisation immédiate et sa valeur de pH doit être ajustée à 7,4 en utilisant 1 M NaOH.

2. Culture cellulaire

1. Une fois que la boîte de culture H9c2 devient confluente à 80%, digérer les cellules avec 0,25% de trypsine pendant 30 s.
2. Culture de 2 x 10 5 cellules/mL avec un milieu normal ou contenant un médicament (25 μM, 50 μM, 100 μM et 200 μM AC) dans une boîte de 35 mm tapissée de plaques de verre pendant 24 h à 37 °C, avec une atmosphère de CO₂ à⁵ % et une humidité relative de 70 % à 80 % (voir le tableau des matières).

3. Fabrication de micropipettes

1. Allumez l’extracteur de micropipette (voir le tableau des matériaux) et préchauffez pendant 30 minutes.
2. Placez un capillaire en verre borosilicaté avec un filament (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm, 10 cm de longueur) sur l’extracteur de micropipette. Sélectionnez l’ensemble de programmes à l’étape 3.3 et cliquez sur Entrée dans le panneau de configuration. Cliquez sur le programme Rampe dans le coin supérieur droit pour déterminer la valeur « Chaleur » du capillaire en verre.
3. Écrivez le programme pour tirer l’électrode selon la valeur déterminée par le test « Rampe » et utilisez les étapes suivantes: valeur « Heat » = valeur « Rampe », Pull = 0, Vel = vitesse de déplacement de la tige de traction, Temps = 200-250. Cliquez sur Pull pour commencer à fabriquer les pipettes.
   REMARQUE: Observez la couleur des dessiccants dans le récipient scellé de l’extracteur de micropipette avant de l’utiliser. Si la couleur passe du bleu au rose, les dessiccants doivent être remplacés. Pour éviter la contamination de l’embout de l’électrode, essayez de ne pas toucher la partie médiane du capillaire en verre pendant la préparation de la pipette. Ensuite, retirez soigneusement les pipettes produites et placez-les dans un récipient fermé et scellé.

4. Configuration de l’instrument

1. Allumez les instruments correspondants dans l’ordre suivant : le convertisseur numérique-analogique, l’amplificateur de signal, le micromanipulateur, le microscope et la caméra (voir Tableau des matériaux).
2. Ouvrez l’application d’imagerie, le logiciel d’amplificateur de signal et le logiciel d’acquisition de données en séquence (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: L’instrument doit être allumé séquentiellement; sinon, l’état « Demo Digitizer » apparaîtra après l’ouverture du logiciel.

5. Réglage des paramètres I_Kv

1. Modifiez le protocole d’enregistrement du I_Kv en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Cliquez sur Modifier et sélectionnez Modifier le protocole dans le logiciel d’acquisition de données (voir Tableau des matériaux).
   2. Modifiez le programme dans l’interface « Forme d’onde »: Époque A (Premier niveau = −60 mV, Niveau Delta = 0 mV, Première durée = 20 ms et Durée Delta = 0 ms); Époque B (premier niveau = −40 mV, niveau Delta = 10 mV, première durée = 150 ms et durée Delta = 0 ms) et époque C (premier niveau = −60 mV, niveau Delta = 0 mV, première durée = 30 ms et durée delta = 0 ms).
   3. Ensuite, cliquez sur l’interface Mode/Rate et définissez les données « Trial Hierarchy »: Trial delay = 0 s, Runs = 1, Sweeps = 11 et Sweep duration = 0.22 s^22,23.
      NOTE: Acquérir les courants du canal I_Kv en appliquant des pas de dépolarisation de 150 ms de −40 mV à +60 mV avec un incrément de 10 mV à un potentiel de maintien de −60 mV dans des conditions de contrôle. La durée totale du protocole doit être supérieure à la durée définie dans le programme « Waveform ».
2. Modifier le programme de soustraction de fuite par réfection : cliquez sur Modifier le protocole pour sélectionner le bouton Stimulus , et définissez le programme de soustraction des fuites dans la boîte de dialogue Soustraction des fuites par réfection : nombre de balayages = 2-8 (4 dans cette étude), Temps de stabilisation = 100-1 000 ms (200 dans cette étude), « Polarité » = « Opposé à la forme d’onde », niveau de maintien = −80 mV.
   REMARQUE : La soustraction de fuite P / N doit avoir un niveau de maintien inférieur au « Premier maintien » (−60 mV).

