Method Article
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Nous présentons ici un protocole optimisé à haut débit développé avec des réactifs de marquage de masse en tandem 16-plex, permettant le profilage quantitatif du protéome des échantillons biologiques. Le fractionnement de base du pH étendu et la LC-MS/MS haute résolution atténuent la compression du rapport et fournissent une couverture profonde du protéome.
Le marquage isobare en tandem de masse (TMT) est largement utilisé en protéomique en raison de sa grande capacité de multiplexage et de sa couverture profonde du protéome. Récemment, une méthode TMT 16-plex élargie a été introduite, ce qui augmente encore le débit des études protéomiques. Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole optimisé pour le profilage profond du protéome basé sur le TMT 16-plex, y compris la préparation d’échantillons de protéines, la digestion enzymatique, la réaction de marquage TMT, le fractionnement par chromatographie liquide en phase inverse (LC/LC) bidimensionnelle, la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) et le traitement des données informatiques. Les étapes cruciales du contrôle de la qualité et les améliorations du processus spécifiques à l’analyse TMT 16-plex sont mises en évidence. Ce processus multiplexé offre un outil puissant pour profiler une variété d’échantillons complexes tels que des cellules, des tissus et des échantillons cliniques. Plus de 10 000 protéines et modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, la méthylation, l’acétylation et l’ubiquitination dans des échantillons biologiques très complexes provenant d’un maximum de 16 échantillons différents peuvent être quantifiées en une seule expérience, ce qui constitue un outil puissant pour la recherche fondamentale et clinique.
Les développements rapides de la technologie de spectrométrie de masse ont permis d’obtenir une sensibilité élevée et une couverture protéomique profonde dans les applications de protéomique 1,2. Malgré ces développements, le multiplexage d’échantillons reste le goulot d’étranglement pour les chercheurs chargés de l’analyse d’une grande cohorte d’échantillons.
Les techniques de marquage isobare multiplexé sont largement utilisées pour la quantification relative à l’échelle du protéome de grands lots d’échantillons 3,4,5,6. La quantification basée sur les marqueurs de masse en tandem (TMT) est un choix populaire pour sa grande capacité de multiplexage 7,8. Les réactifs TMT ont été initialement lancés sous la forme d’un kit 6-plex capable de quantifier jusqu’à 6 échantillons simultanément9. Cette technologie a été étendue pour quantifier 10-11 échantillons10,11. Les réactifs TMTpro 16-plex récemment développés (appelés TMT16 ci-après) ont encore augmenté la capacité de multiplexage à 16 échantillons en une seule expérience12,13. Les réactifs TMT16 utilisent un groupe rapporteur à base de proline, tandis que le TMT 11-plex applique un groupe rapporteur dérivé de la diméthylpipéridine. Le TMT11 et le TMT16 utilisent tous deux le même groupe amine réactif, mais le groupe bilan massique du TMT16 est plus grand que celui du TMT11, ce qui permet à la combinaison de 8 isotopes stables C13 et N15 dans les ions rapporteurs d’obtenir 16 rapporteurs (Figure 1).
L’augmentation de la capacité de multiplexage fournit une plate-forme pour la conception d’expériences avec suffisamment de répétitions pour surmonter les défis statistiques14. De plus, les canaux supplémentaires dans le TMT 16-plex aident à réduire la quantité totale de matériel de départ par canal, ce qui peut aider au développement de la protéomique unicellulaire émergente15. La grande capacité de multiplexage sera également précieuse pour la quantification des modifications post-traductionnelles, qui nécessitent généralement de grandes quantités de matière première16,17.
Les flux de travail protéomiques utilisant la technologie TMT ont été rationalisés 18,19,20 et ont considérablement évolué au cours de la dernière décennie en termes de préparation d’échantillons, de séparation par chromatographie liquide, d’acquisition de données par spectrométrie de masse et d’analyse informatique 21,22,23,24,25,26. Notre précédent article donne un aperçu approfondi de la plate-forme TMT10-plex 27. Le protocole décrit ici présente une méthode détaillée et optimisée pour le TMT16, y compris l’extraction et la digestion des protéines, le marquage du TMT16, le regroupement et le dessalage des échantillons, le pH basique et le pH acide en phase inverse (RP) LC, la spectrométrie de masse haute résolution et le traitement des données (Figure 2). Le protocole met également en évidence les principales étapes de contrôle de la qualité qui ont été intégrées pour mener à bien une expérience de protéomique quantitative. Ce protocole peut être utilisé en routine pour identifier et quantifier plus de 10 000 protéines à haute reproductibilité, pour étudier les voies biologiques, les processus cellulaires et la progression de la maladie 20,28,29,30.
