Ein umfassendes hocheffizientes Protokoll für die Isolierung, Kultur, Polarisation und glykolytische Charakterisierung von Makrophagen aus dem Knochenmark

Dieses Protokoll bietet detaillierte und umfassende Methoden für die Isolierung, Kultur, Polarisation und Messung des glykolytischen Stoffwechselzustands von lebenden Makrophagen (BMDMs) aus dem Knochenmark. Dieses Dokument bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen mit realistischen visuellen Illustrationen für den Arbeitsablauf und die glykolytische Bewertung von BMDMs in Echtzeit.

Makrophagen gehören zu den wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen. Viele Untergruppen von Makrophagen wurden mit einzigartigen metabolischen Signaturen identifiziert. Makrophagen werden allgemein in M1-ähnliche (entzündliche) und M2-ähnliche (entzündungshemmende) Subtypen eingeteilt. M1-ähnliche Makrophagen sind proinflammatorische Makrophagen, die durch LPS und/oder entzündungsfördernde Zytokine wie INF-γ, IL-12 und IL-2 aktiviert werden. M1-ähnliche polarisierte Makrophagen sind an verschiedenen Krankheiten beteiligt, indem sie die Abwehr des Wirts an eine Vielzahl von Bakterien und Viren vermitteln. Dies ist sehr wichtig, um LPS-induzierte M1-ähnliche Makrophagen und ihre Stoffwechselzustände bei entzündlichen Erkrankungen zu untersuchen. M2-ähnliche Makrophagen gelten als entzündungshemmende Makrophagen, die durch entzündungshemmende Zytokine und Stimulatoren aktiviert werden. Im proinflammatorischen Zustand zeigen Makrophagen eine erhöhte Glykolyse in der glykolytischen Funktion. Die glykolytische Funktion wurde aktiv im Zusammenhang mit der Glykolyse, der glykolytischen Kapazität, der glykolytischen Reserve, der kompensatorischen Glykolyse oder der nicht-glykolytischen Ansäuerung mit extrazellulären Flussanalysatoren (XF) untersucht.

In diesem Artikel wird gezeigt, wie die glykolytischen Zustände in Echtzeit mit leicht verständlichen Schritten bewertet werden können, wenn die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) atmen, verbrauchen und Energie produzieren. Anhand spezifischer Inhibitoren und Aktivatoren der Glykolyse zeigen wir in diesem Protokoll, wie man einen systemischen und vollständigen Überblick über die glykolytischen Stoffwechselprozesse in den Zellen erhält und genauere und realistischere Ergebnisse liefert. Um mehrere glykolytische Phänotypen messen zu können, bieten wir eine einfache, sensitive, DNA-basierte Normalisierungsmethode zur Polarisationsbestimmung von BMDMs an. Die Kultivierung, Aktivierung/Polarisation und Identifizierung des Phänotyps und des Stoffwechselzustands der BMDMs sind entscheidende Techniken, die bei der Untersuchung vieler verschiedener Arten von Krankheiten helfen können.

In dieser Arbeit polarisierten wir die naiven M0-Makrophagen zu M1-ähnlichen und M2-ähnlichen Makrophagen mit LPS bzw. IL4 und maßen einen umfassenden Satz glykolytischer Parameter in BMDMs in Echtzeit und longitudinal über die Zeit, wobei wir extrazelluläre Flussanalysen und glykolytische Aktivatoren und Inhibitoren verwendeten.

Makrophagen sind eine der kritischsten Zellen des M1-ähnlichen angeborenen Immunsystems. Sie sind an der Beseitigung von Infektionskrankheiten, Phagozytose, Antigenpräsentation und Entzündungsregulation beteiligt². Darüber hinaus sind Makrophagen erforderlich, um andere Immunzellen über verschiedene Zytokine, die sie freisetzen, zu regulieren³. Es gibt ein großes Spektrum an Makrophagen-Phänotypen⁴. Abhängig von den Signalen, denen Makrophagen ausgesetzt sind, polarisieren sie in Richtung unterschiedlicher Entzündungs- und Stoffwechselzustände⁵. Makrophagen manifestieren metabolische Veränderungen bei verschiedenen Krankheiten, je nachdem, in welchem Gewebe sich die Makrophagen befinden⁶. Polarisierte Makrophagen haben die Fähigkeit, ihren glykolytischen Stoffwechsel, ihren Lipidstoffwechsel, ihren Aminosäurestoffwechsel und ihre mitochondriale oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) umzuprogrammieren oder ^{umzuschalten7,8}. Klassisch aktivierte M1-ähnliche Makrophagen und alternativ aktivierte M2-ähnliche Makrophagen sind die beiden am besten untersuchten Phänotypen von Makrophagen³. Nicht aktivierte ruhende Makrophagen werden als M0-Makrophagen bezeichnet. Die Polarisation von M0-Makrophagen in Richtung eines M1-ähnlichen Phänotyps kann durch Stimulation naiver BMDMs mit bakteriellen Lipopolysacchariden (LPS) induziert ^werden9. Der PI3K-AKT-mTOR-HIF1a-Signalweg kann in Makrophagen in Gegenwart von inflammatorischen Zytokinen, Interferon-gamma (IFN γ,) oder Tumornekrosefaktor (TNF)¹⁰ aktiviert werden. M1-ähnliche Makrophagen haben einen erhöhten Glykolysestoffwechsel, eine verringerte oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) und produzieren entzündliche Zytokine, die an Infektions- und Entzündungskrankheiten beteiligt sind⁸. Andererseits kann die Polarisation in Richtung des M2-ähnlichen Phänotyps durch Interleukin (IL)-4, über die JAK-STAT-, PPAR- und AMPK-Signalwege oder durch (IL)-13 und TGFβ-Signalwege induziert werden^11,12.

