Un modelo simplificado para el trasplante heterotópico de válvulas cardíacas en roedores

Este protocolo describe un método simple y eficiente para el trasplante de valvas de la válvula aórtica debajo de la cápsula renal para permitir el estudio de la alorreactividad de las válvulas cardíacas.

Existe una necesidad clínica urgente de reemplazos de válvulas cardíacas que puedan crecer en los niños. El trasplante de válvula cardíaca se propone como un nuevo tipo de trasplante con el potencial de entregar válvulas cardíacas duraderas capaces de crecimiento somático sin necesidad de anticoagulación. Sin embargo, la inmunobiología de los trasplantes de válvulas cardíacas sigue sin explorarse, lo que pone de relieve la necesidad de modelos animales para estudiar este nuevo tipo de trasplante. Se han descrito modelos previos de ratas para el trasplante heterotópico de válvula aórtica en la aorta abdominal, aunque son técnicamente desafiantes y costosos. Para abordar este desafío, se desarrolló un modelo de trasplante subcapsular renal en roedores como un método práctico y más sencillo para estudiar la inmunobiología del trasplante de válvula cardíaca. En este modelo, se cosecha una sola valva de la válvula aórtica y se inserta en el espacio subcapsular renal. El riñón es de fácil acceso, y el tejido trasplantado está contenido de forma segura en un espacio subcapsular que está bien vascularizado y puede acomodar una variedad de tamaños de tejido. Además, debido a que una sola rata puede proporcionar tres valvas aórticas de donantes y un solo riñón puede proporcionar múltiples sitios para el tejido trasplantado, se requieren menos ratas para un estudio determinado. Aquí, se describe la técnica de trasplante, que proporciona un importante paso adelante en el estudio de la inmunología del trasplante de válvula cardíaca.

Los defectos cardíacos congénitos son la discapacidad congénita más común en los seres humanos, que afecta a 7 de cada 1.000 niños nacidos vivos cada año¹. A diferencia de los pacientes adultos en los que se implantan rutinariamente varias válvulas mecánicas y bioprotésicas, los pacientes pediátricos actualmente no tienen buenas opciones para el reemplazo de válvulas. Estos implantes convencionales no tienen el potencial de crecer en los niños receptores. Como resultado, se requieren reoperaciones mórbidas para intercambiar los implantes de válvulas cardíacas por versiones sucesivamente más grandes a medida que los niños crecen, y los niños afectados a menudo requieren hasta cinco o más cirugías a corazón abierto en su vida ^2,3. Los estudios han demostrado que la ausencia de intervención o muerte es significativamente pobre para los bebés que para los niños mayores, con el 60% de los bebés con válvulas cardíacas protésicas que enfrentan una nueva operación o la muerte dentro de los 3 años posteriores a su operación inicial⁴. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de administrar una válvula cardíaca que pueda crecer y mantener la función en pacientes pediátricos.

Durante décadas, los intentos de ofrecer reemplazos de válvulas cardíacas en crecimiento se han centrado en la ingeniería de tejidos y las células madre. Sin embargo, los intentos de trasladar estas válvulas a la clínica han sido infructuosos hasta ahora 5,6,7,8. Para abordar esto, un trasplante de válvula cardíaca se propone como una operación más creativa para administrar reemplazos de válvulas cardíacas en crecimiento que tienen la capacidad de autorrepararse y evitar la trombogénesis. En lugar de trasplantar todo el corazón, solo se trasplanta la válvula cardíaca y luego crecerá con el niño receptor, similar a los trasplantes de corazón convencionales o un autógrafo pulmonar de Ross ^9,10,11. Después de la operación, los niños receptores recibirán inmunosupresión hasta que la válvula trasplantada pueda cambiarse por una prótesis mecánica de tamaño adulto cuando ya no se requiera el crecimiento de la válvula. Sin embargo, la biología del trasplante de los injertos de trasplante de válvula cardíaca permanece inexplorada. Por lo tanto, se necesitan modelos animales para estudiar este nuevo tipo de trasplante.

Se han descrito previamente varios modelos de ratas para el trasplante heterotópico de la válvula aórtica en la^{aorta abdominal} 12,13,14,15,16,17,18. Sin embargo, estos modelos son prohibitivamente complicados, a menudo requieren cirujanos capacitados para operar con éxito. Además, son costosos y requieren mucho tiempo¹⁹. Se desarrolló un nuevo modelo de rata para crear un modelo animal más simple para estudiar la inmunobiología de los trasplantes de válvulas cardíacas. Las valvas de la válvula aórtica única se extirpan y se insertan en el espacio subcapsular renal. El riñón es especialmente adecuado para estudiar el rechazo del trasplante, ya que está altamente vascularizado con acceso a células inmunes circulantes^20,21. Mientras que varios otros han utilizado un modelo subcapsular renal para estudiar la biología del trasplante de otros trasplantes de aloinjertos como páncreas, hígado, riñón y córnea ^{22,23,24,25,26,27}, esta es la primera descripción del trasplante de tejido cardíaco en esta posición. Aquí, se describe la técnica de trasplante, que proporciona un importante paso adelante en el estudio de la inmunología del trasplante de válvula cardíaca.

El estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Animal siguiendo la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Información sobre el modelo animal (Ratas)

1. Use un microscopio quirúrgico (consulte la Tabla de materiales) con un aumento de hasta 20x para todos los procedimientos quirúrgicos.
2. Use cepas singénicas (como Lewis-Lewis) o alogénicas (como Lewis-Brown Norway) para los trasplantes según sea necesario para el experimento.
3. Use ratas de edad entre 5-7 semanas y peso corporal de 100-200 g que sean apropiadas para la pregunta experimental.

2. Eliminación del pelaje, preparación de la piel y anestesia

1. Realizar todas las operaciones en condiciones estériles.
   NOTA: El paso se realiza en un espacio quirúrgico dedicado y en condiciones estériles.
2. Coloque las ratas en una cámara de inducción anestésica e induzca la anestesia con 5% de isoflurano en oxígeno. Mantener la anestesia con isoflurano al 3,5% en oxígeno durante todo el procedimiento.
3. Para la operación del donante, retire el pelaje de la rata del ombligo a la muesca esternal usando cortadores de piel. Para la operación de receptor, recorte el cabello sobre el campo quirúrgico en la línea axilar posterior desde las costillas hasta la pelvis. A continuación, prepare la piel con un desinfectante quirúrgico.
4. Obtenga un plano quirúrgico de anestesia antes de comenzar el procedimiento. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia comprimiendo firmemente los dedos de los pies de la rata con fórceps. Si la rata se retira al dolor, titule el anestésico según sea necesario.
5. Controlar clínicamente la frecuencia respiratoria y la profundidad de la anestesia durante todo el procedimiento; el nivel de isoflurano se ajusta según sea necesario para mantener una frecuencia respiratoria de 55-65 respiraciones/min.

3. Operación del donante

1. Prepare y anestesia a la rata como se indica en el paso 2. Incise la piel desde el xifoide hasta la muesca esternal usando tijeras de disección. Realice una esternectomía cortando las costillas de cada lado lateral al esternón hasta lograr un acceso óptimo al corazón.
2. Heparinizar la rata con una inyección de 100 U/100 g en la aurícula izquierda.
3. Sacrificar al donante a través de la exsanguinación.
4. Extirpa el timo para mejorar la visualización de los grandes vasos. Luego, retire el corazón en bloque con la aorta ascendente hasta el nivel de la arteria innominada.

4. Preparación de valvas de la válvula aórtica

1. Coloque el corazón del donante en una placa de Petri estéril inmediatamente después de la cardiectomía. Diseccionar el corazón del donante en un tampón de almacenamiento frío helado (ver Tabla de Materiales).
2. Usando fórceps y tijeras de resorte Vannas, diseccionar el corazón del donante hasta que solo quede la raíz aórtica con un manguito ventricular de 1 mm proximal a la válvula aórtica.
3. Abra la válvula aórtica haciendo un corte longitudinal para abrir el seno de Valsalva entre los senos izquierdo y no coronario para visualizar las tres valvas.
   NOTA: El corte debe ser de toda la longitud del Seno de Valsalva. Las dimensiones reales dependen del tamaño de la rata.
4. Extirpar cada valva de la válvula aórtica individualmente. Específicamente, use fórceps contundentes para agarrar el borde del folleto y use tijeras de resorte Vannas para extirpar el folleto cortando desde una comisura hasta el anillo, y luego hacia la siguiente comisura.
   NOTA: Tenga especial cuidado de agarrar solo el borde de la valva para minimizar la interrupción de las células endoteliales valvulares.
5. Almacene las muestras después de la escisión del prospecto en una solución tampón de almacenamiento en frío hasta que estén listas para ser implantadas en la rata receptora. Implante todos los prospectos dentro de las 4 h posteriores al almacenamiento en frío.

5. Operación del destinatario

1. Prepare y anestesia a la rata como se indica en el paso 2. Use una almohadilla térmica mantenida a 36-38 ° C para realizar la cirugía.
2. Administrar buprenorfina (0,03 mg/kg por vía subcutánea) a todas las ratas receptoras antes de la cirugía y cada 6-12 h después de la operación según sea necesario para aliviar el dolor.
3. Coloque la rata en una posición recostada lateral derecha para acceder al riñón izquierdo.
   NOTA: Se prefiere el riñón izquierdo debido a su posición más caudal en relación con el riñón derecho.
4. Incise la piel sobre el flanco longitudinalmente sobre 1 pulgada usando tijeras.
   NOTA: La incisión debe permanecer más pequeña que el tamaño del riñón para proporcionar suficiente tensión para evitar que el riñón se retraiga de nuevo en la cavidad abdominal durante el procedimiento.
5. Del mismo modo, incise la pared abdominal subyacente.
6. Externalizar el riñón
   1. Usando el pulgar y el índice, aplique una ligera presión dorsal y ventral mientras usa fórceps curvos para levantar el polo caudal del riñón a través de la incisión abdominal y cutánea. Exteriorice el extremo craneal del riñón de manera similar.
   2. Alternativamente, el riñón puede exteriorizarse agarrando la grasa perirrenal y tirando hacia arriba con ligera tensión.
      NOTA: Tenga cuidado de no agarrar el riñón o los vasos renales directamente.
   3. Una vez que el riñón está externalizado, manténgalo húmedo con solución salina tibia goteada sobre el riñón.
7. Cree un bolsillo subcapsular.
   1. Aplique ligeramente presión a la cápsula renal usando un juego de fórceps contundentes para que la cápsula renal pueda distinguirse claramente del parénquima subyacente. Simultáneamente usando otro juego de pinzas romas, agarre cuidadosamente la cápsula y tire suavemente hacia arriba para crear un agujero en la cápsula.
      NOTA: Debido a la naturaleza delicada de la cápsula, se requiere una fuerza mínima para establecer esta incisión.
   2. Continúe usando pinzas romas para extender la incisión hasta que se haya creado un espacio de ~ 2 mm para acomodar la valva de la válvula aórtica.
   3. Desarrolle una bolsa subcapsular poco profunda que sea ligeramente más grande que la valva de la válvula mientras levanta el borde de la incisión con un juego de fórceps y avanza una sonda roma debajo de la cápsula renal.
8. Trasplante la válvula aórtica en la bolsa subcapsular.
   1. Recupere la valva aórtica del almacenamiento en frío y colóquela en el campo quirúrgico.
   2. