Method Article
Ce protocole se concentre sur l'identification des protéines qui se lient aux phosphates inositol ou phosphoinositides. Il utilise la chromatographie d'affinité avec les phosphates d'inositol biotinylated ou les phosphoinositides qui sont immobilisés par l'intermédiaire de streptavidin à l'agarose ou des perles magnétiques. Les protéines de liaison du phosphate d'inositol ou du phosphoinositide sont identifiées par le ballonnement occidental ou la spectrométrie de masse.
Les phosphates inositol et les phosphoinositides régulent plusieurs processus cellulaires dans les eucaryotes, y compris l'expression de gène, le trafic de vésicule, la transduction de signal, le métabolisme, et le développement. Ces métabolites exercent cette activité réglementaire en se liant aux protéines, modifiant ainsi la conformation des protéines, l'activité catalytique et/ou les interactions. La méthode décrite ici utilise la chromatographie d'affinité couplée à la spectrométrie de masse ou au ballonnement occidental pour identifier les protéines qui interagissent avec les phosphates inositol ou les phosphoinositides. Les phosphates inositol ou phosphoinositides sont chimiquement étiquetés avec de la biotine, qui est ensuite capturée par streptavidinie conjuguée à des perles d'agarose ou magnétiques. Les protéines sont isolées par leur affinité de liaison au métabolite, puis élucées et identifiées par spectrométrie de masse ou ballonnement occidental. La méthode a un flux de travail simple qui est sensible, non radioactif, sans liposome, et personnalisable, soutenant l'analyse de l'interaction de protéine et de métabolite avec précision. Cette approche peut être utilisée dans des méthodes de spectrométrie de masse quantitative sans étiquette d'étiquette ou d'acide aminé pour identifier les interactions protéine-métabolite dans des échantillons biologiques complexes ou à l'aide de protéines purifiées. Ce protocole est optimisé pour l'analyse des protéines de Trypanosoma brucei, mais il peut être adapté aux parasites protozoaires, aux levures ou aux cellules mammifères connexes.
Les phosphates inositol (IP) et les phosphoinositides (IP) jouent un rôle central dans la biologie de l'eucaryote par la régulation des processus cellulaires tels que le contrôle de l'expression génique1,2,3, le trafic de vésicule 4, transduction de signal5,6, métabolisme7,8,9, et le développement8,10. La fonction de régulation de ces métabolites résulte de leur capacité à interagir avec les protéines et donc à réguler la fonction protéique. Lors de la liaison par les protéines, les IP et les IP peuvent modifier la conformation des protéines11, l'activité catalytique12, ou les interactions13 et donc affecter la fonction cellulaire. Les IP et les IP sont distribués dans plusieurs compartiments subcellulaires, tels que le noyau2,3,14,15, réticulum endoplasmique16,17, plasma membrane1 et cytosol18, soit associée aux protéines3,19 ou avec RNAs20.
Le clivage de l'IP associé à la membrane(4,5)P2 par la phospholipase C entraîne la libération d'Ins(1,4,5)P3, qui peut être phosphorylé ou déphosphorylé par des kinases IP et des phosphatases, respectivement. Les ADRESSEs IP sont des molécules solubles qui peuvent se lier aux protéines et exercer des fonctions de régulation. Par exemple, Ins(1,4,5)P3 dans le métazoan peut agir comme un deuxième messager en se liant aux récepteurs IP3, ce qui induit des changements conformationnels des récepteurs et donc la libération de Ca2 'des magasins intracellulaires11. Ins(1,3,4,5)P4 se lie au complexe histone deacetylase et régule l'assemblage complexe protéique et l'activité13. D'autres exemples de fonction réglementaire d'IPs incluent le contrôle de l'organisation de chromatine21,le transport d'ARN22,23, l'édition d'ARN24,et la transcription1,2,3 . En revanche, les PI sont souvent associés au recrutement de protéines à la membrane plasmatique ou aux membranes d'organites25. Cependant, une propriété émergente des PI est la capacité de s'associer avec des protéines dans un environnement non-membranaire3,15,19,26. C'est le cas du facteur stéroïdomique de récepteur nucléaire, dont la fonction de contrôle transcriptionnelle est réglée par PI(3,4,5)P319, et polymérase polyzymatique qui est réglée par PI nucléaire (4,5)P226. Un rôle réglementaire pour les IP et les IP a été montré dans de nombreux organismes, y compris la levure22,27, les cellules des mammifères19,23, Drosophila10 et les vers28. Le rôle de ces métabolites dans les trypanosomes, qui s'écartait tôt de la lignée eucaryote, est important. Ces métabolites jouent un rôle essentiel dans trypanosoma brucei contrôle transcriptionnel1,3, développement8, biogenèse organelle et le trafic protéique29,30 , 31 Ans, états-unis ( , 32, et sont également impliqués dans le contrôle du développement et de l'infection chez les pathogènes T. cruzi33,34,35,Toxoplasma36 et Plasmodium 5 Annonces , 37. Par conséquent, la compréhension du rôle des IP et des IP dans les trypanosomes peut aider à élucider une nouvelle fonction biologique pour ces molécules et à identifier de nouvelles cibles médicamenteuses.
