Un protocole complet à haute efficacité pour l’isolement, la culture, la polarisation et la caractérisation glycolytique des macrophages dérivés de la moelle osseuse

Ce protocole fournit des méthodes détaillées et complètes pour l’isolement, la culture, la polarisation et la mesure de l’état métabolique glycolytique des macrophages vivants dérivés de la moelle osseuse (BMDM). Ce document fournit des instructions étape par étape avec des illustrations visuelles réalistes pour le flux de travail et l’évaluation glycolytique des BMDM en temps réel.

Les macrophages sont parmi les cellules présentatrices d’antigènes les plus importantes. De nombreux sous-ensembles de macrophages ont été identifiés avec des signatures métaboliques uniques. Les macrophages sont généralement classés en sous-types de type M1 (inflammatoire) et de type M2 (anti-inflammatoire). Les macrophages de type M1 sont des macrophages pro-inflammatoires qui sont activés par le LPS et/ou les cytokines pro-inflammatoires telles que INF-γ, IL-12 et IL-2. Les macrophages polarisés de type M1 sont impliqués dans diverses maladies en médiant la défense de l’hôte contre une variété de bactéries et de virus. C’est très important pour étudier les macrophages de type M1 induits par le LPS et leurs états métaboliques dans les maladies inflammatoires. Les macrophages de type M2 sont considérés comme des macrophages anti-inflammatoires, activés par des cytokines et des stimulateurs anti-inflammatoires. Sous l’état pro-inflammatoire, les macrophages montrent une glycolyse accrue dans la fonction glycolytique. La fonction glycolytique a été activement étudiée dans le contexte de la glycolyse, de la capacité glycolytique, de la réserve glycolytique, de la glycolyse compensatoire ou de l’acidification non glycolytique à l’aide d’analyseurs de flux extracellulaire (XF).

Cet article démontre comment évaluer les états glycolytiques en temps réel avec des étapes faciles à suivre lorsque les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) respirent, consomment et produisent de l’énergie. En utilisant des inhibiteurs et des activateurs spécifiques de la glycolyse dans ce protocole, nous montrons comment obtenir une vue systémique et complète des processus métaboliques glycolytiques dans les cellules et fournir des résultats plus précis et réalistes. Pour être en mesure de mesurer plusieurs phénotypes glycolytiques, nous fournissons une méthode de normalisation simple, sensible et basée sur l’ADN pour l’évaluation de la polarisation des BMDM. La culture, l’activation/polarisation et l’identification du phénotype et de l’état métabolique des BMDM sont des techniques cruciales qui peuvent aider à étudier de nombreux types de maladies différentes.

Dans cet article, nous avons polarisé les macrophages M0 naïfs en macrophages de type M1 et M2 avec LPS et IL4, respectivement, et mesuré un ensemble complet de paramètres glycolytiques dans les BMDM en temps réel et longitudinalement au fil du temps, en utilisant l’analyse des flux extracellulaires et les activateurs et inhibiteurs glycolytiques.

Les macrophages sont l’une des cellules les plus critiques du système immunitaire inné, de type M1. Ils sont impliqués dans l’élimination des maladies infectieuses, la phagocytose, la présentation d’antigènes et la régulation de l’inflammation². De plus, les macrophages sont nécessaires pour réguler d’autres cellules immunitaires via diverses cytokines qu’elles libèrent³. Il existe un large spectre dans les phénotypes de macrophages⁴. En fonction des signaux auxquels les macrophages sont exposés, ils se polarisent vers différents états inflammatoires et métaboliques⁵. Les macrophages manifestent des altérations métaboliques dans diverses maladies, selon le tissu où ils résident⁶. Les macrophages polarisés ont la capacité de reprogrammer ou de changer leur métabolisme glycolytique, leur métabolisme lipidique, leur métabolisme des acides aminés et leur phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS)^7,8. Les macrophages de type M1 activés de manière classique et les macrophages de type M2 alternativement activés sont les deux phénotypes de macrophages³ les plus étudiés. Les macrophages quiescents non activés sont appelés macrophages M0. La polarisation des macrophages M0 vers un phénotype de type M1 peut être induite par la stimulation de DMBO naïfs avec un lipopolysaccharide bactérien (LPS)⁹. La voie de signalisation PI3K-AKT-mTOR-HIF1a peut être activée dans les macrophages en présence de cytokines inflammatoires, d’interféron-gamma (IFN γ,) ou de facteur de nécrose tumorale (TNF)¹⁰. Les macrophages de type M1 ont des niveaux accrus de métabolisme de glycolyse, des niveaux diminués de phosphorylation oxydative (OXPHOS), produisant des cytokines inflammatoires impliquées dans les maladies infectieuses et inflammatoires⁸. D’autre part, la polarisation vers le phénotype de type M2 peut être induite par l’interleukine (IL)-4, via les voies JAK-STAT, PPAR et AMPK, ou par les voies (IL)-13 et TGFβ^11,12.

