Imágenes por micro-CT de la médula espinal de un ratón

Fuente: Peiman Shahbeigi-Roodposhti y Sina Shahbazmohamadi, Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Connecticut, Storrs, Connecticut

Es un hecho poco conocido que el descubrimiento y el uso (involuntario) de rayos X obtuvieron el primer Premio Nobel de Física. La famosa imagen de rayos X de la mano de la esposa del Dr. Runtgen desde 1895 que envió ondas de choque a través de la comunidad científica se parece a la mayoría de las imágenes de rayos X médicas 2D modernas. Aunque no es la tecnología más reciente, la toma de imágenes de absorción de rayos X es una herramienta indispensable y se puede encontrar en los principales laboratorios universitarios y de I+D del mundo, hospitales, aeropuertos, entre otros lugares. Podría decirse que los usos más avanzados de la toma de imágenes de absorción de rayos X implican obtener información como la que se encuentra en una radiografía médica 2D pero realizada en 3D a través de una tomografía computarizada (TC o micro-CT). Al tomar una serie de proyecciones de rayos X 2D, el software avanzado es capaz de reconstruir datos para formar un volumen 3D. La información 3D puede, y lo más probable es que incluya información del interior del objeto sondeado sin tener que ser abierto. Aquí, se obtendrá una exploración de micro-CT, y se discutirán los principales factores que afectan la calidad de la imagen.

Los rayos X se pueden ver como fotones con un rango de energía de 0.1 - 100 keV u ondas electromagnéticas con longitudes de onda que van desde 0.01 - 10 nm. Los rayos X se pueden crear de varias maneras diferentes, pero aquí la discusión se limita a las imágenes de rayos X de rayos X de espectro cono continuo. Estos rayos X son creados por un fenómeno conocido como "Bremsstrahlung", que significa "radiación de frenado" en alemán. Esto ocurre cuando una partícula cargada se somete a una aceleración [1]. En una fuente de rayos X, un electrón cargado negativamente se dispara en un tubo de vacío y afecta a un material objetivo (generalmente tungsteno, molibdeno, cobre u otro metal) y a través de su desaceleración, emite fotones en la escala de un rayo X. Se genera un espectro continuo de rayos X porque la desaceleración no es uniforme ni instantánea, aunque hay picos en la distribución centrados alrededor de las energías características del material objetivo como se ve en [2]. Hay diferentes curvas para diferentes energías y materiales de destino. Esto es algo muy importante a tener en cuenta al realizar una exploración de micro-TC y se discutirá en una sección posterior.

Un sistema micro-CT típico cuenta con tres componentes primarios, como se muestra en [3]. Los componentes básicos de este sistema incluyen: a) fuente de rayos X, b) etapa de rotación para el montaje de la muestra, y c) panel plano u objetivo óptico con detectores CCD. Los rayos X salen de la fuente y son absorbidos, transmitidos o dispersos por la muestra antes de llegar al detector. La absorción es la interacción predominante medida en microCT, ya que diferentes materiales en el cuerpo absorben los rayos X de manera diferente. Por ejemplo, los huesos contienen una gran cantidad de calcio atómico, que absorbe bien los rayos X. Por lo tanto, los huesos impiden que los rayos X lleguen al detector, y terminan apareciendo en la imagen como una sombra. A continuación, la muestra se gira de forma incremental y el proceso se repite hasta que la muestra se ha realizado durante 360o o, en algunos casos, 180o. La salida de la tomografía es una serie de proyecciones 2D en diferentes orientaciones que se pueden reconstruir en un volumen 3D.

Micro-CT es una forma de microscopía, ganándose su nombre por su capacidad para resolver características de microescala. La limitación de la resolución para esta categoría específica de micro-CT se rige por el tamaño del punto de origen y la dispersión de energía, y el tipo y eficacia del detector; no por la longitud de onda de los rayos X. La mejor resolución posible para esta categoría de micro-CT es alrededor de 500-700 nm en tres dimensiones. Sin embargo, es posible detectar características de una décima o centésima parte de ese tamaño.

