Obtención de imágenes de muestras biológicas con microscopía óptica y confocal

Fuente: Peiman Shahbeigi-Roodposhti y Sina Shahbazmohamadi, Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Connecticut, Storrs, Connecticut

Los microscopios ópticos han existido durante siglos, y aunque alcanzaron su limitación teórica de resolución hace décadas, nuevos equipos y técnicas, como el procesamiento de imágenes confocales y digitales, han creado nuevos nichos dentro del campo de la óptica Imagen. Los mejores microscopios ópticos normalmente tendrán una resolución de hasta 200 nm en condiciones ideales. Sin embargo, los microscopios ópticos están limitados por la difracción de ondas, una función de la longitud de onda, que es alrededor de 500 nm para la luz visible. Si bien la resolución de los microscopios ópticos no alcanza la de los microscopios electrónicos, son las herramientas más valiosas en la toma de imágenes de macroestructuras biológicas y son un elemento básico en cualquier laboratorio biológico.

En los microscopios de luz convencionales, la señal producida a partir del objeto de imagen proviene del espesor total de la muestra, lo que no permite que la mayor parte de ella esté enfocada al observador. Esto hace que la imagen tenga "desenfoque defoco". El microscopio confocal, por otro lado, ilumina la muestra a través de un orificio de pasador, y por lo tanto es capaz de filtrar la luz fuera de foco desde arriba y por debajo del punto de enfoque en el objeto.

Esta demostración proporciona una introducción a la adquisición de imágenes mediante métodos ópticos y de microscopía confocal. Aquí, se estudiará una pieza seccionada del cerebro del ratón.  La adquisición y el análisis de imágenes, incluidas las herramientas para generar mapas topográficos e imágenes compuestas, se cubrirán. También se discutirán las ventajas y desventajas de los diferentes métodos de diagnóstico por imágenes relacionados con la resolución, la profundidad de enfoque y el tipo de muestra. El propósito de esta demostración es proporcionar más información sobre microscopios ópticos y confocales para determinar si estos módulos de microscopía son los más adecuados para un tipo de muestra biológica.

Los microscopios ópticos funcionan utilizando al menos dos elementos de aumento. La lente primaria, llamada objetivo, determina el aumento total, y la lente secundaria, llamada ocular, enfoca la imagen virtual para su visualización. El aumento total se determina multiplicando las ampliaciones de las dos lentes. El enfoque de la luz a través de estas fuentes, junto con el enfoque de la luz de la lámpara en la muestra, dan un plano de enfoque especificado donde el aumento y la luz de la lámpara se encuentran en el mismo punto, lo que da la mejor resolución en la imagen. La figura siguiente muestra cómo se crea el plano focal de la muestra a través de las diferentes lentes. Los objetos fuera del plano focal tendrán haces de luz que interfieren de otras partes de la muestra debido al área de iluminación más grande. Esto provoca desenfoque en la imagen. Por lo tanto, para centrarse en diferentes posiciones z de una muestra con alturas muy variables, las rebanadas de dirección z deben moverse al plano focal.

Figura 1. Lentes de microscopía óptica y planos focales.

Los microscopios digitales funcionan con el mismo principio que los microscopios ópticos, excepto que no dependen de un ocular. Es un microscopio óptico equipado con una cámara digital. La cámara digital actúa como un detector y las imágenes se muestran en un monitor de ordenador. Estos microscopios son ideales para el análisis y documentación de muestras durante la investigación y el desarrollo (I+D), la fabricación y la inspección, el control de calidad y la garantía (QC/QA), así como el análisis de fallos (FA). Por lo general, ofrecen software que permite a los usuarios analizar la imagen de muestra. La Figura 2 muestra una configuración típica del microscopio digital.

Figura 2. Principales componentes del microscopio digital.

