Method Article
Cette étude présente une technique pour l'isolement des neurones de la souris néonatale WT. Il nécessite une dissection soigneuse de la moelle épinière de la souris néonatal, suivie de la séparation des neurones du tissu de la moelle épinière par un clivage mécanique et enzymatique.
Nous présentons un protocole pour l'isolement et la culture des neurones de la moelle épinière. Les neurones sont obtenus à partir de souris C57BL / 6 néonatales et sont isolés le 1er jour post-natal. Une litière de souris, habituellement 4-10 chiots nés d'une paire de reproduction, est recueillie pour une expérience, et les moelle épinières sont collectées individuellement de chaque souris après l'euthanasie avec de l'isoflurane. La colonne vertébrale est disséquée et la moelle épinière est libérée de la colonne. Les moelle épinières sont alors émincées pour augmenter la surface d'accouchement pour une protéase enzymatique qui permet aux neurones et autres cellules de sortir du tissu. La trituration est ensuite utilisée pour libérer les cellules en solution. Cette solution est ensuite fractionnée dans un gradient de densité pour séparer les différentes cellules en solution, ce qui permet d'isoler les neurones. Environ 1-2,5 x 10 6 neurones peuvent être isolés d'un groupe de litière. Les neurones sont ensuite ensemencés sur des puits recouverts d'adhérentsQui permettent une croissance et une maturation appropriées. Les neurones prennent environ 7 jours pour atteindre la maturité dans le milieu de croissance et de culture et peuvent être utilisés par la suite pour le traitement et l'analyse.
La compréhension de la pathologie de la moelle épinière nécessite l'utilisation de divers modèles, à la fois sur les niveaux macroscopique et microscopique. Les modèles grand et petit animal 1 , 2 , 3 sont utilisés pour des recherches in vivo de la maladie de la moelle épinière et des blessures. Tout en étudiant ces problèmes in vivo a ses mérites, l'analyse de la moelle épinière est limitée à l'homogénat de la moelle épinière entière ou aux sections de tissu 4 . Cela crée une certaine ambiguïté en essayant d'isoler des réponses et des cibles spécifiques dans la moelle épinière parmi ses neurones résidents et la glande environnante. La disponibilité croissante de souris manipulées génétiquement permet des recherches plus détaillées de la biologie aux niveaux cellulaire et moléculaire. Ainsi, un modèle de souris néonatal est utilisé ici, ce qui permet d'étudier les propriétés uniques et la biologie des neurones de la moelle épinière in vitro .
L'isolement et le maintien des neurones in vitro ne sont pas particulièrement simples. Il existe une abondance relative de techniques d'isolement des neurones du tissu cortical des rongeurs adultes qui semblent entraîner un nombre important de neurones isolés ( c'est-à-dire des millions) 5 , 6 , 7. En revanche, le rendement des neurones du tissu de la moelle épinière est inférieur à 8 , 9 , 10 , en partie à cause de la plus petite masse de tissu. En outre, chez les souris, il existe une relative pénurie de techniques d'isolement néonatal Les neurones de la moelle épinière et les méthodes existantes sont limitées par des rendements inférieurs des neurones ( c.-à-d. Des centaines) 9 ou des techniques laborieuses et lourdes nécessitant l'isolement de souris embryonnaires 10 .Dans ce protocole, nousUtiliser une technique qui permet l'isolement efficace des coûts et des ressources d'un nombre important de neurones provenant de la moelle épinière de souris néonatales. Comme c'est fréquent dans les techniques publiées précédemment, nous utilisons la papaïne comme protéase enzymatique, ce qui permet la libération de neurones du tissu de la moelle épinière 5 , 6 . En outre, nous utilisons un gradient de densité pour la séparation des cellules raffinées, qui a précédemment été efficace 6 , 10 . Alors que le milieu dans lequel les cellules sont incubées peut varier, dans notre expérience et tel que précédemment publié 11 , la supplémentation avec un supplément de milieu de culture B27 frais s'est révélée critique pour la longévité des neurones. Les neurones sont généralement viables jusqu'à 10 jours, ce qui permet d'effectuer un traitement.
Le soin et le traitement des animaux dans cette procédure ont été menés conformément aux directives du Comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux à l'Université du Colorado.
1. Préparation des solutions
2. Coating Wells and Slides
REMARQUE: Les neurones ne respectent pas bien les surfaces en plastique ou en verre.
3. Récolte des cordes spinales
REMARQUE: Tous les instruments doivent être autoclavés (135 ° C et 30 psi pour les cycles 4 x 7 min) pour la stérilité.
4. Isolation des neurones
REMARQUE: L'étape suivante doit être effectuée dans un capot à flux laminaire. La connaissance de la technique stérile basique est attendue.