6. Enregistrement patch-clamp à cellules entières de l’I _Kv en mode pince de tension

1. Établissez le chemin de stockage des données : cliquez sur Fichier et sélectionnez Définir les noms des fichiers de données dans le logiciel d’acquisition de données. Ouvrez le protocole I_Kv établi (étape 5.1) en sélectionnant Modifier et en cliquant sur Ouvrir le protocole dans le logiciel d’acquisition de données. Enfin, cliquez sur l’option Outils et sélectionnez Test de membrane pour commencer à exécuter le protocole.
2. Ajouter la solution extracellulaire (étape 1.5) au bain cellulaire sur l’appareil de serrage patch-clamp à cellules entières (voir le tableau des matériaux) et placer la lame de couverture vers le haut avec les cellules H9c2 (cultivées à l’étape 2.1) dans le bain.
3. Remplissez 30% de la pipette (fabriquée à l’étape 3) avec la solution extracellulaire et installez-la sur le porte-électrode d’enregistrement intégré dans l’appareil de serrage patch. Serrez la pipette avec le joint torique en caoutchouc et la rondelle en plastique. Ensuite, déposez la pipette dans le bain avec le micromanipulateur. Cliquez sur l’interface de décalage de la pipette du logiciel d’amplificateur de signal (voir Tableau des matériaux) pour maintenir la ligne de base du courant I_Kv à 0 pA.
   NOTE: La solution intracellulaire (étape 1.4) doit être en contact avec la partie AgCl/Ag du fil d’argent, et le fil d’argent ne doit pas être proche de la paroi interne de la pipette. La résistance de la pipette doit être de 2-6 MΩ. Pour éviter l’occlusion de l’embout de la pipette, une pression positive continue doit être délivrée à la pipette à l’aide d’une seringue de 1,0 mL reliée au porte-électrode d’enregistrement via un tube en plastique²⁴.
4. Délivrez manuellement une pression positive appropriée à l’aide d’une seringue de 1,0 mL connectée au porte-électrode d’enregistrement par un tube en plastique. Déplacez légèrement la pipette en manipulant le micromanipulateur en trois dimensions pour entrer en contact avec la cellule.
5. Une fois que l’onde carrée de test de la membrane chute de 1/3 à 1/2 après que la pipette a touché la membrane cellulaire, retirez la pression positive et délivrez manuellement une pression négative appropriée. Cliquez ensuite sur l’interface Patch du logiciel d’acquisition de données pour former le sceau GΩ. Utilisez le logiciel d’amplificateur de signal « C p Fast » et « C_p Slow » pendant l’étanchéité des cellules pour compenser la capacité rapide et lente.
   REMARQUE: Lorsque l’essai sur membrane est ≥1 GΩ, une configuration fixée à la cellule se forme entre l’extrémité de la pipette et la cellule.
6. Appliquez de brèves impulsions de pression négative pour rompre un patch de la membrane cellulaire.
   REMARQUE: Une réduction précipitée de la résistance de la membrane caractérise un modèle d’enregistrement de cellules entières réussi. Si la résistance d’accès (R_a) ≥30 MΩ, les cellules doivent être resélectionnées pour les étapes 6.3-6.6. Afin d’assurer l’exactitude des données I_Kv enregistrées, la pression négative doit être éliminée après la rupture de la membrane cellulaire.
7. Exécutez la compensation capacitive de la membrane de cellule entière en cliquant sur le bouton Cellule entière du logiciel d’amplificateur de signal. Enfin, enregistrez et enregistrez les données en cliquant sur le bouton Enregistrement des données .
8. Ouvrez les données I_Kv enregistrées avec le logiciel d’analyse de données. Enregistrez les relations courant-tension (I−V): cliquez sur Analyser pour sélectionner Statistiques pour effectuer les opérations suivantes: sélectionnez la plage comme Cousors 1,2 pour l’analyse des données; cliquez sur les boutons Amplitude de crête et Moyenne , puis cliquez sur OK pour afficher les données dans la page Résultats . Enfin, copiez la colonne des données moyennes I_Kv dans le logiciel de dessin de fonction (voir Tableau des matériaux) pour une analyse plus approfondie.
9. Enregistrer les traces actuelles I_Kv représentatives : cliquez sur Modifier pour sélectionner Transférer les traces ; ensuite, sélectionnez la trace complète dans la région à transférer ; ensuite, cliquez sur Sélectionner dans Trace Selection, et sélectionnez IN 0 (pA) dans Signaux; enfin, cliquez sur OK pour afficher les données dans la page « Résultats », et copiez les données totales dans le logiciel de dessin de fonction pour dessiner les traces actuelles.
10. Enregistrez le protocole I_Kv : cliquez sur Modifier pour sélectionner Créer un signal de forme d’onde de stimulus, puis sélectionnez OK. Ensuite, refaites l’étape 6.9 sauf pour sélectionner A0 # 0 (mA) dans « Signaux ».