Les tissus humains pour l’étude ont été obtenus avec l’approbation du programme de don de cerveau et de corps de l’Institut de recherche sur la santé Banner Sun.
1. Extraction de protéines à partir de tissus et contrôle de la qualité
REMARQUE : Pour réduire l’impact de la collecte d’échantillons sur le protéome, il est crucial de collecter des échantillons en un minimum de temps à basse température si possible31. Ceci est particulièrement important lors de l’analyse des modifications post-traductionnelles car elles sont généralement labiles, par exemple, certains événements de phosphorylation n’ont que quelques secondes de demi-vie32,33.
2. Digestion des protéines en solution, réduction et alkylation des peptides, test d’efficacité de la digestion et dessalage des peptides
3. Marquage TMT16 des peptides, test d’efficacité de marquage, regroupement d’échantillons et dessalage des peptides marqués
4. Pré-fractionnement du pH LC de base hors ligne
5. Analyse du pH acide RPLC-MS/MS
6. Traitement des données
REMARQUE : L’analyse des données a été effectuée à l’aide d’une suite logicielle JUMP 37,38,39 comprenant un moteur de recherche de base de données hybride (basé sur des motifs et des étiquettes), un logiciel de filtrage qui contrôle le taux de fausses découvertes (FDR) des peptides et protéines identifiés, et un logiciel de quantification des ensembles de données TMT. Selon la situation de l’utilisateur, l’analyse des données peut être effectuée à l’aide d’autres programmes commerciaux ou disponibles gratuitement.
7. Validation des données MS
REMARQUE : Avant d’effectuer des expériences biologiques qui prennent beaucoup de temps, utilisez au moins une méthode de validation pour évaluer la qualité des données de la MS.
Le protocole du TMT16 nouvellement développé, y compris la réaction de marquage, le dessalage et les conditions LC-MS, a été systématiquement optimisé41. De plus, nous avons comparé directement les méthodes 11-plex et 16-plex en les utilisant pour analyser les mêmes échantillons humains de MA41. Après optimisation des paramètres clés du TMT16, les méthodes TMT11 et TMT16 produisent une couverture, une identification et une quantification similaires du protéome > 100 000 peptides dans > 10 000 protéines humaines.
Étant donné que les réactifs TMT16 sont plus hydrophobes que les réactifs TMT11, les peptides marqués au TMT16 sont susceptibles d’être plus hydrophobes que les peptides marqués au TMT11, ce qui peut expliquer le temps de rétention (RT) différent dans la RPLC. Ainsi, nous avons évalué l’impact du TMT16 sur le peptide RT par rapport au TMT11 en analysant le mélange peptidique marqué TMT11 et TMT16 à l’aide de LC-MS/MS. Nous avons constaté que le TMT16 a une influence significative sur la RT aux peptides d’hydrophobicité moyenne, mais a peu d’effet sur les peptides d’hydrophobicité extrêmement élevée ou faible. Par conséquent, les concentrations similaires de début et de fin du tampon B dans le gradient LC peuvent être utilisées pour différents peptides marqués au TMT.
Nous avons ensuite optimisé le gradient RPLC en ligne pour l’échantillon marqué TMT16. La pente du TMT16 est très similaire à celle du TMT11. Le pourcentage de la réserve tampon de début et de fin B est le même (p. ex., de 18 % à 45 %). Mais nous avons remarqué que le nombre de peptides identifiés dans le TMT16 a chuté rapidement à environ 40 % du tampon B en utilisant le même gradient que celui utilisé pour le TMT11. Ainsi, nous avons légèrement réduit le temps de la pente entre 40 % et 45 %. Nous avons également apporté des ajustements mineurs à ce gradient pour différentes fractions et différents échantillons. Après l’optimisation du gradient, les peptides identifiés ont été répartis uniformément dans tout le gradient (Figure 4A).
Afin de maximiser le nombre de protéines identifiées et quantifiées avec précision à l’aide de la méthode TMT16, nous avons optimisé l’énergie de collision normalisée (NCE) pour les échantillons marqués au TMT16 dans notre précédent rapport41. Différents NCE (de 20 % à 40 %) ont été testés sur le spectromètre de masse lors d’exécutions LC-MS/MS. En équilibrant le nombre d’identifications de protéines et l’intensité de l’ion rapporteur, une NCE de 30 à 32,5 % a été choisie comme énergie de collision HCD optimale à utiliser pour les échantillons marqués au TMT16.
La compression du rapport causée par les ions interférents co-élutés a été une limitation des techniques de marquage isobare pour la quantification des protéines. Une étude précédemment publiée utilisant la méthode TMT11 montre que la compression du rapport peut être presque éliminée par une pré-fractionnement étendue de la LC, des paramètres MS optimisés et des stratégies de correction des données post-MS37. Nous avons utilisé ces stratégies, y compris le fractionnement extensif pré-MS (40 fractions de pH LC basiques), l’application d’une fenêtre d’isolement étroite (1 m/z) dans le cadre de la MS et la correction de l’ion y1 dans les analyses du protéome TMT11 et TMT16 des mêmes échantillons. Après avoir examiné la courbe de corrélation du changement de plissement des protéines entre les ensembles de données TMT11 et TMT16, nous avons constaté que la pente était très proche de 1, indiquant que la compression du rapport dans TMT16 n’était pas visiblement plus élevée que celle dans TMT11 dans notre condition expérimentale41. Les résultats cohérents ont montré que la compression du rapport n’a pas de différence lorsque le niveau de multiplexage est passé de 11 à 1613,45. Ainsi, les stratégies précédemment publiées peuvent être utilisées pour atténuer la compression du rapport, améliorant ainsi considérablement la précision de la quantification 27,37,44,46.
Enfin, nous avons comparé le nombre de PSM, de peptides uniques et de protéines uniques quantifiés dans des échantillons marqués au TMT11 par rapport au TMT16 (Figure 4B). Les résultats montrent que les MSP des deux méthodes sont comparables ; cependant, les protéines et les peptides quantifiés sont légèrement plus faibles dans la méthode TMT16, ce qui est cohérent avec d’autres rapports12,13. Nos résultats indiquent que les améliorations apportées au procédé TMT16 ainsi que l’utilisation de paramètres LC-MS optimisés permettent un profilage protéomique profond à haut débit des échantillons biologiques.
Figure 1 : Structure du réactif TMT 16-plex. (A) La structure du réactif TMT 16-plex, le processus de marquage, le décalage de masse après marquage et la masse de l’ion rapporteur sont montrés. (B) Structures marquées par des isotopes lourds des ions rapporteurs des réactifs TMT16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Flux de travail du profilage du protéome par TMT-LC/LC-LC/MS 16-plex. Les protéines extraites de 16 échantillons de tissus biologiques ont été digérées et marquées avec 16 étiquettes TMT différentes. Les échantillons de 16 canaux sont regroupés de manière égale, et le mélange est fractionné et concaténé en 40 fractions par chromatographie liquide en phase inverse (RPLC) à pH basique hors ligne. Chaque fraction est analysée par RPLC acide couplé à une spectrométrie de masse à haute résolution. Les fichiers bruts MS/MS ont été traités. L’image du tissu cérébral est citée à partir de Medium.com avec quelques modifications. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Contrôle de la qualité des protéines. (A) Quantification de la protéine extraite du tissu sur un gel SDS court avec BSA comme norme. La courbe standard représente la concentration de BSA et l’intensité de la bande protéique colorée à Coomassie utilisées pour la quantification. (B) Gel SDS utilisé pour le dosage de la qualité des protéines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Résultats représentatifs. (A) Distribution peptidique dans les LC acides. Le gradient optimisé du tampon B après correction du volume mort est aligné dans le même graphique. (B) L’histogramme montre le nombre de PSM quantifiés, de peptides uniques et de protéines uniques dans les méthodes TMT11 et TMT16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
1ère (50 μl, utiliser 50 % dans le premier mélange) | 2ème (ajuster le mélange et économiser 10 %) | 3ème (réglage final) | |||||||||||