La spécificité de la protéine et de la liaison IP ou PI dépend des domaines d'interaction des protéines et de l'état de phosphorylation de l'inositol13,38, bien que les interactions avec la partie lipidique des IP se produisent également19. La variété des IP et des IP et leurs kinases et phosphatases modifiantes fournit un mécanisme cellulaire flexible pour contrôler la fonction protéique qui est influencée par la disponibilité et l'abondance des métabolites, l'état de phosphorylation de l'inositol et les protéines affinité de l'interaction1,3,13,38. Bien que certains domaines protéiques soient bien caractérisés39,40,41, par exemple, domaine d'homologie pleckstrin42 et SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domaines43 ,44,45, certaines protéines interagissent avec les IP ou LES IP par des mécanismes qui restent inconnus. Par exemple, la protéine répresseur-activateur 1 (RAP1) de T. brucei n'a pas de domaines canoniques de liaison PI mais interagit avec PI(3,4,5)P3 et contrôle la transcription des gènes impliqués dans la variation antigénique3. Chromatographie d'affinité et analyse de spectrométrie de masse des protéines ip ou PI interagissant des cellules trypanosome, levure, ou mammifères ont identifié plusieurs protéines sans domaines IP- ou PI-contraignants connus8,46, 47. Les données suggèrent d'autres domaines protéiques non caractérisés qui se lient à ces métabolites. Par conséquent, l'identification des protéines qui interagissent avec les IP ou les IP peut révéler de nouveaux mécanismes d'interaction protéine-métabolite et de nouvelles fonctions de régulation cellulaire pour ces petites molécules.
La méthode décrite ici utilise la chromatographie d'affinité couplée au ballonnement occidental ou à la spectrométrie de masse pour identifier les protéines qui se lient aux IP ou aux IP. Il utilise des IP biotinylated ou IP qui sont soit reliés à la streptavidine conjuguée à des perles d'agarose ou alternativement, capturés par l'intermédiaire de perles magnétiques conjuguées par streptavidin (figure1). La méthode fournit un flux de travail simple qui est sensible, non radioactif, sans liposome et convient pour détecter la liaison des protéines des lysates cellulaires ou des protéines purifiées3 (Figure 2). La méthode peut être utilisée dans l'étiquette-libre8,46 ou couplé à la spectrométrie de masse quantitative étiquetée acide aminé47 pour identifier la propriété IP ou PI-liaison des protéines à partir d'échantillons biologiques complexes. Par conséquent, cette méthode est une alternative aux quelques méthodes disponibles pour étudier l'interaction des IP ou des IP avec les protéines cellulaires et aidera à comprendre la fonction réglementaire de ces métabolites chez les trypanosomes et peut-être d'autres eucaryotes.
1. Analyse des protéines liant IP ou PI par chromatographie d'affinité et ballonnement occidental
2. Analyse des protéines liant IP/PI par chromatographie d'affinité et spectrométrie de masse
Analyse de rap1 et PI(3,4,5)P3 interaction par chromatographie d'affinité et de ballonnement occidental
Cet exemple illustre l'application de cette méthode pour analyser la liaison des IP par RAP1 à partir du lysate de T. brucei ou par la protéine recombinante T. brucei RAP1. Lysates de T. brucei formes de circulation sanguine qui expriment hémagglutinine (HA) marqué RAP1 ont été utilisés dans les essais de liaison. RAP1 est une protéine impliquée dans le contrôle transcriptionnel des gènes de glycoprotéine de surface variable (VSG)3,48, qui codent pour les protéines de surface impliquées dans l'évasion immunitaire parasite par variation antigénique49. RAP1 interagit au sein d'un complexe protéique télomérique avec le phosphatidylinositol 5-phosphatase (PIP5Pase) enzyme3, qui fonctionne également dans le contrôle de la transcription du gène VSG1,3. RAP1 a un n-terminal cancer du sein 1 carboxyl-terminal (BRCT) domaine qui est suivie par un myeloblastose (myb) domaine de liaison de l'ADN et un C-terminal myb-like domaine3,48. Cependant, il manque de domaines de liaison PI canoniques. Des essais de liaison ont été exécutés avec des OPI qui ne sont pas phosphorylés ou qui sont phosphorylés à différentes positions de l'anneau d'inositol, et avec des perles d'agarose non conjuguées. L'analyse occidentale montre que RAP1 se lie de préférence aux PI (3,4,5)Perles De P3 (Figure 3A), mais qu'il lie aussi dans une moindre mesure à PI(4,5)P2-perles. Cependant, il ne s'est lié à aucun autre PI ou perles d'agarose. Puisque RAP1 fait partie d'un complexe multiprotéine3,son interaction avec quelques PI peut ne pas être directe et résulte ainsi de l'interaction de RAP1-HA avec d'autres protéines cellulaires qui se lient aux PIs.
Par conséquent, pour vérifier si RAP1 se lie directement aux PI, une protéine 6x-son RAP1 recombinante étiquetée En phase C a été exprimée et purifiée à l'homogénéité de E. coli3. La protéine a été utilisée dans les essais de liaison avec PI(3,4,5)P3-perles en présence de concentrations concurrentes de PI(3,4,5)P3 ou PI(4,5)P2. Le ballonnement occidental montre que l'augmentation des concentrations d'IP(3,4,5)P3, mais pas PI(4,5)P2 inhibe l'interaction du rRAP1 avec L'IP(3,4,5)P3 (figure 3B). En outre, l'ajout de T. brucei purifié enzyme PIP5Pase à la réaction restauréPI(3,4,5)P3-contraignant par rRAP1, qui est due à la déphosphorylation PIP5Pase de PI libre(3,4,5)P33 et indique donc que le modèle de phosphorylation de cette le métabolite est essentiel pour la liaison rRAP1. Par conséquent, rRAP1 interagit avec PI(3,4,5)P3 comme il le fait RAP1-HA de T. brucei lysates. De plus, les données montrent que la liaison du RAP1-HA du lysate à l'IP(4,5)P2 résulte probablement de l'interaction RAP1 avec d'autres protéines du complexe (p. ex. PIP5Pase)3. Les données illustrent la complémentarité des essais de liaison avec des lysates cellulaires et des protéines recombinantes. Il montre également l'utilité d'essais contraignants concurrentiels pour déterminer la spécificité des interactions entre les protéines et les PI.