La ampliación se realiza en la mayoría de los sistemas de TC mediante ampliación geométrica. La imagen en [3] ilustra la idea de ampliación geométrica. Se imagina fácilmente como un efecto de sombra. Cuanto más cerca esté una fuente de luz de un objeto; cuanto mayor sea la sombra del objeto aparecerá en una pared o pantalla. Del mismo modo, si esa pared o pantalla se alejara de la fuente de luz estacionaria y la muestra, la sombra del objeto aumentaría de tamaño pero se volvería más débil. Optimizar la fuente de rayos X y las distancias de trabajo del detector es una tarea muy difícil y mentalmente estimulante cuando se desea suficiente señal, alta resolución y un corto tiempo de escaneo. Como con todo, hay limitaciones en el aumento geométrico, donde la idealización de una fuente de puntos se destruye y las aberraciones se vuelven dominantes.

Uno de los muchos desafíos en micro-CT es que la calidad visual del volumen 3D será algo desconocida para el investigador hasta que la exploración se termine y se reconstruya. Aunque, con suficiente experiencia, un examen cuidadoso de algunas proyecciones 2D puede proporcionar suficiente información para sentirse seguro acerca de una tomografía computarizada. En las siguientes secciones, un conjunto de ejercicios descubrirá los efectos de diferentes parámetros de imagen en un conjunto de datos y equipará a un científico con la comprensión necesaria para obtener un volumen 3D limpio. A los efectos de esta investigación, las muestras biológicas serán sondeadas, aunque el procedimiento no se limita a un tipo de muestra.

Montar una muestra suena como un paso trivial, pero es uno de los más importantes y pasados por alto. Independientemente de la aplicación, la muestra debe montarse de la manera más compacta posible. Teniendo en cuenta la imagen en [3], imagine si el rango de posiciones de origen y detector fueran limitados porque la muestra se atascó en una dirección y cómo eso afectaría al aumento geométrico. Además de la distancia de trabajo, el montaje afecta en gran medida al rendimiento. Si la muestra fuera una articulación intacta de la rodilla de una rata, tendría sentido montar la muestra para que la tibia y el fémur estuvieran erguidos. De esta manera, los rayos X pasarían a través de una corta distancia y habría suficiente señal en el detector. Lo último a tener en cuenta al montar una muestra es la estabilidad. El mayor enemigo de la micro-TC es el movimiento. Si la magnitud del movimiento de la muestra se aproxima a la resolución del análisis, probablemente serán datos inútiles. El movimiento debe limitarse por una adhesión segura a un soporte y con control para muestrear el cambio de composición. Para muestras biológicas, eso significa asegurarquese de que no cambiará la morfología a través de la evaporación a lo largo de la exploración. Suspensión en gel de agarosa o envoltura en una fina capa de película de parafina son posibles enfoques para evitar la deshidratación y el movimiento.

La energía de rayos X también tendrá un gran efecto en la calidad del volumen 3D final. El objetivo es adquirir una señal suficiente en el detector mientras se tiene suficiente atenuación de la muestra. La atenuación de rayos X sigue la Ecuación (1), donde I es el número final de recuentos (intensidad), I₀ es el número inicial de recuentos, es el coeficiente de absorción de masa que es único para un material dado y la energía de rayos X (ampliamente publicado), es la densidad del material, y x es la longitud de la ruta de rayos X.

 (1)

Idealmente, I/I₀ (también conocido como valor de transmisión) debe estar entre 5 - 95% para toda la orientación de la muestra, con los mejores resultados que vienen alrededor del rango medio. Para comprobar este valor, tome una imagen de la muestra y, a continuación, divida los valores de píxel de la imagen por una imagen de aire (es decir, con la muestra fuera del campo de visión). Esta normalización se encuentra comúnmente en los flujos de trabajo de software del sistema. No es frecuente que las muestras biológicas exijan el uso de filtrado de rayos X en la fuente, por lo que no se cubrirá aquí. Además de tener un valor de transmisión ideal, el número ideal de recuentos para cualquier parte de la muestra es de 5000 recuentos. Para asegurar esto, es posible que sea necesario aumentar el tiempo de exposición por proyección. Esto aumentará el tiempo de análisis general. La Figura 1 muestra proyecciones 2D limpias.

Figura 1: Imágenes 2D de la médula espinal del ratón normalizadas contra el aire a 0o (izquierda) y 90o (derecha).