Im Gegensatz zu M1-ähnlichen Makrophagen haben M2-ähnliche Makrophagen eine verminderte Glykolyse und ein erhöhtes OXPHOS und sind an antiparasitären und gewebereparierenden Aktivitäten beteiligt ^8,13. BMDMs sind ein weit verbreitetes System zur Untersuchung von Makrophagen, die aus Knochenmarkstammzellen gewonnen werden. Glykolyse und OXPHOS sind die beiden führenden Energieproduktionswege in den Zellen¹⁴. Basierend auf ihrer Mikroumgebung können BMDMs sich für einen dieser Wege entscheiden. Wechseln Sie in einigen Fällen von einem zum anderen oder verwenden Sie beide Wege¹⁴. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf den Glykolysestoffwechsel in aktivierten proinflammatorischen Makrophagen. Wenn die Glukose im Zytoplasma in Pyruvat umgewandelt wird und dann Laktat wird, produzieren die Zellen Protonen im Medium, die eine Erhöhung der Versauerungsrate im umgebenden Medium von M1-ähnlichen Zellen verursachen⁵. Ein extrazellulärer Flussanalysator wurde verwendet, um die Versauerungsrate der Zellmedien zu messen. Die Ergebnisse werden als extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) oder als Protonenausflussrate angegeben.

Eine optimierte, schnelle und einfache Methode zum Zugriff auf die Glykolyseniveaus in polarisierten Makrophagen ist unerlässlich, um den glykolytischen Phänotyp, Metabolitenveränderungen und die Auswirkungen von Inhibitoren/Aktivatoren und Medikamenten auf die polarisierten Makrophagen zu bestimmen. Die in diesem Manuskript beschriebene Methode wurde optimiert, um Informationen über spezifische Glykolysefaktoren (Glykolyse, glykolytische Kapazität, glykolytische Reserve und nicht-glykolytische Ansäuerung) sowie über die metabolische Reprogrammierung des glykolytischen Stoffwechsels zu erhalten. Der in dieser Studie verwendete Inhibitor (2DG) zielt explizit auf den Glykolyseweg ab.

Dieses optimierte Protokoll wurde auf der Grundlage der Kombination eines veröffentlichten Protokolls¹⁶, der extrazellulären Flussanalyse von glykolytischen Assays in den Benutzerhandbüchern des Herstellers und der direkten Kommunikation mit den Forschungs- und Entwicklungswissenschaftlern des Herstellers modifiziert und verbessert.

Die Mäuse wurden gemäß den Richtlinien der Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) und der American Association for Laboratory Animal Science (AALAS) und unter Verwendung von Protokollen, die vom Texas A&M University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt wurden, auf humane Weise getötet.

1. Knochenmarkentnahme von Mäusen und Kultivierung von BMDMs

1. Opfern Sie die Maus (6-10 Wochen alte C57Bl/6 Mäuse waren in diesem Protokoll) und legen Sie sie auf die Bauchseite, schneiden Sie die Haut und die Bauchfellschicht ab und schälen Sie vorsichtig die Beine ab.
   HINWEIS: Verwenden Sie die CO₂ -Gaseinwirkung, um die Maus einzuschläfern.
2. Trennen Sie beide Hinterbeine von der Hüfte abwärts und achten Sie darauf, den Knochen nicht zu schneiden.
3. Legen Sie das gesamte Bein in ein leeres konisches 50-ml-Röhrchen (mit den Füßen nach oben, um es später leicht herausziehen zu können) auf Eis und fahren Sie mit der Entnahme beider Beine aus der Maus fort.

2. Freilegung des Oberschenkelknochens

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einer Biosicherheitswerkbank durch.

1. Entnehmen Sie den Oberschenkelknochen, indem Sie die Tibia von jedem Bein abschneiden und so viel Gewebe wie möglich um den Oberschenkelknochen herum mit einer Schere und Laborpapier entfernen.
2. Legen Sie entnommene, "gereinigte" Oberschenkelknochen in eine 10 cm große Platte, die ein Stück Laborpapier enthält, das mit Gewebekulturmedium (TC) oder PBS getränkt ist. Lege sie auf Eis.
3. Fahren Sie mit der Entnahme von Femuren fort und entfernen Sie Gewebe aus allen Femuren, bevor Sie mit der Spülphase fortfahren (Abbildung 1A).