Identification des protéines de liaison Ins(1,4,5)P3 par chromatographie d'affinité et spectrométrie de masse
Dans cet exemple, la chromatographie d'affinité suivie de la spectrométrie de masse a été employée pour identifier des protéines de T. brucei qui se lient à Ins(1,4,5)P3 ; par conséquent, l'expérience étudie les protéines potentielles Ins(1,4,5)P3 de liaison des formes de circulation sanguine de T. brucei. Le lysate de T. brucei a été incubé avec Des Ins(1,4,5)P3 conjugués à des perles d'agarose ou à des perles non conjuguées (utilisées comme contrôle), et les protéines liées ont été élucées avec le tampon d'échantillon de Laemmli. L'analyse SDS/PAGE montre l'enrichissement des protéines élucées à partir d'Ins(1,4,5)Perles P3 par rapport aux protéines élucées par les perles d'agarose témoins (figure 4A). Analyse de spectrométrie de masse des protéines élunées identifiées sur plus de 250 protéines, dont 84 ont été enrichies avec des perles Ins(1,4,5)P3 par rapport aux perles témoins (Figure 4B, changement de pli [FC] 2, p lt; 0,05). L'enrichissement des protéines liées à Ins(1,4,5)P3 par rapport aux perles témoins est en corrélation avec le signal protéique détecté par SDS/PAGE. Les données comprennent les protéines qui ont été validées pour lier Ins(1,4,5)P3 et les protéines dont les mécanismes de liaison à Ins(1,4,5)P3 sont inconnus8. En outre, le protéome de liaison Ins(1,4,5)P3 différait considérablement de celui d'Ins(1,3,4,5)P4 et d'autres PIs8, ce qui suggère que certaines de ces protéines reconnaissent la configuration spécifique du phosphate d'Ins(1,4,5)P3. Par conséquent, la biotine-étiquetée Ins(1,4,5)P3 peut être employée pour la chromatographie d'affinité couplée à la spectrométrie de masse pour identifier des protéines qui se lient à Ins(1,4,5)P3. L'approche peut être explorée pour identifier les protéines qui se lient à d'autres IP ou IP3,8,46,47.
Figure 1 : Réagents d'affinité pour les essais de liaison. (A) PI (3,4,5)P3 (en haut) et Ins(1,4,5)P3 (en bas) conjugués à la biotine à la position sn1 de l'inositol. Dans PI(3,4,5)P3, la biotine est conjuguée à la chaîne lipidique à la position sn1 de l'inositol, tandis que dans Ins(1,4,5)P3 la biotine est conjuguée au phosphate à la position sn1. (B) Ins(1,4,5)P3 est conjugué à la biotine et capturé par liaison à la streptavidine conjuguée aux perles (p. ex. aurrose ou perles magnétiques). Variations de ces réactifs à l'aide de liaisons synthétisées personnalisées qui remplacent la biotine sont également possibles46. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Le flux de travail des protocoles décrit les étapes de l'analyse de l'interaction d'affinité IP ou PI avec les protéines de T. brucei et la détection par (A) le ballonnement occidental ou (B) spectrométrie de masse. AC-WB, chromatographie d'affinité et ballonnement occidental ; AC-MS, chromatographie d'affinité et spectrométrie de masse. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Liaison de T. brucei RAP1 aux phosphoinositides. (A) Lysates de T. brucei (5,0 x 107 parasites) qui expriment LE RAP1 étiqueté HA pendant 2 h à 4 oC avec 50 OL de PI (chacune 1 ml de perles d'agarose contenant 10 nmol de PI conjugués) ou de perles d'agarose (Ag). La réaction de liaison a été lavée et éludée avec 2 x tampon d'échantillon de Laemmli et chauffée à 95 oC pendant 5 min. Les protéines ont été séparées en 4-20% SDS/PAGE, transférées à une membrane PVDF, et sondées avec des anticorps monoclonaux anti-HA (1:5,000, dilué dans 6% PBS-milk) suivi par l'anti-souris IgG-HRP (1:5,000, dilué dans 6% PBS-lait), et détecté par chemiluminescence. (B) Un g de rRAP1 a été incubé pendant 1 h à RT avec 50 L de PI (3,4,5)Perles de P3-agarose en présence ou en absence de 5 à 50 M dioctanoylglycerol (diC8) PI(3,4,5)P3, P3, 20 à 50 M diC8 PI(4,5)P2, ou 50 M diC8 PI(3,4,5)P3 et 250 ng PIP5Pase purifié de T. brucei formes de circulation sanguine3. La liaison a été analysée par le ballonnement occidental avec la souris anti-His HRP monoclonal des anticorps (1:2,000, dilué dans 6% PBS-milk) et développé par chemiluminescence. Ce chiffre a été modifié à partir de Cestari et coll.3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Analyse de la chromatographie d'affinité et de la spectrométrie de masse des protéines de T. brucei qui se lient à Ins(1,4,5)P3. (A) 10% SDS/PAGE analyse des protéines T. brucei qui se lient à Ins(1,4,5)P3-perles ou perles d'agarose. Lysates de 5,0 x 109 parasites ont été incubés à 4 oC pour 2 h avec 400 oL d'Ins(1,4,5)P3 conjugués à des perles d'agarose ou avec des perles d'agarose sans Ins(1,4,5)P3 [1 mL de perles contiennent 10 nmol d'Ins conjugués(1,4,5)P3]. La réaction de liaison a été lavée, éludée dans un tampon d'échantillon de 2 x Laemmli et bouillie pendant 5 min à 95 oC. Les protéines ont été séparées en 10% SDS/PAGE et tachées de taches Coomassie (Tableau des matériaux). Les pointes d'arrow montrent des protéines qui sont enrichies en Ins(1,4,5)Perles de P3 comparées aux perles d'agarose ; les cercles indiquent des protéines présentes dans les deux Ins(1,4,5)Perles de P3 et de perles d'agarose, et le support indique les protéines qui sont présentes dans les deux mais sont enrichies dans Ins(1,4,5)P3-perles comparées aux perles d'agarose. (B) L'intrigue ponctuelle montre les protéines identifiées par la spectrométrie de masse qui sont enrichies en Ins(1,4,5)Perles P3 par rapport aux perles d'agarose. Enrichissement défini par FC 'gt; 2 et p-valeur 'lt;0.05. Quatre répliques biologiques ont été utilisées pour les perles d'agarose AC-MS, et trois répliques biologiques pour les perles IP3 AC-MS. Le changement de pli des protéines identifiées dans les perles IP3 contre les perles d'agarose a été calculé à l'aide de l'intensité des spectres peptidiques à l'aide du MSstat50. Les résultats détaillés et la liste des peptides sont disponibles8. Les données brutes de spectrométrie de masse sont également disponibles avec l'identifiant PXD005907 par l'intermédiaire du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE. Ce chiffre a été modifié à partir de Cestari et coll.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
L'identification des protéines qui se lient aux IP ou aux IP est essentielle pour comprendre la fonction cellulaire de ces métabolites. La chromatographie d'affinité couplée à la tache occidentale ou à la spectrométrie de masse offre l'occasion d'identifier les protéines interagissant IP ou PI et donc d'obtenir des informations sur leur fonction réglementaire. IPs ou IP chimiquement marqués [p. ex., Ins(1,4,5)P3 chimiquement liés à la biotine] et reliés entre des perles d'agarose par l'intermédiaire de streptavidin ou capturés par des perles magnétiques de streptavidin permet l'isolement des protéines interagissant qui peuvent alors être identifiées par masse spectrométrie ou tache occidentale. Les protocoles décrits ici ont été utilisés pour identifier les protéines de T. brucei3,8 et les cellules de mammifères47 qui se lient à ces métabolites. Des variantes de l'approche qui utilise des étiquettes personnalisées (autres que la biotine) ont également été utilisées dans la levure46. Une considération importante à cette approche est l'utilisation de contrôles pour discriminer spécifiquement des interactions non spécifiques. Les perles non conjuguées sont un contrôle essentiel, mais des contrôles supplémentaires peuvent inclure des PI non phosphorylés ou des inositol conjugués à des perles3. Les IP ou IP avec différentes combinaisons de phosphate3,8 peuvent également être utilisés parce que la liaison de protéines à ces métabolites peut impliquer des domaines qui discriminent la configuration de phosphate de l'inositol38, 39,40,41. En outre, la complexité de l'échantillon peut affecter la sensibilité de l'approche, et donc la diminution de la complexité de l'échantillon par fractionnement de l'échantillon peut aider à la détection de protéines faibles en abondance dans la cellule. Il existe des protocoles bien établis pour la fractionnement cellulaire et l'isolement de la mitochondrie51, noyau52, glycosome53, et flagellum54,55 de trypanosomes. Notez que les tampons et les réactifs utilisés dans les fractionnements subcellulaires peuvent devoir être ajustés pour la compatibilité avec les tampons et les réactifs utilisés dans ce protocole. Notamment, l'identification des protéines qui se lient aux IP ou aux IP par chromatographie d'affinité comme indiqué ici dépend de l'affinité de protéine et de métabolite de l'interaction, et ainsi les protéines qui ont une affinité faible pour des IP ou des PI peuvent ne pas être facilement détectées.