Ce protocole a permis l’enregistrement du I_Kv selon les paramètres définis dans la technique du patch-clamp à cellules entières. Le I_Kv a été déclenché par 150 ms de stimulus d’impulsion dépolarisant de −40 à +60 mV à un potentiel de maintien de −60 mV (Figure 3A). Le I_Kv des cardiomyocytes H9c2 du rat est d’abord apparu autour de -20 mV, puis l’amplitude a augmenté avec la dépolarisation. La relation moyenne entre le I_Kv et le potentiel membranaire a été calculée à partir des amplitudes de courant mesurées. Les résultats ont montré qu’en comparaison avec le groupe témoin, l’amplitude I_Kv était sensiblement réduite après le traitement de 5 minutes avec 1,5 mM 4-AP (Figure 3B). De plus, le I_Kv a diminué de manière significative aux potentiels membranaires de 10 mV à 60 mV de manière dose-dépendante après le traitement CA de 24 h (Figure 3C-F).

Figure 1: Équipement et instruments nécessaires pour enregistrer le I_Kv. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Organigramme de l’enregistrement électrophysiologique de I_Kv dans des cellules H 9c2 à l’aide d’une technique de patch-clamp sur cellules entières. (A) Culture cellulaire. (B) Préparation des solutions intracellulaires et extracellulaires. C) Illustration schématique de l’enregistrement sur cellules entières. C1: Déplacer la pipette près de la cellule; C2: Former un joint à haute résistance entre la pipette et la cellule; C3: Rupture de la membrane cellulaire. d) Enregistrer le I_Kv. D1: Diagramme schématique de la formation du courant K⁺; D2: Traces de courant représentatives pour le I_Kv enregistrées en mode de serrage de tension de cellule entière. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Représentant I_Kv dans les cellules H9c2. (A) Traces de courant représentatives pour le I_Kv mesurées dans des cellules H9c2 sans aucun traitement (groupe témoin), avec des milieux contenant du courant alternatif pendant 24 h (25 μM, 50 μM, 100 μM et 200 μM), et avec 1,5 mM 4-AP pendant 5 min. Le I_Kv a été déclenché par 150 ms d’impulsion dépolarisante de −40 à +60 mV à un potentiel de maintien de −60 mV. (B) Pour la stimulation 4-AP de 1,5 mM, le I_Kv est descendu à des potentiels membranaires de 10 mV à 60 mV. (C-F) Le traitement AC a diminué le I_Kv d’une manière dépendante de la concentration aux potentiels membranaires de 10 mV à 60 mV. *p < 0,05 par rapport au groupe témoin (n = 6). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Solutions intracellulaires et extracellulaires pour l’enregistrement de l’I_Kv en mode tension-pince.