En utilisant cette technique, une seule litière (4-10 chiots) permet l'isolement de 1-2,5 10 6 neurones adaptés pour semer sur des plaques de culture. Généralement, 4-8 puits sont ensemencés à la concentration mentionnée ci-dessus ( c.-à-d. 300 000 cellules / mL). La figure 3 démontre l'apparition de neurones à cette concentration après une semaine de culture à microscopie optique de grossissement faible ( a ) et haute ( b ). Cependant, nous avons également pu cultiver des cellules à des concentrations aussi élevées que 500 000 cellules / puits et jusqu'à 100 000 cellules / puits. L'utilisation de concentrations plus élevées nécessite une attention plus moyenne et plus attentive aux conditions environnementales, car les nutriments peuvent être épuisés rapidement, conduisant à un environnement acide toxique pour les cellules. Avec des concentrations plus faibles, les cellules ont tendance à ne pas atteindre la maturité complète, et une prolifération de cellules de soutien ( c.-à-d. Oligodendrocytes, miCroglia et astrocytes) est observée.
Les cellules commencent généralement à adhérer à la surface au cours des premières heures ( Figure 4a ). Les axones commencent à germer dans les premières 24-48 h ( Figure 4b -4c ). Les connexions entre différents neurones en culture atteignent typiquement la maturité à 7 jours ( Figure 4d ), à ce stade où des expériences sont généralement effectuées sur les neurones.
Les neurones sont identifiables sous microscope optique, car ils ont des projections axonales distinctes. Nos isolations utilisant la couche 3 ( Figure 2 ) donnent environ 80 à 90% de neurones en culture. Ceci a été confirmé en utilisant la coloration immunofluorescente de marqueurs spécifiques de neurones. Dans la figure 5c , la protéine cytosquelette du neurone protéine 2 protégée par microtubule (MAP2) est s, Montrant des contours et des projections axonales des neurones après une semaine de culture. De même, dans la figure 6c , le marqueur nucléaire NeuN spécifique des neurones est coloré, montrant des noyaux neuronaux. Ces marqueurs neuronaux sont combinés avec l'imagerie du noyau (DAPI, Figure 5a , 6a ) et du cytoplasme (GFP, Figure 5b , 6b ), et les images résultantes sont fusionnées ( Figure 5d , 6d ), détaillant l'abondance relative des neurones à d'autres cellules dans Culture. Lors de l'utilisation des couches 2 et 3, le rendement des neurones est légèrement supérieur; Cependant, il y a moins de neurones dans la solution pure (~ 70%).
Figure 1: colonne de la colonne vertébrale dissoute et la moelle épinière Sortie d'une souris néonatale de 3 jours. leLa flèche en ( a ) pointe vers l'extrémité caudale de la colonne vertébrale, où une aiguille est insérée pour libérer la moelle épinière. Une moelle épinière libérée ( b ) est montrée submergée dans PBS. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Gradient de densité, avec cellules ajoutées après centrifugation. Les couches sont décrites et mieux visualisées sur la représentation des dessins animés. La couche la plus superficielle (0) est généralement le débris du tissu de la moelle épinière. La couche 1 est riche en oligodendrocytes et astrocytes. Les couches 2 et 3 contiennent la majorité des neurones. Alors que la couche 3 contient des neurones avec la plus grande pureté, certaines cellules de soutien ( c.-à-d. Astrocytes et oligodendrocytes) se trouvent dans la couche 2. Les peLa lèvre au fond contient principalement des cellules microgliales. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Microscopie légère des cultures cellulaires neuronales après 7 jours d'isolement. Au grossissement 10X ( a ), on peut voir des connexions axonales entre divers conglomérats de neurones. Au grossissement 40X ( b ), les neurones peuvent être visualisés plus étroitement avec leurs projections axonales. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
> Figure 4: Cours de temps des neurones après ensemencement sur les puits. L'image ( a ) montre les cellules 1 h, ( b ) 24 h, ( c ) 48 h, et ( d ) 1 semaine après l'ensemencement. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Tache immunofluorescente de neurones utilisant le marqueur cytosquelettaire neuronal MAP2. La coloration nucléaire (DAPI) est indiquée en bleu ( a ), avec une coloration cytoplasmique (GFP) en vert ( b ) et une protéine cytosquelette neuronale (MAP2) en rouge ( c ). Les images fusionnées ( d ) sont combinées, montrant l'abondance relative des neurones.Target = "_ blank"> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: Taches immunofluorescentes de neurones utilisant le marqueur nucléaire neuronal NeuN. La coloration nucléaire (DAPI) est montrée en bleu ( a ), avec une coloration cytoplasmique (GFP) en vert ( b ) et des noyaux neuronaux (NeuN) en rouge ( c ). Les images fusionnées ( d ) sont combinées, montrant l'abondance relative des neurones. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Médias | Espace de rangement | Ingrédients | Préparation | ||