L'analyse de l'interaction IP ou PI avec les protéines du lysate cellulaire peut également entraîner l'identification de protéines qui ne se lient pas directement à ces métabolites, mais dont l'interaction résulte d'une association de protéines en complexe avec d'autres protéines qui se lient aux IP ou DES PI. Cette caractéristique est illustrée dans la figure 3A, dans laquelle RAP1-HA de T. brucei lysate semble se lier à PI(3,4,5)P3-perles et PI(4,5)P2-perles. Cependant, les essais de liaison avec son rRAP1 marqué montrent que cette protéine se lie à PI(3,4,5)P3 et non PI(4,5)P23. Ceci est illustré dans la figure 3B, dans laquelle les essais concurrentiels montrent que l'IP gratuit (3,4,5)P3 mais pas gratuit PI(4,5)P2 concurrence pour rRAP1-son interaction avec PI(3,4,5)P3-perles. L'interaction apparente RAP1 avec PI(4,5)P2-perles est due à l'association RAP1 au sein d'un complexe avec des protéines qui lient PI(4,5)P2 (par exemple, PIP5Pase)3. Par conséquent, les tests de liaison à partir de lysates cellulaires peuvent identifier les protéines qui se lient directement ou indirectement aux ADRESSEs IP ou IP. Notamment, les interactions indirectes sont distinctes des interactions non spécifiques puisque les premiers peuvent avoir une fonction biologique (dans le contexte du complexe protéique) qui affecte ou est affectée par la liaison des métabolites. Par exemple, Ins(1,4,5,6)P4 se lie au complexe multi-subunit co-répresseur deacetylase et contrôle l'assemblage complexe et l'activité13. Par conséquent, il est essentiel de valider les interactions IP/PI avec les protéines. La validation de l'interaction peut impliquer des essais de concurrence avec un excès d'IP ou de IP (comme dans la figure 3B)3,8, mutations de domaines protéiques potentiels56, ou l'utilisation de protéines purifiées pour déterminer les interactions directes (Figure 3A,B)3.
D'autres méthodes d'étude des interactions entre protéines et IP ou IP comprennent la liaison des protéines aux IP ou IP radio-étiquetés, l'utilisation de IP ou de IP liés aux membranes hydrophobes comme matrices pour la capture des protéines, ou la liaison des protéines aux IP incorporées dans les liposomes. 42 Ans, états-unis ( , 57 Annonces , 58. Il est important de noter que si l'interaction protéique avec les IP nécessite des structures membranaires38, les essais à base de liposome peuvent être utilisés comme approche complémentaire. Les limites de ces approches comprennent un faible débit, une faible sensibilité, l'orientation chimique inconnue des IP ou de l'association des IP vers les matrices58, ou l'utilisation de matières radioactives42. La méthode décrite ici est sensible, sans liposome, non-radioactive, et IP / PI-perles sont disponibles dans le commerce, et donc ils ne nécessitent pas de synthèse chimique personnalisée. En outre, la position de la biotine liée aux IP ou aux IP est bien définie, et elle peut également être modifiée46,58, ce qui permet une analyse précise de l'interaction des protéines et des métabolites. La méthode décrite ici peut également être combinée avec des approches quantitatives de spectrométrie de masse telles que l'étiquetage isotopique stable des acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC)47, qui peut être utilisé pour identifier les interactions dynamiques sous différents cellulaires traitements ou conditions. La chromatographie d'affinité couplée à la tache occidentale ou à la spectrométrie de masse a aidé à identifier de nombreuses protéines IP- ou PI-contraignantes de T. brucei, de cellules de mammifères, et de levure3,8,46, 47, y compris les protéines qui n'ont pas caractérisé les domaines de liaison IP ou PI, et il a également contribué à l'identification de nouveaux domaines de liaison, par exemple, PI(3,4,5)P3 domaine de liaison47.