Contrairement aux macrophages de type M1, les macrophages de type M2 ont une glycolyse réduite et une augmentation de l’OXPHOS et sont impliqués dans des activités antiparasitaires et de réparation tissulaire ^8,13. Les BMDM sont un système largement utilisé pour l’étude des macrophages dérivés des cellules souches de la moelle osseuse. La glycolyse et l’OXPHOS sont les deux principales voies de production d’énergie dans les cellules¹⁴. En fonction de leur microenvironnement, les BMDM peuvent choisir d’utiliser l’une ou l’autre de ces voies ; Dans certains cas, passez de l’un à l’autre ou utilisez les deux voies¹⁴. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur le métabolisme de la glycolyse dans les macrophages pro-inflammatoires activés. Lorsque le glucose dans le cytoplasme est converti en pyruvate puis en lactate, les cellules produisent des protons dans le milieu qui provoquent une élévation du taux d’acidification dans le milieu entouré de cellules de type M1⁵. Un analyseur de flux extracellulaire a été utilisé pour mesurer le taux d’acidification des milieux cellulaires. Les résultats sont exprimés sous forme de taux d’acidification extracellulaire (ECAR) ou de taux d’efflux de protons.

Une méthode optimisée, rapide et facile pour accéder aux niveaux de glycolyse dans les macrophages polarisés est essentielle pour déterminer le phénotype glycolytique, les changements de métabolites et les effets des inhibiteurs/activateurs et des médicaments sur les macrophages polarisés. La méthode décrite dans ce manuscrit a été optimisée pour fournir des informations sur des facteurs de glycolyse spécifiques (glycolyse, capacité glycolytique, réserve glycolytique et acidification non glycolytique), ainsi que sur la reprogrammation métabolique du métabolisme glycolytique. L’inhibiteur (2DG) qui a été utilisé dans cette étude cible explicitement la voie de la glycolyse.

Ce protocole optimisé a été modifié et amélioré sur la base de la combinaison d’un protocole¹⁶ publié, de l’analyse du flux extracellulaire des dosages glycolytiques des guides d’utilisation du fabricant et d’une communication directe avec les scientifiques de la R&D du fabricant.

Les souris ont été sacrifiées sans cruauté conformément aux directives de l’Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) et de l’American Association for Laboratory Animal Science (AALAS) et en utilisant des protocoles approuvés par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Texas A&M (IACUC).

1. Prélèvement de moelle osseuse chez la souris et culture de DMO.

1. Sacrifiez la souris (âgées de 6 à 10 semaines C57Bl/6 souris étaient dans ce protocole) et posez-la sur sa face ventrale, coupez la peau et la couche péritonéale et retirez doucement les pattes.
   REMARQUE : Utilisez l’exposition au gaz CO₂ pour euthanasier la souris.
2. Séparez les deux pattes arrière de la hanche vers le bas, en faisant attention de ne pas couper l’os.
3. Placez la patte entière dans un tube conique vide de 50 ml (avec les pieds vers le haut pour une prise facile à retirer plus tard) sur de la glace et procédez à la récolte des deux pattes de la souris.

2. Exposition du fémur

REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes dans une enceinte de biosécurité.

1. Récoltez le fémur en coupant le tibia de chaque patte et retirez autant de tissu entourant le fémur que possible avec des ciseaux et du papier de laboratoire.
2. Placez les fémurs récoltés et « nettoyés » dans une plaque de 10 cm contenant un morceau de papier de laboratoire saturé de milieu de culture tissulaire (TC) ou PBS. Placez-les sur de la glace.
3. Continuer à prélever les fémurs et à retirer les tissus de tous les fémurs avant de passer à l’étape du rinçage (figure 1A).