HABG | 4 ° C / 24h | 100 mL | - Décongeler B27 dans un réfrigérateur 4 ° C O / N - Filtrer la stérilisation (0,22 μm) | ||
Hibernate A | 97,8 mL | ||||
B27 [2%] | 2 mL | ||||
GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml | ||||
Neurobasal Media | 4 ° C / 1 semaine | 100 mL | - Décongeler B27 dans un réfrigérateur 4 ° C O / N - Filtrer la stérilisation (0,22 μm) - Aliquoter 50 ml de portions dans des tubes de 50 ml (conserver à 4 ° C) | ||
Neurobasal A | 97 mL | ||||
B27 [2%] | 2 mL | ||||
GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml | ||||
Pen / Strep [1%] | 1 mL | ||||
Digestion Media | Jour d'isolement | 10 mL | - Secoue vigoureusement - Laisser reposer dans un bain à 37 ° C pendant 30 min (idéalement préparé 30 min avant utilisation) - Filtrer la stérilisation (0,22 μm) | ||
HA-Ca | 10 mL | ||||
Papaïne | 25 mg | ||||
GlutaMAX [0,5 mM] | 0,025 ml | ||||
Densité Gradient | Jour d'isolement | 1 Gradient | |||
Couche | OptiPrep | HABg | |||
(0,13 ml) | (5,29 ml) | ||||
1 Bas | 0,26 mL | 1,24 mL | |||
2 | 0,19 mL | 1,31 mL | |||
3 | 0,15 mL | 1,35 mL | |||
4 Top | 0,11 mL | 1,39 mL |
Tableau 1: Préparation des supports et des solutions utilisés dans le présent protocole.
Substrat de revêtement | Espace de rangement | Ingrédients | Préparation | |
PDL | - 20 ° C Congeler-décongeler une fois | Poly-D-Lysine Hydrobromide | 5 mg | - Aliquote de 4 ml dans des tubes de 15 ml et conservez immédiatement à -20 ° C - 0,5 mL / puits (plaque à 24 puits) |
Eau stérile | 50 mL | |||
Laminin | Jour de revêtement | Laminine (1 mg / mL) | 80 μL | - Assez pour 8 puits dans une assiette de 24 puits - 0,35 mL / puits (plaque à 24 puits) |
Neurobasal Medium | 2,72 ml |
Tableau 2: Préparation des substrats de revêtement utilisés pour enrober les puits sur lesquels les neurones sont cultivés.
Cette technique permet une culture fiable des neurones de la moelle épinière. Une fois que la maîtrise de la technique est atteinte, il faut environ 3,5 h pour compléter. Nous avons pu effectuer l'isolement des neurones à partir de 2 larves séparées (16 prises de souris) en environ 4 h. L'étape clé de la faisabilité est de pouvoir extraire efficacement les cordes vertébrales des souris. Le rendement permet de plaquer plusieurs puits et de pouvoir tester les neurones dans diverses conditions. Nous avons pu traiter les neurones après la maturité et évaluer de manière fiable l'expression des protéines en utilisant l'analyse Western Blot. En outre, l'utilisation de diapositives en verre à l'intérieur des puits pour les pièces jointes aux neurones permet une analyse de coloration supplémentaire des neurones.
Cette procédure est avantageuse en ce qu'elle ne nécessite pas de tissu embryonnaire et l'intensité de travail associée. En outre, il n'est pas nécessaire d'utiliser des cordes spinaires adultes pour collecter suffisamment de tissu pour être adéquatE isolement des neurones. Cela empêche le facteur de comportement de l'âge dans la physiologie des neurones, comme on l'a vu chez les souris adultes. Cependant, cette technique n'est pas sans limites. Comme mentionné précédemment, les neurones âgés sont exclus en utilisant des souris néonatales, ce qui peut être une limitation si le comportement lié à l'âge et la biologie sont la zone d'investigation. Il existe une courbe d'apprentissage de la procédure, qui est nécessaire non seulement pour optimiser le rendement, mais pour s'assurer que les neurones isolés sont en bonne santé. La technique d'extraction de la moelle épinière peut prendre du temps à maîtriser, en particulier chez les souris nouvellement nées. Nous avons remarqué que le temps prolongé associé à l'extraction des cordes de la colonne vertébrale conduit à des neurones qui peuvent être cultivés pendant une période beaucoup plus courte. Ceci est quelque peu atténué par le placement des neurones sur la glace; Cependant, le temps joue toujours un rôle clé.
Il existe des étapes clés dans la procédure qui permettent d'assurer le rendement optimal des neurones. Si le rendement des neurones n'est pas comme eXpected, quelques étapes devraient être évaluées. Tout d'abord, le nombre de moelle épinière devrait idéalement être supérieur à 4. Lorsque 3 cordes épineuses ou moins sont utilisées, le rendement est habituellement inférieur à 1 million de neurones. Une préparation adéquate du milieu de digestion doit être assurée (étape 4.5). Laisser le tissu trop longtemps dans le milieu de la digestion entraînera une dégradation excessive des cellules, tout en utilisant un milieu de digestion qui n'a pas été activé à 37 ° C entraînera moins de neurones isolés. Enfin, la technique de trituration (étape 4.7) doit être effectuée avec précision. Les faibles rendements résultent généralement d'une trituration insuffisante. Un bon indicateur est de voir si la solution devient trouble pendant la trituration - si cela ne se produit pas, il est probable que la trituration soit trop douce.
Si le rendement est comme prévu, mais les neurones ne semblent pas régénérer les processus au cours des 1-2 premiers jours, le problème est généralement une panne dans un revêtement approprié, soit avec un lavage inadéquatOu le séchage (étape 2.2). Si les cellules projettent initialement les processus mais deviennent ultérieurement apoptotiques avant la marque de 5-7 jours, il pourrait y avoir plusieurs problèmes. Tout d'abord, assurez-vous que la solution HABG est préparée dans les 24 h de l'isolement et que le supplément B27 frais qui a été décongelé le jour même de la préparation HABG est utilisé. Les antioxydants de ce supplément doivent être frais et non expirés. Ensuite, assurez-vous qu'aucune bulle n'est introduite pendant le processus de trituration (étape 4.7). L'introduction de bulles d'air contribue à cette question et peut être liée au séchage des neurones. Veillez également à ce que la culture ne soit pas submergée par la contamination, ce qui peut être attribué aux défaillances de la stérilité.
Ici, nous décrivons l'utilisation de plaques à 24 puits sur lesquelles semer les neurones. Parfois, il est nécessaire d'effectuer des essais de temps et / ou de dosage, par exemple lors de l'utilisation d'agents pharmacologiques. La technique peut être modifiée et les neurones peuvent être ensemencés sur 48 poÀ la place. Étant donné que la surface d'un puits dans une plaque de 48 puits est la moitié de celle dans une plaque à 24 puits, les volumes de solutions de revêtement utilisés doivent être coupés en deux. Les cellules doivent également être revêtues à la moitié du volume ( c.-à-d. 0,5 mL au lieu de 1,0 mL). Cependant, leur concentration devrait rester la même ( c.-à-d. 1-5 x 10 5 cellules / mL). Bien que cette étude ait été réalisée à l'aide de souris C57BL / 6, la technique devrait s'appliquer à d'autres souches génétiquement manipulées.
L'ischémie de la moelle épinière et la protection est une zone d'intérêt croissant 12 , 13 , 14 . Cliniquement, la chirurgie aortique thoraco-abdominale peut entraîner une paralysie dévastatrice liée à l'ischémie et à la reperfusion de la moelle épinière, dont la pathophysiologie reste complètement comprise 15 , 16 . Comprendre comment les neurones répondent àLe stress de l'ischémie est possible en utilisant ce modèle. Notre groupe a précédemment publié une blessure neuronale de la moelle épinière liée à une insulte ischémique à travers la privation de glucose d'oxygène en utilisant cette technique 17 . Le modèle a également été étendu pour inclure la culture des astrocytes, séparée des neurones 18 .
En conclusion, cette technique est précieuse pour l'étude de la pathophysiologie de la moelle épinière et de la microbiologie neuronale. La culture sans sérum permet un contrôle environnemental précis. Il permet un accès direct à l'application d'agents pharmacologiques. Combinée à des techniques supplémentaires, comme la privation de glucose par l'oxygène, cette technique peut être utile pour élargir notre compréhension de la pathophysiologie de l'ischémie déterminante de la moelle épinière.
Les auteurs n'ont pas de divulgation.
Les auteurs n'ont aucune reconnaissance.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Hibernate A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
Hibernate A Minus Calcium - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
B27 Supplement 50X - 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
Papain, Lyophilized - 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
Neurobasal A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
Mouse Laminin - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
Trypan Blue - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
Glass Pippette - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
Pipette bulb - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
BRAND® Petri dish, glass - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
Sterile 24-Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 °C |
MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 °C |
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