1. Montaje de una muestra (hueso)

1. Para examinar una red de huesos, como una columna vertebral, suspenda la estructura en un gel de agarosa y permita curarla en un tubo de plástico de paredes muy delgadas (Figura 2). La delgadez del tubo es muy importante, afectando en gran medida el rendimiento de la señal y la calidad general de la imagen. Esto, a su vez, afecta a su capacidad para resolver características. El valor de transmisión del tubo debe ser lo más cercano al 100% posible.
2. Monte el tubo en la etapa de la muestra con cinta adhesiva o haciendo un soporte personalizado, asegurando en última instancia que la muestra esté estacionaria y estable cuando el escenario gire.

Figura 2: La columna vertebral del ratón suspendida en gel de agarosa dentro del tubo de plástico de paredes delgadas sentado en la etapa de muestra del sistema micro-CT.

2. Adquisición de imágenes

1. Encienda la fuente de rayos X a una energía alrededor del rango de 90 keV (90 kV y 10 W).
2. Después de que la fuente se caliente y se asiente en la energía, adquiera una imagen a través del software del sistema.
3. Compruebe el valor de transmisión normalizando la imagen contra una imagen de aire. Para la adquisición y aplicación automáticas de referencias, asegúrese de que el ejemplo puede moverse en una dirección determinada sin bloquearse.
4. Si la imagen tiene una transmisión demasiado alta, baje la energía de forma incremental hasta que el valor de transmisión sea suficiente. Asegúrese de aumentar el tiempo de exposición en consecuencia para que la imagen no parezca ruidoso y granulado. Si la imagen tiene una transmisión demasiado baja, aumente la energía de forma incremental hasta que el valor de transmisión sea suficiente.
5. Comience a acercar la fuente de rayos X a la muestra, teniendo mucho cuidado de no bloquearla. Acercar el origen lo más posible a la muestra es un paso en la dirección de maximizar el rendimiento y asegurar la mejor resolución posible.
6. Como se hace esto, refinar el campo de visión de la muestra cambiando la etapa de la muestra con sus actuadores lineales.
7. El software mostrará un parámetro conocido como tamaño de píxel que se trata de forma similar a la resolución actual (aunque es realmente diferente).
   1. Si el número es todavía demasiado grande y la fuente está muy cerca, el detector puede comenzar a alejarse de la muestra.
   2. Si el número es demasiado pequeño, mueva con precaución el detector más cerca de la muestra.
   3. Pruebe diferentes objetivos ópticos y posiciones del detector, así, pero tenga cuidado con la complicación que esto presenta al tratar de optimizar los parámetros de escaneo.
8. Compruebe cada orientación de la muestra para asegurarse de que no hay bloqueos para encontrar el mejor tiempo de exposición. Esto se realiza debido al cambio de distancia de trabajo, tamaño de píxel y posición de la muestra.
9. Gire lentamente la muestra en incrementos de 2 grados mientras supervisa su posición en relación con la fuente y el detector a través de la cámara en el gabinete. Asegúrese de alejar la fuente y el detector si se produce una colisión.
10. Encuentre la longitud de trayecto de rayos X más larga que da como resultado el menor número de recuentos/valores de transmisión y encuentre el tiempo de exposición necesario para asegurar alrededor de 5000 recuentos en todas partes.

3. Presentación y Reconstrucción de Tomografías

El proceso de reconstrucción desde la perspectiva del usuario no es más complicado que cualquiera de las otras selecciones de parámetros realizadas en los pasos anteriores. Sin embargo, el gasto de programación y computación para este proceso es realmente bastante sustancial. Los usuarios deben apuntar a entender mejor lo que está sucediendo debajo de la interfaz de usuario de software suave y cómo las decisiones afectan al producto final. Muchos sistemas de TC utilizan algoritmos de reconstrucción algebraica iterativa en los que las proyecciones 2D se convierten en una serie de ecuaciones lineales que describen los valores de píxel. Algunos otros sistemas utilizan algoritmos de proyección de retroceso filtrados donde radon transforma convierte las proyecciones en un sinogram y luego se pasan a través de una serie de operaciones de integración de línea. Por supuesto, algunos utilizan otros enfoques e incluso métodos híbridos. En el nivel más bajo de implicación con estos algoritmos, se sabe que el número de proyecciones y el desplazamiento rotado total tienen un impacto en el volumen reconstruido final.