3. Mark-Spülung

1. Um das Knochenmark aus den Oberschenkelknochen zu spülen, verwenden Sie eine 3-ml-Spritze, die mit TC-Medium oder PBS gefüllt ist, mit einer 23G-Nadel. Füllen Sie die Spritze, bevor Sie das Knochenmark freilegen.
2. Lege das Knochenmark mit einer Schere frei, indem du das Ende des Oberschenkelknochens an beiden Epiphysen durchschneidest.
3. Führen Sie die Nadelspitze in den Oberschenkelknochen ein und spülen Sie das Mark vorsichtig in eine 10 cm dicke Schale.
4. Führen Sie die Nadel durch die gesamte Länge des Oberschenkelknochens und spülen Sie, bis die Knochenfarbe weiß wird. Normalerweise kann das meiste Knochenmark mit 2-3 ml Medium ausgespült werden.
5. Spülen Sie alle Oberschenkelknochen und das Knochenmark des Pools in der Schale. Verwende eine Nadel, um sichtbare Klumpen aufzubrechen. Das Mark in ein konisches 50-ml-Röhrchen abseihen (Abbildung 1A).

4. Erythrozyten-Lyse

1. Mark bei 190 x g für 10 min schleudern. Aspirieren Sie den Überstand.
2. Resuspendieren Sie das Pellet mit einer Pipette in 4 ml ACK-Lysepuffer. Lassen Sie den RBC-Lysepuffer 5 Minuten lang bei Raumtemperatur einwirken.
3. Geben Sie 4 mL TC-Medium RPMI-C 10% (RPMI 1640-GlutaMAX), ergänzt mit 2-Mercaptoethanol, Gentamicin, Streptomycin und 10% FCS, in die Knochenmarksuspension und schleudern Sie bei 1300 x g für 10 min.
4. Erneut abseihen, um Erythrozytenablagerungen zu entfernen, und zum Zählen in einem kleinen Volumen von RPMI-C 10 % wieder suspendieren.
5. Zählen Sie Zellen mit einem Zellzähler (Abbildung 1B). Ein Vi-Cell Counter wurde verwendet, um die Anzahl und Lebensfähigkeit der Zellen in der Suspension zu bestimmen.

5. Anrichten und Kultur

1. Geben Sie 10 ml RPMI-C 10% + 10 ng/ml m-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor, ein essentieller Regulator der Proliferation, Differenzierung und des Überlebens von Monozyten/Makrophagen) zu so vielen 10-cm-Platten wie gewünscht.
2. Fügen Sie ein entsprechendes Volumen an gezählten Zellen hinzu, so dass jede 10-cm-Platte 1 x 10⁶ Zellen enthält. Legen Sie die Platten in einen 37 °C heißen Inkubator (definiert als Tag 0).
3. Geben Sie an Tag 3 vorsichtig 5 ml frisches RPMI-C 10% + 10 ng/mL M-CSF auf jede Platte.
   HINWEIS: An Tag 7 sollten BMDMs für den Test bereit sein (Abbildung 1C).

6. Ernte von Tellern

1. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um zu bestätigen, dass die meisten Zellen an den Platten haften.
2. Sanftes Ansaugen von Medien. Fügen Sie dann 3 mL PBS hinzu und schwenken Sie die Platte vorsichtig. Aspirieren Sie diese Vertiefung, um alle verbleibenden nicht adhärenten Zellen zu entfernen.
3. Geben Sie 7-10 ml kaltes PBS in die Platte, waschen Sie mit einer P1000-Pipette den Boden der Platten und ernten Sie alle verbleibenden Zellen in ein Sammelröhrchen.
   HINWEIS: Bewahren Sie die Röhrchen auf Eis auf, da Makrophagen sehr fest haften und an der Innenseite der Röhrchen haften. Würden die Zellen kalt bleiben, würden sie weniger fest haften.
4. Zentrifuge-, Zähl- und Plattenzellen für Experimente (Abbildung 1D). Mit Hilfe der Durchflusszytometrie sollten die resultierenden Zellen zu >95 % positiv für CD11b und F4/80 sein. (Die Makrophagenpolarisation wurde durch Färbung mit M1-ähnlichen Markern von CD38, TNF-a und MCP-1 und M2-ähnlichen Markern von CD206 bestimmt.
   HINWEIS: Führen Sie die Schritte 6.1-6.3 in der Biosicherheitswerkbank und Schritt 6.4 auf dem Labortisch durch. Behalten Sie während des gesamten Verfahrens aseptische Techniken bei.

Abbildung 1: Grafischer Arbeitsablauf der Knochenmarkkultur von Mäusen mit BM-abgeleiteten Makrophagen. (A) Beinentnahme, Femur-Exposition und Knochenmarkspülung; (b) Erythrozyten-Lyse; (C) Beschichtung und Kultur; (D) Zellernte aus den Platten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