Dans l'ensemble, les protocoles décrits ici peuvent être utilisés pour étudier les protéines potentielles de T. bruceien matière d'IP ou d'IP, et pour étudier l'interaction moléculaire des protéines avec ces métabolites. Le protocole peut être facilement adapté pour identifier les protéines liant IP ou PI à partir d'autres parasites unicellulaires ou d'autres organismes tels que les cellules de mammifères47 et la levure46, et il aidera à mieux comprendre la fonction biologique des IP et PIs en eucaryotes.
L'auteur n'a rien à révéler.
Ces travaux ont été appuyés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG, RGPIN-2019-04658); Supplément de lancement de découverte du CRSNG pour les chercheurs en début de carrière (DGECR-2019-00081) et par l'Université McGill.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Ketone |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | Solvent |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | Inorganic salt |
Centrifuge Avanti J6-MI | Beckman Coulter | Avanti J6-MI | Centrifuge for large volumes (e.g., 1L) |
Centrifuge botles | Sigma-Aldrich | B1408 | Bottles for centrifugation of 1L of culture |
Control Beads | Echelon | P-B000-1ml | Affinity chromatography reagent - control |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Sugar, Added in PBS to keep cells viable |
Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Reducing agent |
Dynabeads M-270 Streptavidin | ThermoFisher Scientific | 65305 | Streptavidin beads for binding to biotin ligands |
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | Protease inhibitors |
Electrophoresis running buffer | Bio-Rad | 1610732 | 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3 |
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning Life Sciences | 430052 | To centrifuge 10 mL cultures |
Formic acid | Sigma-Aldrich | 106526 | Acid |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Amino acid |
HMI-9 cell culture medium | ThermoFisher Scientific | ME110145P1 | Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms |
Imperial Protein Stain | ThermoFisher Scientific | 24615 | Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE |
Ins(1,4,5)P3 Beads | Echelon | Q-B0145-1ml | Affinity chromatography reagent |
Instant Nonfat Dry Milk | Thomas Scientific | C837M64 | Blocking reagent for Western blotting |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides |
Lab Rotator | Thomas Scientific | 1159Z92 | For binding assays |
LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 13-698-793 | Low protein binding tubes for mass spectrometry |
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) | Sigma-Aldrich | 21-3277 | Detergent |
PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Physiological buffer |
Peroxidase substrate for chemiluminescence | ThermoFisher Scientific | 32106 | Substrate for Western bloting detection of proteins |
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Phosphatase inhibitors |
PI(3)P PIP Beads | Echelon | P-B003a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(3,4)P2 PIP Beads | Echelon | P-B034a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(3,4,5)P3 diC8 | Echelon | P-3908-1mg | Affinity chromatography reagent |
PI(3,4,5)P3 PIP Beads | Echelon | P-B345a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(3,5)P2 PIP Beads | Echelon | P-B035a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(4)P PIP Beads | Echelon | P-B004a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(4,5)P2 diC8 | Echelon | P-4508-1mg | Affinity chromatography reagent |
PI(4,5)P2 PIP Beads | Echelon | P-B045a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(5)P PIP Beads | Echelon | P-B005a-1ml | Affinity chromatography reagent |
Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid) |
Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 702587 | Potassium salt |
PtdIns PIP Beads | Echelon | P-B001-1ml | Affinity chromatography reagent |
PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | For Western blotting |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5910 R | Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL) |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 862010 | Detergent |
Sodium thiosulfate | Sigma-Aldrich | 72049 | Chemical |
SpeedVac Vacuum Concentrators | ThermoFisher Scientific | SPD120-115 | Sample concentration (e.g., for mass spectrometry) |
T175 flasks for cell culture | ThermoFisher Scientific | 159910 | To grow 50 mL T. brucei culture |
Trypsin, Mass Spectrometry Grade | Promega | V5280 | Trypsin for protein digestion |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | Denaturing reagent |
Vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | For mixing reactions |
Western blotting transfer buffer | Bio-Rad | 1610734 | 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol |
Whatman 3 mm paper | Sigma-Aldrich | WHA3030861 | Paper for Wester transfer |
2-mercaptoethanol (14.2 M) | Bio-Rad | 1610710 | Reducing agent |
2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Protein loading buffer |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561094 | Gel for protein electrophoresis |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0747 | Protein loading buffer |
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