Los principales componentes del sistema son:

1. Motor óptico: Contiene el sensor de adquisición de imágenes y las lentes para acercar la imagen.
2. Objetivo: Adquiere y enfoca la luz de la muestra. Hay tres objetivos diferentes disponibles para varias tareas de adquisición de imágenes.
3. Etapa de escaneado: ubicación donde se va a colocar la muestra.
4. Soporte del microscopio: Proporciona el soporte para el motor óptico y la etapa de escaneo. También controla la comunicación entre los componentes conectados y el ordenador.
5. Ordenador: Soporta software de usuario y permite ver imágenes en el monitor.
6. Controlador: Controla el microscopio y el flujo de trabajo mediante gestos multitáctil e iconos sensibles al tacto y específicos del contexto. Las perillas de control controlan el zoom, el enfoque y la posición de la imagen del microscopio.

Un microscopio confocal, o microscopía de escaneo láser confocal (CLSM), es un microscopio con mayor resolución óptica y contraste. Confocal significa "tener el mismo enfoque". El objeto y su imagen son "confocales".

Figura 3. Desenfoque y su efecto en una imagen. La imagen izquierda muestra una imagen fuera de foco con bordes borrosos. La imagen correcta muestra la trayectoria de la luz a través de la lente al tomar imágenes de una muestra que está enfocada.

A diferencia de los microscopios de luz generales que iluminan e ilustran toda la muestra a la vista, los microscopios confocales utilizan un agujero entre la etapa de la muestra y el detector, de modo que solo un haz de luz más pequeño se centra a un nivel de profundidad estrecho a la vez. Por lo tanto, el único área visible de la muestra es el punto de enfoque. A continuación, el microscopio confocal escanea la superficie de la muestra con este haz de luz mucho más enfocado (o un láser). A continuación, los datos se ensamblan en una imagen 2D que tiene mejor resolución que la microscopía óptica clásica. Además, debido a que la luz se centra en un rango muy estrecho de alturas, el usuario puede poner diferentes planos en el foco a medida que se mueve la dirección Z. A través de técnicas de procesamiento de imágenes y software de automatización, los microscopios confocales ayudan en la reconstrucción 3D de imágenes compuestas centradas en múltiples planos.

Los microscopios confocales tienen la capacidad a través del procesamiento de imágenes para proporcionar datos de dirección Z sobre una muestra que anteriormente no estaba disponible en microcopia óptica. Por ejemplo, en la demostración que se describe a continuación, el usuario puede definir los rangos superior e inferior de enfoque para una muestra y, a continuación, no sólo desarrollar un mapa de calor que muestre las mediciones de la dirección z, sino también crear una imagen compuesta que muestre todas las partes de la imagen en centro de atención. Estas características son especialmente útiles al obtener datos 3D sobre una muestra.

Figura 4. Componentes principales de un microscopio confocal.

Los principales componentes del microscopio confocal incluyen:

1. Cabezal de escaneo con unidad Z fina y cámara de 4 megapíxeles, soporte con unidad Z gruesa
2. Objetivos: 2.5x/ 5x/ 10x/ 20x/ 50x/ 100x
3. Etapas: Etapa de escaneo y etapa fija
4. Sistema informático: software de imágenes del sistema de PC
5. Controlador: x, y, z movimiento

1. Imágenes confocales

1. Cargue la muestra en el escenario. Entiébelo debajo de la lente. No debe exceder la limitación de peso de la etapa, que en este caso es de 5 kg. La muestra no debe tener más de 100 mm de espesor.
2. Abra el software de imágenes y seleccione "Crear trabajo."
3. En la columna Topografías, elija el botón asistente.
4. Cree una imagen general con el aumento más bajo, 2.5X. Antes de cambiar las ampliaciones, asegúrese de que la muestra esté enfocada cambiando la posición Z hasta que vea una imagen clara. Esto se puede hacer empujando hacia abajo o tirando hacia arriba en el manipulador del microscopio 3D. El movimiento Z más fino se logra activando el botón en el lado, lo que provoca una luz azul alrededor de los bordes.
5. Aumente lentamente el aumento de la lente, jugando continuamente con la intensidad de la luz y el enfoque hasta que esté en el aumento deseado. Si lo desea, elija un área de interés diferente moviendo la etapa en las direcciones x e y utilizando el manipulador.
6. Una vez que se toma una imagen general en el aumento bajo, pulse el botón siguiente para continuar con el paso Punto de referencia. Si lo desea, especifique un punto de referencia determinado para la medición (es decir, la esquina de la muestra), aunque para ello el punto de referencia predeterminado está bien.
7. Pulse la flecha siguiente para pasar a la siguiente parte del asistente.
8. Cambie el objetivo como desee para ver una resolución adecuada para su muestra. En este caso, la lente objetivo 50X se utiliza para visualizar las celdas de la muestra. El 50X es la lente más cercana a la muestra, por lo que se mueve gradualmente hasta el objetivo 50X asegurando que todavía hay espacio para disminuir la distancia de trabajo después de la lente 20X.
9. En la página "Definición de rango de medición", mueva ligeramente la posición Z (haciendo clic en el botón lateral del manipulador para ajustes finos) para que solo la parte superior de la muestra esté enfocada y haga clic en "Set Last". A continuación, mueva la etapa en la dirección Z (hacia abajo) hasta que solo la parte inferior de la muestra esté enfocada y pulse "Set First". Asegúrese de que el número de sectores calculados no supere los 1000 o que el programa falle.
10. Asegúrese de que la intensidad de la luz no se sobresatura (causa píxeles rojos) en la imagen en cualquiera de los niveles y luego se golpea hecho. Esto tomará la imagen de la tomografía y abrirá el software de tomografía.
11. En el software de tomografía, abra pestañas como la pestaña Estudios para ver los datos en 3D y tomar medidas en espacio 2D o 3D.

2. Imágenes de microscopio óptico digital

1. Cargue la muestra en el escenario. Centra la muestra debajo de la lente. El peso de la muestra no debe exceder la limitación de peso de la etapa, que en este caso es de 4 kg. La muestra no debe ser superior a 12 cm.
2. Abra el software de imágenes.
3. Seleccione un trabajo de la lista de plantillas proporcionadas. También es posible trabajar fuera de un trabajo presionando Examen Gratuito, que le permite estudiar una muestra fuera de un trabajo.
4. Adquiera una imagen de vista general que muestre toda la etapa. Esto servirá como mapa más adelante para mostrar la parte de la muestra que se está visualizando. Al adquirir la imagen, utilice el controlador para cambiar el enfoque y la posición de la imagen.
5. Coloque un sistema de coordenadas. El sistema de coordenadas predeterminado es de la esquina posterior izquierda del escenario y está bien para esta aplicación. Si la muestra está torcida, puede ajustar las coordenadas aquí.
6. Asigne un nombre al ejemplo y al trabajo, esto lo agrega a la lista de trabajos para que otros usuarios puedan volver a él.
7. Seleccione el botón de la cámara en Adquirir. Tome una imagen inicial y, a continuación, presione el botón live mientras navega por la muestra.
8. Mueva el foco hacia abajo hasta que la muestra esté claramente enfocada. También puede ser necesario ajustar la iluminación en la pestaña Iluminación y Apertura".
9. Optimice la imagen con las herramientas del panel Optimización de imagen. Puede jugar con diferentes parámetros en la pestaña Mejoras de imagen, como la inclinación de la lente, los niveles de iluminación de la muestra y el brillo y el contraste, hasta que la imagen tenga la nitidez deseada.
10. Realice mediciones tocando la herramienta Lápiz en el software. Desde allí, tiene acceso a varias herramientas de medición, incluidas distancias, ángulos y área. Utilice las herramientas de distancia y área para medir el tamaño de la muestra.
11. Vaya a la pestaña Flujo de trabajo de resultados y compruebe el diseño del flujo de trabajo para configurar el diseño del informe
12. Toque el botón Guardar para guardar el trabajo de modo que otros puedan usar el mismo flujo de trabajo.