7. Am Tag vor dem Metabolic Flux Analyzer Assay: Aussaat und Polarisation der Zellen für den glykolytischen Test

1. Erwärmen Sie den Metabolic Flux Analyzer auf 37 °C, indem Sie das Gerät einschalten.
2. Hydratisieren Sie eine Kartusche durch Zugabe von 200 μl einer kalibrierten Lösung und inkubieren Sie die Kartusche über Nacht in einem Nicht-CO₂ -Inkubator (Abbildung 2A). Die Feuchtigkeit des Nicht-CO₂ -Inkubators ist für die Hydratation der Kartusche nicht wichtig.
   1. Tauchen Sie die Platte eine Stunde vor dem Experiment einige Male auf und ab, um Luftblasen zu entfernen.
3. Entwerfen Sie die Plattenkarte in der Software im Standard-Glykolyse-Stresstest – akute Injektion, indem Sie den Anweisungen des Tests folgen.
   1. Klicken Sie auf das Software-Symbol und dann auf Glykolyse-Stress-akuter Injektionstest. Generieren Sie auf dem Symbol für die Gruppendefinition Gruppennamen.
4. Es gibt fünf Messzyklen mit einer Dauer von 18 Minuten und vier Injektionen. Ändern Sie die Injektion von Port A auf Glukose, Port B auf Oligomycin, Port C auf Rotenon und Antimycin A (Rot/AA) und Port D auf 2DG.
5. Resuspendieren Sie die Zellen in RPMI-C 10% Medium und säen Sie 50k Zellen pro Well, mit Ausnahme der vier Ränder der Platte (A1, A12, H1 und H12; Geben Sie nur Medien hinzu, keine Zellen) in einer Mikroplatte mit Metabolic Flux Analyzer auf ein Endvolumen von 100 μl. Normalerweise sind mindestens 40.000 Zellen erforderlich, um diesen Assay durchzuführen.
6. Lassen Sie die Zellen 45 Minuten bei Raumtemperatur ruhen, um den Kanteneffekt der Zellen zu vermeiden. Der Kanteneffekt tritt auf, wenn das Medium um den Umfang der Platte herum teilweise verdampft, was zu Volumen- und Konzentrationsänderungen führt und die Lebensfähigkeit der Zellen verringert.
7. Fügen Sie 10 ng/ml LPS hinzu, um die naiven Makrophagen in Richtung M1-ähnlicher Zellen zu polarisieren, und fügen Sie 20 ng/ml IL-4 hinzu, um sie in Richtung M2-ähnlicher Zellen zu polarisieren. Verwenden Sie mindestens 3 bis 6 Wells pro Bedingung (Abbildung 2B).
8. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop und legen Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO₂ in einen Inkubator.

Abbildung 2: Grafische Demonstration der Aussaat und Polarisation der Zellen. (A) Einrichtung des extrazellulären Flussanalysators und Kartuschenhydratation; (B) Polarisation der Zellen und Inkubation über Nacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

8. Tag des Assays: Herstellung von XF Medium und Verbindung

1. Ergänzen Sie 100 ml XF RPMI (pH 7,4) Testmedium mit 2 mM Glutamin.
2. Filtersterilisieren Sie die Medien mit einem 0,2 μm Vakuumfiltersystem.
3. Legen Sie das Testmedium für 20 Minuten in ein 37 ^°C heißes Wasserbad.
4. Nehmen Sie die plattierten Zellen aus dem 37 °C und 5 % CO₂ -Inkubator. Waschen Sie die Zellen zweimal mit Assay-Medien und ersetzen Sie das vorherige Medium durch Assay-Medien bis zum endgültigen Volumen von 180 μl.
5. Stellen Sie mit einem Mikroskop sicher, dass alle Vertiefungen konfluente Zellen aufweisen, und markieren Sie alle Vertiefungen, die vom Pipettieren Kratzer aufweisen. Wenn Kratzer vorhanden sind, entfernen Sie diese Platte, bevor Sie sie analysieren.
6. Stellen Sie die zellhaltige Platte für 45 Minuten in einen Nicht-CO₂ -Inkubator (Abbildung 3A).
7. Verwendung der Verbindungen und des Assay-Mediums zur Herstellung von Stammlösungen von Glucose (100 mM), Oligomycin (100 μM), Rot/AA (50 μM) und 2DG (500 mM) (Tabelle 1).
8. Stellen Sie eine 10-fache Injektionsmischung jeder Verbindung unter Verwendung von Testmedien her (Tabelle 2).