3. Rinçage de la moelle osseuse

1. Pour rincer la moelle osseuse des fémurs, utilisez une seringue de 3 mL remplie de milieu TC ou de PBS avec une aiguille 23G. Remplissez la seringue avant d’exposer la moelle.
2. Utilisez des ciseaux pour exposer la moelle en coupant l’extrémité du fémur aux deux épiphyses.
3. Insérez la pointe de l’aiguille dans le fémur et rincez doucement la moelle dans un plat de 10 cm.
4. Passez l’aiguille sur toute la longueur du fémur et rincez jusqu’à ce que la couleur de l’os devienne blanche. Habituellement, la plupart de la moelle osseuse peut être rincée avec 2 à 3 ml de milieu.
5. Rincez tous les fémurs et la moelle osseuse de la flaque dans le plat. Utilisez une aiguille pour briser les amas visibles. Filtrer la moelle dans un tube conique de 50 mL (figure 1A).

4. Lyse des globules rouges

1. Essorer la moelle à 190 x g pendant 10 min. Aspirez le surnageant.
2. Remettre la pastille en suspension dans 4 mL de tampon de lyse ACK à l’aide d’une pipette. Laisser agir le tampon de lyse des globules rouges pendant 5 minutes à température ambiante.
3. Ajouter 4 mL de TC medium RPMI-C 10 % (RPMI 1640 -GlutaMAX) complété par du 2-mercaptoéthanol, de la gentamicine, de la streptomycine et 10 % de FCS dans la suspension de moelle et tourner à 1300 x g pendant 10 min.
4. Filtrer à nouveau pour enlever les débris de globules rouges et les remettre en suspension dans un petit volume de RPMI-C 10 % pour le comptage.
5. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules (Figure 1B). Un compteur Vi-Cell a été utilisé pour déterminer le nombre et la viabilité des cellules dans la suspension.

5. Placage et culture

1. Ajouter 10 mL de RPMI-C 10 % + 10 ng/mL DE M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor, un régulateur essentiel de la prolifération, de la différenciation et de la survie des monocytes/macrophages) à autant de plaques de 10 cm que vous le souhaitez.
2. Ajouter un volume approprié de cellules comptées de manière à ce que chaque plaque de 10 cm contienne 1 x 10⁶ cellules. Mettez les plaques dans un incubateur à 37 °C (défini comme le jour 0).
3. Le 3e jour, ajouter délicatement 5 ml de RPMI-C 10 % + 10 ng/mL DE M-CSF frais dans chaque assiette.
   REMARQUE : Le jour 7, les BMDM doivent être prêtes pour les essais (figure 1C).

6. Récolter dans les assiettes

1. Utilisez un microscope optique pour confirmer que la plupart des cellules ont adhéré aux plaques.
2. Aspirez doucement le support. Ajouter ensuite 3 ml de PBS et agiter doucement l’assiette. Aspirez-le bien pour éliminer toutes les cellules non adhérentes restantes.
3. Ajoutez 7 à 10 ml de PBS froid dans la plaque, utilisez une pipette P1000 pour laver le fond des plaques et récoltez toutes les cellules restantes dans un tube de collecte.
   REMARQUE : Gardez les tubes sur de la glace car les macrophages sont très adhérents et adhéreront à l’intérieur du tube. Si les cellules restaient froides, elles auraient une adhérence moins stricte.
4. Centrifugeuses, cellules de comptage et cellules sur plaque pour les expériences (figure 1D). À l’aide de la cytométrie en flux, les cellules résultantes doivent être positives à >95 % pour CD11b et F4/80. (La polarisation des macrophages a été déterminée par coloration avec des marqueurs de type M1 de CD38, TNF-a et MCP-1 et marqueur de type M2 de CD206.
   REMARQUE : Effectuez les étapes 6.1 à 6.3 dans l’enceinte de sécurité biologique et effectuez l’étape 6.4 sur la paillasse. Maintenez les techniques d’asepsie tout au long de la procédure.

Figure 1 : Flux de travail graphique de la culture de moelle osseuse de souris de macrophages dérivés de BM. (A) Prélèvement des pattes, exposition du fémur et rinçage de la moelle osseuse ; (b) lyse des globules rouges ; (C) Placage et culture ; (D) Récolte de cellules à partir des plaques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

7. La veille du dosage de l’analyseur de flux métabolique : ensemencement et polarisation des cellules pour le test glycolytique

1. Réchauffez l’analyseur de flux métabolique à 37 °C en allumant l’instrument.
2. Hydratez une cartouche en ajoutant 200 μL d’une solution d’étalonnage et incubez la cartouche dans un incubateur sans CO₂ pendant la nuit (figure 2A). L’humidité de l’incubateur sans CO₂ n’est pas importante pour l’hydratation de la cartouche.
   1. Une heure avant l’expérience, trempez la plaque plusieurs fois de haut en bas, ce qui aidera à éliminer les bulles d’air.
3. Concevez la carte des plaques sur le logiciel dans le test de stress de glycolyse par défaut-injection aiguë, en suivant les instructions du test.
   1. Cliquez sur l’icône du logiciel, puis cliquez sur Test d’injection aiguë de stress de glycolyse. Sur l’icône de définition de groupe, générez des noms de groupe.
4. Il y a cinq cycles de mesure d’une durée de 18 minutes et quatre injections. Changez l’injection de la porte A en glucose, de la voie B en oligomycine, de la porte C en roténone et de l’antimycine A (Rot/AA) et de la porte D en 2DG.
5. Remettre les cellules en suspension dans le milieu RPMI-C à 10 % et amorcer 50 000 cellules par puits, à l’exception des quatre bords de la plaque (A1, A12, H1 et H12 ; Ajouter uniquement du milieu (pas de cellules) dans une microplaque d’analyseur de flux métabolique jusqu’à un volume final de 100 μL. Normalement, un minimum de 40 000 cellules est nécessaire pour effectuer ce test.
6. Laissez les cellules reposer à température ambiante pendant 45 minutes pour éviter l’effet de bord des cellules. L’effet de bord se produit lorsque le milieu autour du périmètre de la plaque s’évapore partiellement, ce qui provoque des changements de volume et de concentration et réduit la viabilité cellulaire.
7. Ajoutez 10 ng/mL de LPS pour polariser les macrophages naïfs vers les cellules de type M1 et ajoutez 20 ng/ml d’IL-4 pour les polariser vers les cellules de type M2. Utilisez au moins 3 à 6 puits par condition (figure 2B).
8. Vérifiez les cellules au microscope et placez la plaque dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 heures.

Figure 2 : Démonstration graphique de l’ensemencement et de la polarisation des cellules. (A) Configuration de l’analyseur de flux extracellulaire et hydratation de la cartouche ; (B) Polarisation des cellules et incubation pendant la nuit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

8. Jour du test : Préparation du milieu XF et du composé

1. Compléter 100 mL de milieu de dosage XF RPMI (pH 7,4) avec 2 mM de glutamine.
2. Stérilisez le média à l’aide d’un système de filtre sous vide de 0,2 μm.
3. Placez le milieu de dosage dans un bain-marie à 37^°C pendant 20 min.
4. Retirez les cellules plaquées de l’incubateur à 37 °C à 5 % de CO₂ . Lavez les cellules avec un milieu de test deux fois et remplacez le milieu précédent par un milieu de test jusqu’à ce qu’il atteigne le volume final de 180 μL.
5. Utilisez un microscope pour vous assurer que tous les puits ont des cellules confluentes et marquez tous les puits qui ont des rayures dues au pipetage. S’il y a des rayures, retirez cette plaque avant d’analyser.
6. Placez la plaque contenant la cellule dans un incubateur sans CO₂ pendant 45 min (Figure 3A).
7. Utilisation des composés et du milieu de dosage pour fabriquer des solutions mères de glucose (100 mM), d’oligomycine (100 μM), de pourriture/AA (50 μM) et de 2DG (500 mM) (tableau 1).
8. Faire un mélange d’injection 10x de chaque composé à l’aide d’un milieu de dosage (tableau 2).