1. En primer lugar, decida si desea escanear más de 180o o 360o en función de la relación de aspecto de la muestra. Si la muestra tiene una relación de aspecto alta, de modo que la longitud de la ruta de rayos X sea aproximadamente 4 o más veces más larga en la orientación de 90o que la orientación de 0o que una exploración de 180o sería una opción inteligente. (El argumento es que la información recopilada en la longitud corta del trayecto de rayos X no es tan diferente de un lado al otro. Si se pueden dedicar más proyecciones a las orientaciones de longitud de trayecto de rayos X largos que el conjunto de datos. El desplazamiento angular entre las proyecciones será menor y habrá más información de esas orientaciones complicadas que se introducen en los algoritmos de reconstrucción.) Si la relación de aspecto no es tan alta, utilice escaneos de 360o.
2. A continuación, elija el número de proyecciones y el desplazamiento angular total, que dictará el ángulo entre las proyecciones. Cuanto menor sea este ángulo, menos interpolación se llevará a cabo y se truncará la información de entidad menos fina. (Se debe establecer un equilibrio porque más proyecciones significan un tiempo de exploración más largo, que se correlaciona con una ventana más grande donde las muestras se pueden mover, menos tiempo para escanear otras cosas y una vida útil de origen más corta. Una regla general es tener al menos 800 proyecciones de más de 360o y no superar las 3200 proyecciones.
3. Envíe el análisis.
4. Después de que la tomografía haya terminado (generalmente entre 4 y 16 horas), lleve la serie 2D de imágenes al software de reconstrucción del sistema (o algún código abierto).
5. Seleccione la corrección óptima del cambio central. El cambio central es un parámetro que alinea los proyectos para alinearse (piense en una baraja de cartas más o menos barajada que necesitan ser recogidas y alineadas para sentarse como una pila ordenada). Este valor suele estar entre -10 y 10 píxeles.
6. Seleccione el coeficiente de corrección de endurecimiento de haz óptimo. La corrección de endurecimiento de la viga es una eliminación artificial del contraste producida por el filtrado de muestras. Si una muestra es lo suficientemente gruesa o contiene una gama de materiales ligeros y pesados, tendrá un falso contraste basado en la atenuación de rayos X de baja energía (blandos). Esto debe aplicarse de forma conservadora. Un valor medio está en algún lugar entre 0 - 0.5.
7. Presentar reconstrucción.

Las siguientes imágenes ofrecen una visión general de los resultados que se pueden obtener mediante el uso de micro-CT con el procedimiento indicado anteriormente. Las mediciones cualitativas sobre la absorción variable se pueden observar directamente en función de estas imágenes. Los datos cuantitativos, como la porosidad del material, el tamaño y la distribución de las funciones, etc., requerirían un procesamiento de imágenes adicional en un software diferente.

Figura 3: Volumen 3D de la médula espinal del ratón (izquierda) y dos rebanadas transversales digitales (derecha)

Este experimento examinó los muchos factores que deben tenerse en cuenta al utilizar micro-CT, particularmente para una muestra biológica. Este proyecto fue diseñado para ayudar al investigador a entender cómo sus decisiones afectarán los datos que micro-CT puede proporcionar. Como se ha demostrado, hay muchos parámetros dependientes y sensibles que deben tenerse en cuenta, entre ellos: montaje, energía de rayos X, tiempo de exposición, posicionamiento de la fuente y del detector, número de proyecciones y desplazamiento angular total del escaneo. Este ejercicio se entiende como una introducción y solo rasca la superficie de control sobre un conjunto de datos de TC.

Este experimento se centró en dar una introducción a la micro-TC con respecto a la toma de imágenes de una muestra biológica, pero la aplicación de la tomografía de rayos X 3D se extiende a los mundos de la microelectrónica, geología, fabricación aditiva, recubrimientos, células de combustible, y mucho más . Estos microscopios se utilizan para inspección, análisis de fallos, caracterización, control de calidad e incluso pruebas no destructivas. Dado que la información 3D real ahora es accesible de forma no destructiva, las geometrías extraídas de CT se pueden importar a simulaciones donde los objetos se pueden probar virtualmente.

1. http://www.spectroscopyonline.com/tutorial-attenuation-X-rays-matter [cited 1 November 2017]
2. http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/quantum/xrayc.html [cited 1 November 2017]
3. A.G. Rao, V.P. Deshmukh, L. L. Lavery, H. Bale, "3D investigation of the microstructural modification in hypereutetic aluminum silicon (Al-30Si) alloy." Microscopy and Analysis 2017 [cited 1 November 2017].