Tabelle 1. Injektions-Bestände

Tabelle 2. Konzentrationen der abschließenden Injektion

9. Tag des Assays: Durchführung des akuten glykolytischen Tests an polarisierten Makrophagen

1. Öffnen Sie die gespeicherte Vorlage für den Glykolyse-Stress-Assay (akute Injektion) aus der Software. Der standardmäßige akute Glyko-Stresstest hat eine 3-minütige Mischung und Messung vor jeder Injektion.
2. Überprüfen Sie die Vorlage und die Assay-Details, und wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Ausführen und folgen Sie den Anweisungen des Standard-Assays. Alle Parameter können jedoch angepasst werden.
3. Nehmen Sie die Sensorkassette aus dem Nicht-CO₂ -Inkubator, entfernen Sie den Deckel und setzen Sie das Gerät so ein, dass die Vertiefung A1 der Kartuschenplatte in die obere linke Ecke der Einschubplatte des Geräts fällt. In der Regel dauert die Kalibrierung zwischen 20 und 45 Minuten.
4. Nach Abschluss der Kalibrierung wirft das Gerät die Platte mit der Kalibrierungslösung aus und hält die Sensorpatrone. Entfernen Sie das Kalibrant, das die Platte enthält.
5. Nehmen Sie die Zellplatte aus dem Nicht-CO₂ -Inkubator, entfernen Sie den Plattendeckel und setzen Sie sie in die Maschine ein. Klicken Sie auf Ausführen (Abbildung 3B).
6. Wenn der Assay abgeschlossen ist, wirft das Gerät die Zellplatte und die Sensorpatrone aus.
7. Nehmen Sie das Medium von der Platte und frieren Sie es zur weiteren Normalisierung bei -20 °C ein.
8. Verwenden Sie das kommerzielle Zellproliferations-Assay-Kit (z. B. CyQUANT) zur Normalisierung der Zellen.
9. Fügen Sie 1 ml Verbindung B oder Lysepuffer zu 19 ml nukleasefreiem destilliertem Wasser hinzu.
10. Geben Sie 100 μl der Arbeitslösung der Verbindung A oder GR zu der oben genannten Lösung.
11. Stellen Sie sicher, dass die Zellen in der Platte aufgetaut sind, und geben Sie dann 200 μl der Lösung in jede Vertiefung.
12. 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
13. Messen Sie die Fluoreszenz in 480 nm Anregungs- und 520 nm Emissionswellenlängen mit einem Plattenleser.
14. Normalisieren Sie die Zellen auf dem Normalisierungsfeld der Software.
15. Normalisieren Sie Zellen basierend auf der Zellzahl naiver Makrophagen (Abbildung 3C). Betrachten Sie den Durchschnitt der naiven Makrophagen als 1 (indem Sie die Zellzahl jeder Vertiefung durch die durchschnittliche Zellzahl der naiven Makrophagen dividieren) und wenden Sie sie auf alle Makrophagen an.

Abbildung 3: Tag des Assays: Vorbereitung des Mediums und der Verbindungen und Durchführung des Assays. (A) Vorbereitung der Zellen für den Assay; (B) Vorbereitung, Kalibrierung und Durchführung des Assays; (C) Normalisierung und Datenanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Glykolyse und mitochondriale oxidative Phosphorylierung sind die beiden wichtigsten ATP-Produktionswege in den Zellen (Abbildung 4A). Einige Zellen haben die Fähigkeit, zwischen diesen beiden Wegen zu wechseln, um ihren Energiebedarf zu decken. Die Umwandlung von Glukose in Pyruvat im Zytoplasma wird als Glykolyse bezeichnet. Pyruvat hat zwei Schicksale; Es wird entweder in Laktat umgewandelt oder durch den TCA-Zyklus und schließlich durch die Elektronentransportkette (ETC) weiter verstoffwechselt, um mehr ATP zu produzieren. Um das beste Verständnis der glykolytischen Parameter von Zellen zu erhalten, minimieren wir die OXPHOS-Signalwege durch den Einsatz von Oligomycin, einem Inhibitor der mitochondrialen ATP-Synthase. Wir injizieren auch Rot/AA, um die ETC vollständig abzuschalten, um die maximale glykolytische Kapazität und die kompensatorische Glykolyse in der Zelle zu beurteilen (Abbildung 4A). Glukose ist der Hauptbrennstoff der Glykolyse. Da das XF-Testmedium keine Glukose oder Glutamin enthält, sind die ersten drei Messungen im Assay ein Indikator für die nicht-glykolytische Ansäuerungsrate (Abbildung 4B, C), die auf eine Ansäuerung hinweist, aber nicht mit der Umwandlung von Glukose in Laktat zusammenhängt. Nach Injektion von Glukose aus Port A sind erhöhte ECAR-Spiegel Indikatoren für die Glykolyseraten (Messungen 4,5 und 6). Als nächstes wird durch Injektion von Oligomycin aus Port B und Injektion von Rot/AA aus Port C die ETC gehemmt, und erhöhte Mengen an ECAR sind ein Indikator für die glykolytische Kapazität und die kompensatorischen Glykolyseraten der Zellen (Abbildung 4B, C). Die kompensatorischen Glykolyseraten von BMDMs zeigen die Fähigkeit des zellulären Energiemanagements unter mitochondrialen Stressbedingungen. Mit anderen Worten, dieser Parameter zeigt die Kompensation des Energiebedarfs an, wenn die mitochondriale Atmung gehemmt wird. Die letzte Injektion ist 2 Desoxyglucose oder 2DG aus Port D, der ein kompetitiver Inhibitor der Glukose ist.

In Abbildung 4B,C besteht eine alternative Berechnung, insbesondere wenn es große Fehler zwischen 3 Messungen gibt, darin, dass man den letzten Datenpunkt vor jeder Injektion messen und unnötige Fehler und Variationen in den Daten vermeiden kann.