Tableau 1. Crosses d’injection

Tableau 2. Concentrations finales par injection

9. Le jour du test : Exécution du test glycolytique aigu sur des macrophages polarisés

1. Ouvrez le modèle de test de stress de glycolyse (injection aiguë) enregistré à partir du logiciel. Le test de glyco-stress aigu par défaut comporte 3 minutes de mélange et de mesure avant chaque injection.
2. Vérifiez le modèle et les détails du test, et lorsque vous êtes prêt, cliquez sur Exécuter et suivez les instructions du test par défaut. Cependant, tous les paramètres peuvent être personnalisés.
3. Retirez la cartouche de capteur de l’incubateur sans CO₂ , retirez le couvercle et insérez-la dans l’instrument de manière à ce que le puits A1 de la plaque de cartouche tombe dans le coin supérieur gauche du panneau d’insertion de la machine. Habituellement, l’étalonnage prend entre 20 et 45 min.
4. Une fois l’étalonnage terminé, l’appareil éjectera la plaque contenant la solution d’étalonnage et maintiendra la cartouche du capteur. Retirez le calibrateur contenant la plaque.
5. Retirez la plaque cellulaire de l’incubateur sans CO₂ , retirez le couvercle de la plaque et insérez-la dans la machine. Cliquez sur Exécuter (Figure 3B).
6. Une fois le test terminé, la machine éjecte la plaque cellulaire et la cartouche du capteur.
7. Retirez le support de la plaque et congelez-le à -20 °C pour une normalisation supplémentaire.
8. Utilisez le kit de test de prolifération cellulaire commercial (par exemple, CyQUANT) pour normaliser les cellules.
9. Ajouter 1 mL de composé B ou de tampon de lyse à 19 mL d’eau distillée sans nucléases.
10. Ajouter 100 μL de solution de travail du composé A ou GR à la solution susmentionnée.
11. Assurez-vous que les cellules de la plaque sont décongelées, puis ajoutez 200 μL de la solution dans chaque puits.
12. Incuber 5 min à température ambiante (RT).
13. Mesurez la fluorescence dans des longueurs d’onde d’excitation de 480 nm et d’émission de 520 nm à l’aide d’un lecteur de plaques.
14. Normalisez les cellules sur le panneau de normalisation du logiciel.
15. Normaliser les cellules en fonction du nombre de macrophages naïfs (Figure 3C). Considérons la moyenne des macrophages naïfs comme 1 (en divisant le nombre de cellules de chaque puits par le nombre moyen de cellules de macrophages naïfs) et appliquez-les à tous les macrophages.

Figure 3 : Jour de l’essai : préparation du milieu et du composé et exécution de l’essai. (A) Préparation des cellules pour l’essai ; (B) la préparation des composés, l’étalonnage et l’exécution de l’essai ; (C) Normalisation et analyse des données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La glycolyse et la phosphorylation oxydative mitochondriale sont les deux principales voies de production d’ATP dans les cellules (Figure 4A). Certaines cellules ont la capacité de passer d’une voie à l’autre pour répondre à leurs besoins énergétiques. La conversion du glucose en pyruvate dans le cytoplasme s’appelle la glycolyse. Le pyruvate a deux destins ; il sera soit converti en lactate, soit métabolisé davantage par le cycle du TCA et éventuellement par la chaîne de transport d’électrons (ETC) pour produire plus d’ATP. Afin d’obtenir la meilleure compréhension des paramètres glycolytiques des cellules, nous minimisons les voies OXPHOS en utilisant l’oligomycine, qui est un inhibiteur de l’ATP synthase mitochondriale. Nous injectons également Rot/AA pour arrêter complètement l’ETC afin d’évaluer la capacité glycolytique maximale et la glycolyse compensatoire dans la cellule (Figure 4A). Le glucose est le principal carburant de la glycolyse. Étant donné que le milieu de test XF ne contient ni glucose ni glutamine, les trois premières mesures du test seront un indicateur du taux d’acidification non glycolytique (Figure 4B, C), qui est indicatif de l’acidification mais n’est pas lié à la conversion du glucose en lactate. Après l’injection de glucose à partir de l’orifice A, l’augmentation des taux d’ECAR est un indicateur des taux de glycolyse (mesures 4, 5 et 6). Ensuite, par l’injection d’oligomycine à partir de la porte B et l’injection de Rot/AA à partir de la porte C, l’ETC est inhibé, et des quantités accrues d’ECAR sont un indicateur de la capacité glycolytique et des taux de glycolyse compensatoire des cellules (Figure 4B, C). Les taux de glycolyse compensatoire des BMDM démontrent la capacité de gestion de l’énergie cellulaire dans des conditions de stress mitochondrial. En d’autres termes, ce paramètre indique une compensation de la demande d’énergie lorsque la respiration mitochondriale est inhibée. La dernière injection est du 2 désoxyglucose ou 2DG du port D qui est un inhibiteur compétitif du glucose.

Dans la figure 4B,C, un calcul alternatif, surtout s’il y a de grandes erreurs entre 3 mesures, est que l’on peut mesurer le dernier point de données avant chaque injection et éviter les erreurs et les variations inutiles dans les données.

Figure 4 : Production d’énergie dans la cellule et paramètres glycolytiques. (A) vue schématique des deux voies de production d’énergie les plus importantes dans la cellule ; Glycolyse (à gauche) et phosphorylation oxydative mitochondriale (à droite). La glycolyse est la conversion du glucose en pyruvate. L’analyseur XF peut détecter les protons produits par la conversion du pyruvate en lactate sous forme de niveaux ECAR (mpH/min). L’inhibition de l’ATP synthase suivie de l’inhibition des complexes I et II de la chaîne de transport d’électrons dans les mitochondries éliminera la production d’ATP et l’efflux de protons par OCR. (B) calcul des paramètres glycolytiques. (C) Paramètres de la fonction glycolytique après chaque injection de composé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

En général, les macrophages polarisés ont plus d’activités glycolytiques que les macrophages M0 naïfs. Les macrophages de type M1 induits par le LPS possèdent l’activité glycolytique la plus élevée. Bien que les macrophages polarisés aient des séparations plus distinctes dans leur capacité respiratoire de réserve OCR (16), ce qui n’a pas été démontré ici, leur métabolisme glycolytique est également entièrement distinguable. Il est important de noter qu’une augmentation de l’ECAR dans les BMDM polarisés de type M1 induits par le LPS n’est pas une caractéristique définitive pour d’autres types de macrophages polarisés de type M1 (tels que les macrophages de type M1 induits par LPS + INF-γ ou PAMP), et ils peuvent ne pas augmenter ou modifier l’ECAR sans stress glycolytique. Comme prévu, dans les trois premières mesures, qui est l’indicateur de l’activité non glycolytique, les macrophages polarisés ne montrent pas de différence significative car les milieux ne contiennent aucune source de glucose ou de pyruvate (Figure 5). Après l’injection de glucose, les BMDM polarisés indiquent des niveaux de glycolyse plus élevés que les BMDM naïfs, et les BMDM de type M1 présentent les niveaux de glycolyse les plus élevés par rapport aux modèles M0 et M1.

En règle générale, le métabolisme glycolytique est la voie de production d’ATP préférée utilisée par les macrophages de type M1, et OXPHOS est la principale voie de production d’ATP pour les macrophages de type M2. Après l’injection d’oligomycine, le complexe ATP synthase dans la chaîne de transport d’électrons mitochondriales des BMDM s’arrêtera ; Ainsi, les cellules commenceront à dépendre de la glycolyse pour répondre à leurs besoins énergétiques. Comme le glucose est présent dans le milieu, la capacité glycolytique des BMDM polarisés sera comparable. Encore une fois, les BMDM de type M1 induites par le LPS auront la capacité glycolytique la plus élevée. M2-like et M0 auront des capacités glycolytiques plus faibles, respectivement (Figure 5). L’injection de Rot/AA inhibera les complexes I et III de l’ETC mitochondrial et arrêtera complètement l’OXPHOS, et il y aura une augmentation légèrement plus élevée des niveaux d’ECAR, qui est un indicateur de glycolyse compensatoire. Encore une fois, les BMDM de type M1 auront les niveaux ECAR les plus élevés à cette étape ; enfin, le 2DG, un inhibiteur compétitif du glucose et un contrôle négatif de la glycolyse, arrêtera complètement la voie de la glycolyse.

Figure 5 : Fonctions glycolytiques des BMDM naïves M0 et polarisées de type M1 (induite par le LPS) et de type M2 (induite par l’IL4). Paramètres glycolytiques des macrophages polarisés indiqués par ECAR (mpH/min). (A) Taux d’acidification non glycolytique, glycolyse, capacité glycolytique et glycolyse compensatoire sous forme ECAR (mpH/min) dans les BMDM M0, M1-like et M2-like. Les injections des orifices sont les suivantes → le port A : glucose, le port B : oligomycine, le port C : roténone plus antimycine A, et le port D : 2 déoxy-glucose (B) Graphiques à barres de chaque paramètre pour les BMDM M0, M1-like et M2-like. Les données présentées proviennent de 4 à 6 puits de culture par expérience. La signification statistique entre les groupes est basée sur l’ANOVA à un facteur avec le test de comparaison multiple de Tukey à « * » p < 0,05, la signification à « ** » p < 0,01, la signification à « *** » p < 0,001, la signification à « **** » p < 0,0001.Les barres d’erreur sont dérivées de l’écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Comme mentionné précédemment, l’analyseur de flux extracellulaire peut fournir des informations en temps réel sur deux principales voies de production d’énergie des cellules en mesurant l’OCR (taux de consommation d’oxygène), un indicateur de l’activité mitochondriale OXPHOS, et l’ECAR (taux d’acidification extracellulaire) qui est un indicateur de la glycolyse. Les macrophages peuvent utiliser les deux voies, en fonction de leur microenvironnement. Ils peuvent également changer leurs voies de production d’énergie^17,18. La compréhension des états énergétiques des macrophages et de leurs réponses à différents médicaments, cytokines, inhibiteurs, activateurs, etc. permettra de mieux comprendre les états métaboliques de ces cellules. Étant donné que la glycolyse est l’une des voies les plus critiques qui sont activées dans les types de macrophages de type M1, les informations liées à la glycolyse en temps réel peuvent aider à suivre les changements des BMDM polarisés de type M1 dans différentes conditions in vitro¹⁹. L’analyse du flux extracellulaire du dosage du débit d’ATP en temps réel est très considérée comme un moyen d’évaluer la production d’ATP des BMDM^{polarisés 20}. Le protocole présenté ici fournit des détails techniques et des approches avec une démonstration visuelle du flux de travail pour servir de protocole complet qui peut être adapté aux besoins expérimentaux.

Ce test fournit des mesures précises des niveaux glycolytiques pour les conditions basales et la glycolyse compensatoire après inhibition mitochondriale. Il est important de noter qu’une partie de l’acidification dans les milieux extracellulaires peut avoir une source mitochondriale²¹. Le cycle de Krebs ou cycle TCA produit du CO₂ qui peut acidifier le milieu par sa réaction avec les molécules d’eau²². Lorsque l’activité mitochondriale est inhibée, les taux d’acidification sont des indicateurs de l’accumulation de lactate dans le milieu. L’avantage du test d’effort glycolytique est l’injection de glucose dans un milieu qui n’a pas de sources de glucose ou de pyruvate pour évaluer les niveaux de glycolyse avant et après le traitement du glucose dans le milieu.

D’autre part, le test du taux glycolytique fournit des informations spécifiques sur les sources distinctes de glycolyse en bloquant l’activité mitochondriale. En d’autres termes, l’efflux de protons glycolytiques peut être calculé en soustrayant l’efflux de protons OXPHOS de l’efflux total de protons. Dans ce protocole, nous avons combiné les tests glycolytiques en un seul test et maximisé les données glycolytiques pour obtenir des résultats de glycolyse, de capacité glycolytique, de réserve glycolytique, de glycolyse compensatoire et d’acidification non glycolytique. Ces paramètres permettront de mieux comprendre les états métaboliques et le phénotype glycolytique des cellules. Avec une méthode de normalisation rapide et facile optimisée, il serait possible d’obtenir des informations plus précises sur le métabolisme glycolytique et la reprogrammation métabolique 21,22,23.

Il est important de noter que bien que l’implication de la réserve glycolytique ne change pas dans le nouveau système combiné, le schéma de calcul de la méthode a été légèrement modifié. Dans le système combiné (Figure 4B), la réserve glycolytique est estimée par l’ECAR moyen (10,11,12)-ECAR moyen (4,5,6). Cependant, dans les méthodes non combinées, la réserve glycolytique est calculée par la formule ECAR moyenne (7,8,9)-ECAR moyenne (4,5,6). Les deux calculs donnent des résultats très similaires et reflètent la réserve glycolytique.

De plus, il convient de mentionner qu’il existe différentes mesures d’acidifications extracellulaires dans les analyseurs de flux extracellulaires. Les résultats des dosages glycolytiques dans les analyseurs de flux extracellulaires peuvent être analysés sur la base de l’ECAR (mpH/min), du PPR (pmol H+/min) et du PER (pmol H+/min). Il y a des avantages et des inconvénients, mais en général, l’ECAR est la façon la plus typique d’afficher les données d’acidification extracellulaire.

Notre laboratoire étudie le rôle des métabolites du microbiote sur les cellules immunitaires. Étant donné que les macrophages sont l’un des composants clés du système immunitaire dans les maladies inflammatoires chroniques telles que l’athérosclérose 23,24,25, nous nous intéressons à l’étude du rôle des métabolites du microbiome sur la polarisation des macrophages, en particulier des macrophages polarisés inflammatoires qui ont été induits par différents signaux proathérogènes tels que les acides gras saturés, les LDL modifiés, et les métabolites nocifs dérivés ou dépendants du microbiote intestinal. Nous confirmons la polarisation des BMDM par des marqueurs de surface et intracellulaires de type M1 et M2 en utilisant la cytométrie en flux et la qPCR. Nous considérons les tests de flux extracellulaire comme des lectures fonctionnelles dans les études. Nous réalisons des études complémentaires en mesurant les facteurs de glycolyse en temps non réel à l’aide d’un dosage du lactate.

La polarisation de type M1 induite par le LPS ou la polarisation de type M1 induite par le LPS + IFNγ est la voie d’activation classique de type M1 la plus courante dans les macrophages. Dans une polarisation de type M1, l’ajout d’IFNγ au LPS ou l’augmentation de la concentration de LPS augmentera la réduction de la capacité respiratoire de réserve dans la chaîne de transport d’électrons mitochondrials. L’IFNγ est connu pour induire un phénotype de type M1, mais, généralement, l’IFNγ en lui-même n’est pas suffisant et nécessite des agonistes supplémentaires des TLR pour induire le phénotype. Mais cela dépend des maladies et de la polarisation de type M1 concernant une condition spécifique. Par exemple, les macrophages de type M1 induits par l’IFNγ ne peuvent pas produire de NO et les cytokines inflammatoires similaires aux macrophages induits par le LPS ou le LPS/IFNγ²⁶.

Les médicaments qui empêchent les macrophages de la polarisation inflammatoire ont le potentiel de prévenir et de contrôler l’athérosclérose. Comprendre les voies métaboliques, l’énergie et les caractéristiques phénotypiques des macrophages M1 est essentiel pour étudier le rôle de différents médicaments endogènes et exogènes. La glycolyse est la voie dominante de production d’énergie dans les macrophages de type M1^24,27.

Cette étude simplifiée se concentre uniquement sur les états énergétiques glycolytiques des BMDM polarisés. Les doses utilisées dans cet article sont construites sur les recommandations du fabricant et rendent l’expérience beaucoup plus facile à suivre. De plus, la plupart des composés utilisés dans cette étude sont fournis dans le kit standard du fabricant ; Cela permet de gagner du temps et d’améliorer la cohérence des expériences. Il est essentiel de savoir que de légères différences dans les doses de composés, le nombre de cellules et les temps d’incubation peuvent affecter les résultats de l’expérience. De plus, chaque expérimentateur doit effectuer un titrage cellulaire, une dose-réponse et une analyse cinétique pour son type de cellule et ses conditions particulières afin de comprendre comment ces conditions fonctionnent sur l’analyseur de flux extracellulaire.

Il convient de noter que pendant les étapes de changement de support, de lavage et de normalisation, certaines cellules peuvent se détacher par pipetage ou pression de fluide. La confluence des cellules est toujours détectable au microscope. Ces puits doivent être exclus de l’étude s’ils présentent des signes d’égratignures ou d’épuisement des cellules.

Nous utilisons des microplaques de 96 puits avec un nombre minimal de cellules par puits, ce qui permet des contrôles positifs et négatifs, ainsi que différentes conditions à tester dans une seule plaque ; Ainsi, ce test est très rapide et rentable pour l’analyse des flux extracellulaires. Cette étude a été optimisée pour la BMDM, qui est différente des macrophages résidant dans les tissus, des macrophages péritonéaux et des lignées cellulaires de macrophages.

Alors que dans ce protocole, nous nous sommes principalement concentrés sur l’application de l’analyse des flux extracellulaires dans la glycolyse associée à l’état pro-inflammatoire, l’analyse des flux extracellulaires peut également être utilisée pour évaluer les caractéristiques de la fonction mitochondriale telles que la respiration totale, la respiration mitochondriale basale, la production d’ATP, la fuite de protons, la respiration maximale et la capacité respiratoire de rechange. Les mitochondries jouent un rôle important dans la reprogrammation métabolique des macrophages. Des analyseurs de flux extracellulaires ont été utilisés pour évaluer le stress mitochondrial et l’oxydation des acides gras en mesurant le taux de consommation d’oxygène des cellules¹⁶.

En conclusion, nous avons fourni ici un protocole complet pour l’isolement, la culture, la polarisation et l’analyse fonctionnelle glycolytique des BMDM. Des procédures détaillées étape par étape et des démonstrations visuelles ont été fournies pour toutes les étapes. Nous espérons que ce protocole aidera les chercheurs à rationaliser leurs analyses et à évaluer la fonction glycolytique des BMDM avec une qualité et une efficacité élevées.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous remercions Mme Joanna Rocha pour son aide rédactionnelle. Le travail a été partiellement soutenu par les National Institutes of Health (NIH) R01DK118334 (aux Drs Sun et Alaniz) et (NIH) R01A11064Z (aux Drs Jayaraman et Alaniz).