La technique électrophysiologique patch-clamp est principalement utilisée pour enregistrer et refléter l’activité électrique et les caractéristiques fonctionnelles des canaux ioniques sur la membrane cellulaire²⁵. À l’heure actuelle, les principales méthodes d’enregistrement de la technique patch-clamp comprennent l’enregistrement monocanal et l’enregistrement de cellules entières²⁶. Pour le mode cellule entière, la microélectrode de verre et la pression négative sont utilisées pour former un joint à haute résistance entre une petite zone de la membrane cellulaire et une pointe de pipette²⁷. Une fois que la pression négative soutenue provoque la rupture de la membrane cellulaire par l’extrémité de la pipette et que la membrane se fixe à la paroi interne de la pipette, le circuit électrique complet formé entre la pipette et la cellule permet d’enregistrer la densité de courant des canaux ioniques individuels sur la surface de la membrane cellulaire^26,27 . Au cours des dernières années, la technique de patch-clamp à cellules entières a été largement utilisée pour la recherche de médicaments ciblant les maladies liées aux canaux ioniques. Bien qu’elle ait des exigences élevées pour les opérateurs, cette technique reste la « référence » pour la recherche sur les canaux ioniques²⁸. En outre, la technique de patch-clamp perforé peut également enregistrer les changements actuels dans les canaux ioniques cibles dans des environnements intracellulaires relativement stables sur des durées prolongées en utilisant des antibiotiques pour former des pores de perméabilité dans la membrane cellulaire^29,30. On peut enregistrer et tracer les changements dynamiques de la tension ou du courant des canaux ioniques en utilisant la technique du patch-clamp à cellules entières en mode pince de courant ou tension-pince, ce qui en fait sans aucun doute une plate-forme puissante pour évaluer l’activité pharmacologique ou les mécanismes de toxicité des médicaments^31,32.

L’AC est l’un des principaux composants toxiques des espèces d’Aconitum, appartient au groupe des alcaloïdes diester-diterpénoïdes et est hautement toxique^20,33. Des preuves ont indiqué que le courant alternatif peut causer une toxicité cardiovasculaire^34,35. En tant que bloqueur non sélectif du canal K ⁺, il a été rapporté que le courant alternatif peut bloquer le courant K+ transitoire vers l’extérieur, le courant K⁺ du redresseur retardé ultra-rapide et le courant K⁺ du redresseur retardé rapide, induisant des arythmies^21,36,37. À ce jour, il n’existe aucune preuve solide que les courants de potassium voltage-dépendants sont impliqués dans la cardiotoxicité du courant alternatif. Par conséquent, dans cette étude, l’effet inhibiteur de l’AC sur le I_Kv dans les cardiomyocytes H9c2 du rat a été examiné à l’aide de la technique de patch-clamp à cellules entières. L’activation des canaux Na⁺ est un mécanisme largement reconnu par lequel l’AC exerce des effets pharmacologiques ou toxicologiques³⁸. Fait intéressant, il existe des preuves que AC peut agir directement sur le I_Kv 21,36,37. Cependant, les données présentées dans cet article ne fournissent pas suffisamment de preuves que l’AC peut inhiber directement le I_Kv. L’effet inhibiteur I_Kv de l’AC peut être dû à l’activation directe des canaux Na⁺, ce qui nécessite une étude plus approfondie.

Depuis sa création et son développement, la technique de patch-clamp à cellules entières utilisée dans cette étude est devenue une méthode conventionnelle pour explorer la cardiotoxicité des médicaments en termes de canaux ioniques. Cette expérience a confirmé que le courant alternatif inhibait efficacement le I_Kv des cellules H9c2 d’une manière dépendante de la concentration en mode tension-pince. Cependant, chaque type de canal ionique, y compris les canaux K+, contient plusieurs sous-types, et seul le courant total du canal K⁺ dépendant de la tension a été enregistré dans cette étude. Des études ultérieures peuvent explorer les mécanismes pharmacologiques et toxicologiques de l’AC au moyen de lignées cellulaires modèles avec une expression élevée de sous-types de canaux ioniques spécifiques³⁷. Alternativement, on peut incorporer des canaux ioniques spécifiques marqués avec des protéines fluorescentes pour étudier visuellement la toxicité myocardique de l’AC³⁹. Les étapes critiques de ce protocole sont les étapes 6.4 à 6.6; l’achèvement de ces trois étapes détermine directement si l’enregistrement ultérieur de I_Kv est réussi. Par rapport à d’autres technologies, la technique de patch-clamp à cellules entières est la méthode de référence et acceptée pour enregistrer le courant dans des canaux ioniques simples dans la membrane cellulaire ou la membrane organite, avec les caractéristiques des exigences techniques élevées et de l’enregistrement à faible débit⁴⁰. En résumé, cette technique n’est pas seulement une méthode de base pour la recherche en électrophysiologie cellulaire, mais elle est également largement utilisée en neurosciences, en sciences cardiovasculaires et dans d’autres domaines.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous apprécions le soutien financier de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82130113) et du programme clé de R&D et de transformation du Département des sciences et de la technologie de la province du Qinghai (2020-SF-C33).