Abbildung 4: Energieproduktion in der Zelle und glykolytische Parameter. (A) Schematische Darstellung der beiden wichtigsten Energiegewinnungswege in der Zelle; Glykolyse (links) und mitochondriale oxidative Phosphorylierung (rechts). Glykolyse ist die Umwandlung von Glukose in Pyruvat. Der XF-Analysator kann die Protonen, die durch Umwandlung von Pyruvat in Laktat erzeugt werden, als ECAR-Spiegel (mpH/min) nachweisen. Die Hemmung der ATP-Synthase, gefolgt von der Hemmung der Komplexe I und II, der mitochondrialen Elektronentransportkette, eliminiert die ATP-Produktion und den Protonenausfluss durch OCR. (B) Berechnung der glykolytischen Parameter. (C) Glykolytische Funktionsparameter nach jeder Injektion der Verbindung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Im Allgemeinen haben polarisierte Makrophagen im Vergleich zu naiven M0-Makrophagen mehr glykolytische Aktivitäten. LPS-induzierte M1-ähnliche Makrophagen besitzen die höchste glykolytische Aktivität. Obwohl polarisierte Makrophagen deutlichere Trennungen in ihrer OCR-Reserve-Atmungskapazität aufweisen (16), was hier nicht gezeigt wurde, ist ihr glykolytischer Metabolismus auch vollständig unterscheidbar. Es ist wichtig zu beachten, dass ein Anstieg des ECAR in LPS-induzierten M1-ähnlichen polarisierten BMDMs kein eindeutiges Merkmal für andere Arten von M1-ähnlichen polarisierten Makrophagen (wie LPS + INF-γ oder PAMP-induzierte M1-ähnliche Makrophagen) ist, und sie können das ECAR ohne glykolytischen Stress nicht erhöhen oder verändern. Erwartungsgemäß zeigten polarisierte Makrophagen in den ersten drei Messungen, die der Indikator für die nicht-glykolytische Aktivität ist, keinen signifikanten Unterschied, da die Medien keine Quellen für Glukose oder Pyruvat aufweisen (Abbildung 5). Nach Injektion von Glukose weisen polarisierte BMDMs auf ein höheres Glykolyseniveau hin als naive BMDMs, und M1-ähnliche BMDMs weisen im Vergleich zu M0 und M1-ähnlichen BMDMs die höchsten Glykolyseniveaus auf.

Typischerweise ist der glykolytische Metabolismus der bevorzugte ATP-Produktionsweg, der von M1-ähnlichen Makrophagen verwendet wird, und OXPHOS ist der Haupt-ATP-Produktionsweg für M2-ähnliche Makrophagen. Nach der Injektion von Oligomycin wird der ATP-Synthase-Komplex in der mitochondrialen Elektronentransportkette von BMDMs abgeschaltet; Daher werden die Zellen beginnen, sich auf die Glykolyse zu verlassen, um ihren Energiebedarf zu decken. Da Glukose in den Medien vorhanden ist, wird die glykolytische Kapazität der polarisierten BMDMs vergleichbar sein. Auch hier haben LPS-induzierte M1-ähnliche BMDMs die höchste glykolytische Kapazität. M2-like und M0 haben jeweils geringere glykolytische Kapazitäten (Abbildung 5). Die Injektion von Rot/AA hemmt den Komplex I und III der mitochondrialen ETC und schaltet das OXPHOS vollständig ab, und es kommt zu einem etwas höheren Anstieg der ECAR-Spiegel, was ein Indikator für eine kompensatorische Glykolyse ist. Auch hier weisen M1-ähnliche BMDMs in diesem Schritt die höchsten ECAR-Niveaus auf. schließlich schaltet 2DG, ein kompetitiver Glukoseinhibitor und Negativkontrolle für die Glykolyse, den Glykolyseweg vollständig ab.

Abbildung 5: Glykolytische Funktionen von naiven M0- und polarisierten M1-ähnlichen (LPS-induzierten) und M2-ähnlichen (IL4-induzierten) BMDMs. Glykolytische Parameter polarisierter Makrophagen, angegeben als ECAR (mpH/min). (A) Nicht-glykolytische Ansäuerungsrate, Glykolyse, glykolytische Kapazität und kompensatorische Glykolyse als ECAR (mpH/min) in M0-, M1-ähnlichen und M2-ähnlichen BMDMs. Die Injektionen der Ports sind wie folgt: → Anschluss A: Glukose, Anschluss B: Oligomycin, Anschluss C: Rotenon plus Antimycin A und Anschluss D: 2 Desoxyglukose (B) Balkendiagramme jedes Parameters für M0-, M1-ähnliche und M2-ähnliche BMDMs. Die gezeigten Daten stammen aus 4-6 Kulturvertiefungen pro Experiment. Die Messungen basieren auf Mittelwerten + SEM. Die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen basiert auf einer unidirektionalen ANOVA mit dem Tukey-Mehrfachvergleichstest bei "*" p < 0,05, Signifikanz bei "**" p < 0,01, Signifikanz bei "***" p < 0,001, Signifikanz bei "****" p < 0,0001. Die Fehlerbalken werden aus der Standardabweichung abgeleitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Wie bereits erwähnt, kann das extrazelluläre Flussanalysator Echtzeitinformationen über zwei wichtige Energieerzeugungswege der Zellen liefern, indem es die OCR (Sauerstoffverbrauchsrate), einen Indikator für die mitochondriale OXPHOS-Aktivität, und ECAR (extrazelluläre Ansäuerungsrate), die ein Indikator für die Glykolyse ist, misst. Makrophagen können beide Wege nutzen, abhängig von ihrer Mikroumgebung. Sie können auch ihre Energieerzeugungspfade umschalten^17,18. Das Verständnis der energetischen Zustände der Makrophagen und ihrer Reaktionen auf verschiedene Medikamente, Zytokine, Inhibitoren, Aktivatoren usw. wird ein besseres Verständnis der Stoffwechselzustände dieser Zellen ermöglichen. Da die Glykolyse einer der kritischsten Signalwege ist, die in M1-ähnlichen Makrophagentypen aktiviert werden, können Echtzeit-Glykolyseinformationen dazu beitragen, die Veränderungen von M1-ähnlichen polarisierten BMDMs unter verschiedenen In-vitro-Bedingungen zu verfolgen¹⁹. Die extrazelluläre Flussanalyse des ATP-Echtzeit-Rate-Assays wird als eine Möglichkeit zur Beurteilung der ATP-Produktion der polarisierten BMDMs^{hoch angesehen 20}. Das hierin vorgestellte Protokoll bietet technische Details und Ansätze mit einer visuellen Demonstration des Arbeitsablaufs, um als umfassendes Protokoll zu dienen, das an experimentelle Bedürfnisse angepasst werden kann.

Dieser Assay liefert genaue Messungen der glykolytischen Spiegel für basale Bedingungen und kompensatorische Glykolyse nach mitochondrialer Hemmung. Es ist wichtig zu beachten, dass ein Teil der Versauerung in extrazellulären Medien eine mitochondriale Quelle haben kann²¹. Der Krebszyklus oder TCA-Zyklus produziert CO₂ , das das Medium durch seine Reaktion mit Wassermolekülen ansäuern kann²². Wenn die mitochondriale Aktivität gehemmt wird, sind die Versauerungsraten Indikatoren für die Laktatakkumulation in den Medien. Der Vorteil des glykolytischen Stresstests besteht in der Injektion von Glukose in ein Medium, das keine Glukose- oder Pyruvatquellen enthält, um die Glykolysespiegel vor und nach der Behandlung von Glukose in den Medien zu beurteilen.

Auf der anderen Seite liefert der Assay der glykolytischen Rate spezifische Informationen über die verschiedenen Quellen der Glykolyse, indem er die mitochondriale Aktivität blockiert. Mit anderen Worten, der glykolytische Protonenausfluss kann berechnet werden, indem der OXPHOS-Protonenausfluss vom Gesamtprotonenausfluss subtrahiert wird. In diesem Protokoll kombinierten wir glykolytische Assays in einem Assay und maximierten die glykolytischen Daten, um Ergebnisse der Glykolyse, der glykolytischen Kapazität, der glykolytischen Reserve, der kompensatorischen Glykolyse und der nicht-glykolytischen Ansäuerung zu erhalten. Diese Parameter ermöglichen ein besseres Verständnis der Stoffwechselzustände und des glykolytischen Phänotyps der Zellen. Mit einer optimierten, schnellen und einfachen Normalisierungsmethode wäre es möglich, genauere Informationen über den glykolytischen Stoffwechsel und die metabolische Reprogrammierung zu erhalten 21,22,23.

Es ist wichtig zu beachten, dass sich die Bedeutung der glykolytischen Reserve im neuen kombinierten System zwar nicht ändert, das Berechnungsschema in der Methode jedoch leicht geändert wurde. Im kombinierten System (Abbildung 4B) wird die glykolytische Reserve durch durchschnittliche ECAR (10,11,12)-durchschnittliche ECAR (4,5,6) geschätzt. Bei nicht kombinierten Methoden wird die glykolytische Reserve jedoch nach der Formel für durchschnittliche ECAR (7,8,9)-durchschnittliche ECAR (4,5,6) berechnet. Beide Berechnungen liefern sehr ähnliche Ergebnisse und spiegeln die glykolytische Reserve wider.

Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass es verschiedene Metriken für extrazelluläre Versauerungen in extrazellulären Flussanalysatoren gibt. Die Ergebnisse der glykolytischen Assays in extrazellulären Flussanalysatoren können auf der Grundlage von ECAR (mpH/min), PPR (pmol H+/min) und PER (pmol H+/min) analysiert werden. Es gibt Vor- und Nachteile, aber im Allgemeinen ist ECAR die typischste Art und Weise, Daten zur extrazellulären Versauerung anzuzeigen.

Unser Labor untersucht die Rolle von Mikrobiota-Metaboliten auf Immunzellen. Da Makrophagen eine der Schlüsselkomponenten des Immunsystems bei chronischen Entzündungskrankheiten wie Atherosklerose sind 23,24,25, sind wir daran interessiert, die Rolle von Mikrobiom-Metaboliten auf die Polarisation von Makrophagen zu untersuchen, insbesondere von entzündlichen polarisierten Makrophagen, die durch verschiedene proatherogene Signale wie gesättigte Fettsäuren, modifizierte LDLs, und schädliche Metaboliten der Darmmikrobiota, die von der Darmmikrobiota abgeleitet oder abhängig sind. Wir bestätigen die Polarisation der BMDMs durch M1-ähnliche und M2-ähnliche Oberflächen- und intrazelluläre Marker mittels Durchflusszytometrie und qPCR. Wir betrachten die extrazellulären Flux-Assays als funktionelle Messwerte in den Studien. Wir führen ergänzende Studien durch, indem wir die Nicht-Echtzeit-Glykolysefaktoren mit einem Laktatassay messen.

