Método de adición estándar

Fuente: Laboratorio del Dr. Pablo Bower - Universidad de Purdue

El método de adiciones estándar es un método de análisis cuantitativo, que a menudo se utiliza cuando la muestra de interés tiene varios componentes que resultan en efectos de matriz, donde los componentes adicionales pueden reducir o aumentar la señal de absorbancia del analito. Resulta en errores significativos en los resultados del análisis.

Adiciones estándar se usan para eliminar efectos de matriz de una medición, puesto que se asume que la matriz afecta a todas las soluciones igual. Además, se utiliza para corregir la química fase separaciones realizadas en el proceso de extracción.

El método se realiza mediante la lectura de la intensidad (en este caso fluorescente) experimental de la solución desconocida y luego midiendo la intensidad de lo desconocido con cantidades variables de estándar conocido añadido. Los datos se trazan como fluorescencia intensidad vs. la cantidad del estándar añadido (lo desconocido, con ningún estándar añadido, se traza en el eje y). La línea de mínimos cuadrados se cruza con el eje x en el negativo de la concentración de lo desconocido, como se muestra en la figura 1.

Figura 1. Representación gráfica del método de adición estándar de.

En este experimento, el método de adiciones estándar se demuestra como una herramienta analítica. El método es un procedimiento para el análisis cuantitativo de una especie sin la generación de una curva de calibración típica. Análisis de la adición estándar se logran midiendo intensidad espectroscópica antes y después de la adición de precisa alícuotas de una solución estándar conocida del analito.

Este experimento estudia las especies no fluorescentes por reaccionar de tal manera que forma un complejo fluorescente. Este enfoque se usa comúnmente en la investigación de los iones del metal. Iones de aluminio (Al^{3 +}) se determinará mediante la formación de un complejo con 8-hidroxiquinoleína (8HQ). Al^{3 +} se precipita por 8HQ de la solución acuosa y luego es extraído en cloroformo; la fluorescencia de la solución de cloroformo es medida y relacionado con la concentración de la solución^{3 +} Al original. Sensibilidad en el rango de parte por millón (ppm o μg/mL) se espera que para este experimento.

La reacción es

La cantidad de aluminio en cada muestra durante este experimento se calcula como sigue:

En blanco	0
Desconocido + 0 mL estándar	Vdesconocida(Cdesconocido) = 25 mL (Cdesconocido)
Desconocido + 1 mL estándar	Vdesconocida(Cdesconocido) + Vestándar(Cestándar) = 1 mL (1 μg/mL) 25 mL (Cdesconocido)
Desconocido + 2 mL estándar	V Desconocido (Cdesconocido) + V Estándar (Cestándar) = 25 mL (Cdesconocido) + 2 mL (1 μg/mL)
Desconocido + 3 mL estándar	V Desconocido (Cdesconocido) + V Estándar (Cestándar) = 25 mL (Cdesconocido) + 3 mL (1 μg/mL)
Desconocido + 4 mL estándar	V Desconocido (Cdesconocido) + V Estándar (Cestándar) = 25 mL (Cdesconocido) + 4 mL (1 μg/mL)

1. preparación de los reactivos

1. Al^{3 +} solución estándar de 100 ppm: disolver 0,9151 g de nitrato básico de aluminio (Al (NO₃)₃•9H₂O) en un matraz aforado de 1 L con agua desionizada.
2. Solución de 8HQ en 1 M de ácido acético (2% peso/vol): Añadir a un matraz aforado de 100 mL 2,0 g de 8-hidroxiquinoleína.
3. Cuidadosamente añadir 5,74 mL ácido acético glacial al matraz de 100 mL y diluir hasta la marca con agua desionizada. Esto permite que la 8-hidroxiquinoleína disolver en la fase acuosa.
4. 1 M NH₄⁺/NH₃ almacenador intermediario (pH ~ 8): Añadir 20 g de acetato de amonio (NH₄OAc) a una botella de 100 mL.
5. Agregar 7 mL de hidróxido de amonio 30% a esta botella de 100 mL y diluir hasta la marca con agua desionizada. Esto ayuda a neutralizar el ácido en la solución de 8HQ cuando se combinan.
6. Otros reactivos incluyen sulfato de sodio anhidro (Na₂SO₄) y cloroformo (grado de especificaciones).