Canaux | Journalistes | Mélange Vol (μL) | Intensité (unités) | Conc. (unité/μL) | Intensité attendue (unités) | Vol ajouté (μL) | Vol total (μL) | Intensité (unités) | Conc. (unité/μL) | Intensité attendue (unités) | Vol ajouté (μL) | Vol total (μL) | Intensité (unités) |
1 | sig126 | 25 | 94.7 | 3.8 | 122.1 | 7.2 | 32.2 | 99.6 | 3.1 | 105.3 | 1.8 | 34.1 | 100 |
2 | sig127N | 25 | 83 | 3.3 | 122.1 | 11.8 | 36.8 | 101.1 | 2.7 | 105.3 | 1.5 | 38.3 | 98 |
3 | sig127C | 25 | 86 | 3.4 | 122.1 | 10.5 | 35.5 | 99.9 | 2.8 | 105.3 | 1.9 | 37.4 | 99.9 |
4 | sig128N | 25 | 103.9 | 4.2 | 122.1 | 4.4 | 29.4 | 102.1 | 3.5 | 105.3 | 0.9 | 30.3 | 97.2 |
5 | sig128C | 25 | 90.8 | 3.6 | 122.1 | 8.6 | 33.6 | 103.3 | 3.1 | 105.3 | 0.7 | 34.3 | 98.3 |
6 | sig129N | 25 | 82.8 | 3.3 | 122.1 | 11.9 | 36.9 | 99 | 2.7 | 105.3 | 2.4 | 39.3 | 98.7 |
7 | sig129C | 25 | 101.3 | 4.1 | 122.1 | 5.1 | 30.1 | 98.5 | 3.3 | 105.3 | 2.1 | 32.2 | 102.1 |
8 | sig130N | 25 | 98.9 | 4 | 122.1 | 5.9 | 30.9 | 100.1 | 3.2 | 105.3 | 1.6 | 32.5 | 99.7 |
9 | sig130C | 25 | 86.3 | 3.5 | 122.1 | 10.4 | 35.4 | 96 | 2.7 | 105.3 | 3.4 | 38.8 | 99.3 |
10 | sig131N | 25 | 87 | 3.5 | 122.1 | 10.1 | 35.1 | 95.3 | 2.7 | 105.3 | 3.7 | 38.8 | 101.5 |
11 | sig131C | 25 | 119.1 | 4.8 | 122.1 | 0.6 | 25.6 | 100.9 | 3.9 | 105.3 | 1.1 | 26.7 | 100.2 |
12 | sig132N | 25 | 86 | 3.4 | 122.1 | 10.5 | 35.5 | 95.3 | 2.7 | 105.3 | 3.7 | 39.2 | 99.6 |
13 | sig132C | 25 | 119.1 | 4.8 | 122.1 | 0.6 | 25.6 | 101.2 | 3.9 | 105.3 | 1 | 26.7 | 100 |
14 | sig133N | 25 | 116.3 | 4.7 | 122.1 | 1.3 | 26.3 | 99.9 | 3.8 | 105.3 | 1.4 | 27.7 | 100.9 |
15 | sig133C | 25 | 122.1 | 4.9 | 122.1 | 0 | 25 | 101 | 4 | 105.3 | 1.1 | 26.1 | 101.9 |
16 | sig134N | 25 | 121.3 | 4.9 | 122.1 | 0.2 | 25.2 | 105.3 | 4.2 | 105.3 | 0 | 25.2 | 101.3 |
Tableau 1 : Données représentatives montrant le processus de regroupement des échantillons à l’étape 3.3.
Un protocole optimisé pour le profilage profond du protéome basé sur TMT16 a été mis en œuvre avec succès dans des publications antérieures 12,13,41. Avec ce protocole actuel, plus de 10 000 protéines uniques provenant d’un maximum de 16 échantillons différents peuvent être quantifiées de manière routinière en une seule expérience avec une grande précision.
Pour obtenir des résultats de haute qualité, il est important de prêter attention aux étapes critiques tout au long du protocole. En plus de toutes les étapes de contrôle qualité abordées dans notre précédent article27, nous incluons des étapes essentielles supplémentaires spécifiques au processus TMT16. Ces étapes sont importantes pour assurer la réussite d’une expérience. Par exemple, les dérivés de la réaction TMT (par exemple, TMTpro-NHOH de la réaction d’extinction de l’hydroxylamine et TMTpro-OH de l’hydroxylation du TMT) sont détectés comme des ions monochargeables proéminents avant le dessalage par l’analyse LC-MS/MS. Il est essentiel de les retirer lors de l’étape de dessalage. Nous avons testé différentes conditions de dessalage et avons constaté que l’ajout de 5 % d’ACN dans le tampon de lavage régulier combiné à 10 volumes de lit de × pendant trois lavages efficaces éliminait efficacement les dérivés41. De plus, le TMT16 a une masse accrue par rapport au TMT11, donc la plage de balayage complète commence à partir d’un m/z plus élevé (450 au lieu de 410) pour les échantillons marqués au TMT16. De plus, comme l’énergie de collision optimale pour un peptide dépend de la masse à la charge et de l’état de charge de l’ionprécurseur 21, les peptides marqués avec différentes étiquettes de marquage chimique peuvent avoir des énergies de collision optimales différentes. Pour le TMT16, l’énergie de collision de 30 à 32,5 % est optimale pour le TMT16, qui est légèrement inférieur à celui du TMT11.
Le marquage isobare est une technique puissante qui offre une capacité de multiplexage élevée. Bien que d’autres techniques telles que SILAC (stable isotope marking by amino acids in cell culture)47 et le mark-free offrent des stratégies alternatives pour quantifier lesprotéines48, elles souffrent d’un faible débit. En théorie, le TMT16 peut quantifier les protéines de 16 échantillons biologiques différents. Cependant, il est beaucoup plus courant d’utiliser certains de ces canaux comme réplicats biologiques, ce qui fournit plus de puissance statistique et aide à générer des données fiables. L’utilisation de répétitions, voire de triplets, est très critique, en particulier dans les systèmes où le changement attendu de la concentration en protéines est minime. Il est important de comprendre la biologie du système avant de concevoir l’expérience afin d’inclure le nombre approprié de répétitions. Certains systèmes biologiques ne sont pas parfaitement adaptés à certaines des étapes de contrôle de la qualité de ce protocole. Le test du rapport de prémélange n’est pas utilisé lors de l’utilisation d’échantillons d’immunoprécipitation pour le protocole en raison du pourcentage élevé de protéines qui devraient changer. Dans ces cas, les résultats seraient faussés par le test de prémélange. Cela est également vrai dans les cas où l’expression protéique d’au moins 1 des 10 échantillons est susceptible de varier considérablement (vecteur vide, inhibition du protéasome, etc.). Il est également suggéré d’utiliser un canal TMT comme « référence interne » qui peut ensuite être utilisé pour combiner plusieurs lots d’expériences TMT1649.
Ce protocole peut être utilisé pour le profilage protéomique mondial à haut débit d’échantillons biologiques complexes, pour étudier les protéines exprimées de manière différentielle et les voies de signalisation cellulaire, et pour comprendre la biologie des maladies. De plus, avec de légères modifications du protocole, il peut être utilisé pour étudier les modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, l’ubiquitination, la méthylation et l’acétylation. L’adoption d’une approche intégrée combinant une analyse protéomique exhaustive à grande échelle avec d’autres pipelines -omiques tels que la génomique, la transcriptomique et la métabolomique peut fournir des informations permettant d’élargir la compréhension des systèmes biologiques complexes30,50.
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été partiellement soutenu par les National Institutes of Health (R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, RF1AG064909 et U54NS110435) et l’ALSAC (American Lebanese Syrian Associated Charities). L’analyse de la SEP a été réalisée au Centre de protéomique et de métabolomique du St. Jude Children’s Research Hospital, qui est partiellement soutenu par la subvention de soutien du NIH Cancer Center (P30CA021765). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Criterion TGX Precast Midi Protein Gel | Biorad | 5671035 | |
10X TGS (Tris/Glycine/SDS) Buffer | BioRad | 161-0772 | |
4–20% Criterion TGX Precast Midi Protein Gel | Biorad | 5671095 | |
50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
6 X SDS Sample Loading Buffer | Boston Bioproducts Inc | BP-111R | |
Ammonium Formate (NH4COOH) | Sigma | 70221-25G-F | |
Ammonium Hydroxide, 28% | Sigma | 338818-100ml | |
Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
C18 Ziptips | Harvard Apparatus | 74-4607 | Used for desalting |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
DMSO | Sigma | 41648 | |
Formic Acid | Sigma | 94318 | |
Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
Gel Code Blue Stain Reagent | Thermo | 24592 | |
Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
HPLC Grade Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
HPLC Grade Water | Burdick & Jackson | AH365-4 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
Lys-C | Wako | 125-05061 | |
Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
MassPrep BSA Digestion Standard | Waters | 186002329 | |
Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
Nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 | Used for desalting |
Sodium Deoxycholate | Sigma | 30970 | |
Speedvac | Thermo Scientific | SPD11V | |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Scientific | A44520 | |
Trifluoroacetic Acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
Trypsin | Promega | V511C | |
Ultra-micro Spin Column,C18 | Harvard apparatus | 74-7206 | Used for desalting |
Urea | Sigma | U5378 | |
Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | Used for basic pH LC |
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