Las siguientes imágenes ofrecen una visión general de los resultados que se pueden obtener de un cerebro de ratón utilizando un microscopio confocal. Muestran cómo se pueden obtener diferentes niveles de información y cómo un mapa topográfico de los resultados revela la altura de la muestra.

Figura 5: Imágenes confocales con aumento 50X que muestran un cerebro de ratón seccionado. La imagen de la izquierda es una imagen compuesta que toma todos los planos enfocados durante la tomografía y crea una imagen de alta resolución y profundamente enfocada. La imagen de la derecha muestra el mapa topográfico de la muestra.

Figura 6: Como ejemplo mejor representativo de las aplicaciones 3D del microscopio confocal, se indujo y analizó un agujero en plástico. El mapa topográfico original está a la izquierda y la reconstrucción 3D a la derecha.

Figura 7: Muestra la extensión del análisis delsoftware ConfoMap para observar un perfil a partir de una reconstrucción 3D. Se muestran los parámetros de amplitud, el perfil de rugosidad y la caracterización de la curva.

Las siguientes imágenes ofrecen una visión general de los resultados que se pueden obtener mediante el uso de un microscopio óptico digital en la misma rebanada cerebral del ratón. El microscopio digital ofrece un campo de visión más grande, pero imágenes de menor resolución del microscopio confocal, que es ideal para mirar componentes más grandes o estructuras biológicas. El software tiene herramientas de análisis útiles para medir la muestra.

Figura 8: Imagen general que muestra la rebanada de órgano entero.

Figura 9: Zoom en la imagen de un cerebro deratón seccionado. Aquí hay un campo de visión de 300 micras obtenido con iluminación coaxial y anillo mixta, así como estabilización de imagen electrónica.

Figura 10: Demostración de las capacidades de medición del microscopio óptico digital. El diámetro de la muestra se mide a la izquierda, y un contorno definido por el usuario que se utiliza para calcular el área interna del cerebro del ratón seccionado se muestra a la derecha. Estas herramientas son útiles al analizar muestras biológicas, que pueden no tener bordes que son los mismos que las formas predefinidas.

En esta demostración, la profundidad de enfoque, el campo de visión y la máxima resolución y ampliación de los microscopios ópticos y confocales se optimizaron para ver muestras biológicas. Esta demostración fue diseñada para ayudar al participante a decidir qué módulo de microscopía es el mejor para una determinada aplicación. Ambos modos de microscopía tienen ventajas en el análisis de muestras biológicas por su facilidad de preparación e imágenes compuestas de alta resolución.

Las aplicaciones para microscopía óptica y confocal son de gran alcance. Debido a la preparación limitada de la muestra y la capacidad de integrar planos de movimiento y utilizar técnicas de luz por encima de la muestra, estas herramientas son capaces de obtener información de la mayoría de los conjuntos de datos. La microscopía ha sido una opción muy popular cuando se toma imágenes de células vivas, como las tratadas con fluorescencia, pero las aplicaciones pueden ir desde las superficies de imagen de los dispositivos biomédicos hasta la detección de defectos y rugosidad antes de implantarlas en el cuerpo. La microscopía confocal y óptica es el estándar actual para la toma de imágenes de muestras biológicas.

Por último, la microscopía confocal ofrece imágenes mejoradas con técnicas de fluorescencia. Los fluoróforos en una muestra tienen una vida útil limitada y pueden foto-blanquear cuando se exponen a altas cantidades de luz. En la microscopía de luz tradicional, toda la muestra se ilumina durante la toma de imágenes, lo que resulta en un fotoblanqueo rápido. Sin embargo, dado que sólo una pequeña parte de la muestra se ilumina a la vez con microscopía confocal, la vida útil del fluoróforo es más larga y hay menos desafíos asociados con el fotoblanqueo.