2. preparación de las muestras

1. Preparar una 1,00 ppm solución patrón de Al^{3 +} al añadir 1,0 mL del stock 100 ppm Al^{3 +} solución con una pipeta a un matraz aforado de 100 mL.
2. Coloque seis 125 mL embudos separatory en los anillos que están en un soporte de anillo grande situado en la campana. Debe etiquetarse como sigue: BL, 0, 1, 2, 3, 4. Asegúrese de que toda la cristalería esté escrupulosamente limpia, ya que es difícil obtener resultados cuantitativos si poco gotas de cloroformo se pegan a las paredes del vidrio.
3. Agregar 25,00 mL de la solución de Al^{3 +} desconocida a los cinco embudos separatory etiquetado como 0, 1, 2, 3, & 4. En este ejemplo, la concentración desconocida es 0,110 ppm.
4. Añadir 0, 1.00, 2.00, 3.00 y 4,00 mL de la 1,00 ppm Al^{3 +} solución estándar, respectivamente, a los 5 embudos con una pipeta de 1 mL.
5. Preparar un espacio en blanco añadiendo 25,00 mL de agua destilada en el matraz etiquetado BL.
6. Añadir 1,0 mL de la solución de 8-hidroxiquinoleína con una pipeta a cada uno de las seis soluciones.
7. Añadir 3,0 mL de solución tampón con una pipeta a cada uno de las seis soluciones.
8. Extraiga cada solución dos veces con 10 mL de cloroformo, agitando vigorosamente durante 1 minuto cada vez. No olvide ventilar de vez en cuando el embudo para liberar la acumulación de presión. (Nota: una buena extracción sólo ocurre cuando hay mucho líquido-líquido de contacto entre las fases).
9. Recoger el cloroformo en un matraz 100 mL etiquetado de limpio y seco. Cloroformo tiene una densidad de cerca de 1.5 g/cm³, por lo que es la capa más baja. No debería haber ningún rastro de izquierda de color amarillo en la fase acuosa después de una extracción completa.
10. Transferir el extracto cloroformo combinada de cada vaso en su respectivo matraz aforado de 25 mL y diluir hasta la marca con cloroformo. Asegúrese de colocar tapones en cada Fiola para evitar cualquier cloroformo se evapora.
11. Añadir ~ 1 g de sulfato de sodio anhidro (Na₂SO₄) a cada uno de los seis vasos de 100 mL en el paso 2.9. El sulfato de sodio ayuda a eliminar cualquier rastro de agua que puede estar presente en el extracto de cloroformo.
12. Transferir las soluciones a sus vasos respetados. Agitar cuidadosamente para facilitar la deshidratación de agua en la muestra.
13. Decantar los extractos de cloroformo en una celda de cuarzo Fluorímetro (Nota: cloroformo disolverá un plástico poliestireno celular).

3. seleccionar la longitud de onda de excitación

Determinar las longitudes de onda de excitación y emisión ejecutando exploraciones, entonces simplemente leer y registrar la intensidad de fluorescencia de las muestras en los valores. Los anchos de banda de excitación y emisión preajustados de 5 nm. El complejo absorbe en el UV cercano, así que la longitud de onda de excitación debe ser alrededor de 385 nm. Al principio, controlar la fluorescencia de 500 nm en la rama de la emisión.

1. En el Fluorímetro, verifique que ambos el interiores y exteriores los ventiladores en el Fluorímetro son encendidos antes de encender la lámpara de xenón. La lámpara de xenón se calienta mucho y requiere refrigeración continua.
2. Encenderá el alto voltaje (HV) para el detector PMT a 400 V.
3. Abra ambos de las persianas.
4. Abrir el programa de adquisición de datos en la computadora, aquí es "100nmFluorScan".
5. Coloque el "muestra + 2 mL agregado" (2) solución en la celda de cuarzo para determinar las longitudes de onda de excitación y emisión mejor.
6. Con la longitud de onda de emisión establecido inicialmente a 500 nm, ejecutar un análisis de excitación de 335-435 nm con una velocidad de exploración de 2 nm/s.
7. De la parcela resultante de la fluorescencia, determinar la máxima longitud de onda de excitación de la fluorescencia (EXλ_max) y ajustar el instrumento a ese valor.

4. seleccionar la longitud de onda de emisión

1. Seleccionar la longitud de onda de Fluorímetro emisión a 450 nm.
2. Establecer el rango de longitud de onda de emisión para ejecutar una exploración de nm 100 de 450-550 nm.
3. Para iniciar la exploración, haga clic en el botón "iniciar prueba" en el programa al mismo tiempo de pulsar el botón "START" en el panel frontal de la Fluorímetro.
4. De la parcela resultante de la fluorescencia, determinar la fluorescencia máxima emisión de longitud de onda (EMλ_max) y ajustar el instrumento a ese valor (figura 2).

Figura 2. Determinar el óptimo EXλ_máximo y EMλ_max longitudes de onda.

5. medición de la fluorescencia de las muestras

1. Todas las muestras van a_max EMλ y_maxEXλ. Las exploraciones no son necesarios para cada muestra, pero sólo el valor de la fluorescencia en estas condiciones. A partir de la muestra más diluida (en blanco), coloque en una celda de cuarzo y luego en el instrumento. Registrar la intensidad fluorescente en el cuaderno de laboratorio.
2. Repita para el resto de las muestras.
3. Recuerde que la intensidad relativa en blanco debe restarse de las intensidades relativas de cada solución antes de crear el cuadro de calibración.

6. creación de la trama de la adición estándar

1. Parcela la intensidad de fluorescencia vs μg de Al^{3 +} añadido.
2. Determinar el valor de mínimos cuadrados de la parcela resultante y registrar la pendiente y el intercepto.
3. Determinar los μg de Al^{3 +} en la muestra desconocida de la ecuación μg de Al^{3 +} = -b/m
4. Sabiendo que el aluminio desconocido tenía un volumen de 25,0 mL agrega a cada muestra, determinar la concentración de aluminio en lo desconocido.

Una exploración de la longitud de onda de excitación de 335-435 demostró la absorción más alta en 399 nm, por lo que el monocromador de excitación fue fijado para ese valor. Luego se realizó la exploración de la emisión de 450-550 nm, y la señal más fuerte fue encontrada para ser a 520 nm. Estas son las longitudes de onda que se utilizan para todas las muestras.

Muestra	Intensidad de fluorescencia	Intensidad de fluorescencia corregida
En blanco	0.008	0.000
Muestra	0.128	0.120
Muestra + 1 mL	0,167	0.159
Muestra + 2 mL	0.220	0.212
Muestra + 3 mL	0.260	0.252
Muestra + 4 mL	0.290	0.282

Una parcela de fluorescencia (figura 3) vs μg de Al^{3 +} añadido (figura 4) produjo una línea de mínimos cuadrados de:

Intensidad de fluorescencia = 0.0417 x (μg Al^{3 +} añadido) + 0.1216

Cantidad de Al^{3 +} =-(Y-Int)/pendiente =-0.1216/0.0417 =-2.916 μg/mL

Puesto que la cantidad de desconocido añadido fue de 25 mL, entonces el valor de 2.916 μg/mL debe ser dividido por 25.

Concentración de aluminio desconocido = 2.916 μg/mL / mL = 0.117 25,0 μg/mL = 0,117 ppm
que es bastante cercano al valor real de 0,110 ppm (6.4% error).

Figura 3. Fluorescencia de las muestras.

Figura 4. El diagrama de calibración de adición estándar.

El método de adiciones estándar es a menudo la técnica utilizada cuando se desean resultados cuantitativos precisos, utilizado en Análisis analítico como absorción atómica, espectroscopia de fluorescencia, ICP-OES y cromatografía de gases. Esto se suele usar cuando hay otros componentes en la muestra del interés que provoca una reducción o aumento de la absorbancia para resultados cuantitativos. Cuando esto sucede, simplemente uno no puede comparar la señal de analitos usando el enfoque de la curva de calibración tradicional. De hecho, evaluación del efecto de matriz debe ser una parte obligatoria del procedimiento de validación.

Otro ejemplo donde pueden utilizarse adiciones estándar es cuando la extracción de plata de residuos fotográficos antiguos. La basura contiene Haluros de plata y puede ser extraída para que la plata puede ser reclamada. Por clavar la desconocida "los residuos" con cantidades conocidas de plata, este método puede predecir la cantidad de plata obtenida de la película fotográfica.

Los trabajadores expuestos a benceno fabricación plantas a menudo son probados para verificar con seguridad debajo de los niveles aceptados de benceno. La orina es la prueba de la química, y es la matriz biológica. También, la cantidad de analito supresión varía para diferentes personas, por lo que un kit de calibración único no funcionará. Con el método de adición estándar, cada empleado puede ser probado y evaluado con precisión.