LPS-induzierte M1-ähnliche Polarisation oder LPS + IFNγ-induzierte M1-ähnliche Polarisation sind die häufigste klassische M1-ähnliche Aktivierungsmethode in Makrophagen. Bei der M1-ähnlichen Polarisation erhöht die Zugabe von IFNγ zu LPS oder die Erhöhung der LPS-Konzentration die Verringerung der freien Atmungskapazität in der mitochondrialen Elektronentransportkette. Es ist bekannt, dass IFNγ einen M1-ähnlichen Phänotyp induziert, aber in der Regel reicht IFNγ allein nicht aus und erfordert zusätzliche TLRs-Agonisten, um den Phänotyp zu induzieren. Dies hängt jedoch von den Erkrankungen und der M1-ähnlichen Polarisierung in Bezug auf eine bestimmte Erkrankung ab. Zum Beispiel können IFNγ-induzierte M1-ähnliche Makrophagen kein NO und inflammatorische Zytokine ähnlich wie LPS oder LPS/IFNγ-induzierte Makrophagen produzieren²⁶.

Medikamente, die Makrophagen vor entzündlicher Polarisation schützen, haben das Potenzial, Atherosklerose zu verhindern und zu kontrollieren. Das Verständnis der Stoffwechselwege, der Energetik und der phänotypischen Eigenschaften der M1-Makrophagen ist unerlässlich, um die Rolle verschiedener endogener und exogener Arzneimittel zu untersuchen. Die Glykolyse ist der dominante Energieerzeugungsweg in M1-ähnlichen Makrophagen ^24,27.

Diese vereinfachte Studie konzentriert sich nur auf die glykolytischen Energiezustände der polarisierten BMDMs. Die in dieser Arbeit verwendeten Dosen basieren auf der Empfehlung des Herstellers und erleichtern die Nachvollziehbarkeit des Experiments erheblich. Außerdem sind die meisten der in dieser Studie verwendeten Verbindungen im Standardkit des Herstellers enthalten. Dies hilft, Zeit zu sparen und die Konsistenz der Experimente zu verbessern. Es ist wichtig zu wissen, dass geringfügige Unterschiede in der Dosis der Verbindungen, der Zellzahl und den Inkubationszeiten die Versuchsergebnisse beeinflussen können. Außerdem sollte jeder Experimentator eine Zelltitration, Dosis-Wirkungs-Analyse und kinetische Analyse für seinen speziellen Zelltyp und seine Bedingungen durchführen, um zu verstehen, wie sich diese Bedingungen auf dem extrazellulären Flussanalysator verhalten.

Es sollte beachtet werden, dass sich während des Medienwechsels, des Waschens und der Normalisierung einige Zellen durch Pipettieren oder Flüssigkeitsdruck lösen können. Die Konfluenz der Zellen ist unter dem Mikroskop immer nachweisbar. Diese Vertiefungen müssen aus der Studie ausgeschlossen werden, wenn sie Anzeichen von Kratzern oder Erschöpfung der Zellen aufweisen.

Wir verwenden 96-Well-Mikrotiterplatten mit einer minimalen Anzahl von Zellen pro Well, so dass Positiv- und Negativkontrollen sowie verschiedene Bedingungen in einer Platte getestet werden können. Somit ist dieser Assay sehr zeit- und kosteneffizient für die extrazelluläre Flussanalyse. Diese Studie wurde für BMDM optimiert, die sich von geweberesidenten Makrophagen, Peritonealmakrophagen und Makrophagenzelllinien unterscheiden.

Während wir uns in diesem Protokoll hauptsächlich auf die Anwendung der extrazellulären Flussanalyse bei der proinflammatorischen Glykolyse konzentriert haben, kann die extrazelluläre Flussanalyse auch zur Beurteilung von mitochondrialen Funktionsmerkmalen wie Gesamtatmung, basale mitochondriale Atmung, ATP-Produktion, Protonenleck, maximale Atmung und freie Atemkapazität verwendet werden. Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle bei der metabolischen Reprogrammierung von Makrophagen. Extrazelluläre Flussanalysatoren wurden verwendet, um mitochondrialen Stress und Fettsäureoxidation zu bewerten, indem die Sauerstoffverbrauchsrate der Zellen gemessen^{wurde 16}.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir hier ein umfassendes Protokoll für die Isolierung, Kultur, Polarisation und glykolytische Funktionsanalyse von BMDMs erstellt haben. Für alle Schritte wurden detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren und visuelle Demonstrationen bereitgestellt. Wir hoffen, dass dieses Protokoll den Forschern helfen wird, ihre Analysen zu rationalisieren und die glykolytische Funktion von BMDMs mit hoher Qualität und Effizienz zu bewerten.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir danken Frau Joanna Rocha für die redaktionelle Unterstützung. Die Arbeit wurde teilweise von den National Institutes of Health (NIH) R01DK118334 (an Dr. Sun und Alaniz) und (NIH) R01A11064Z (an Dr. Jayaraman und Alaniz) unterstützt.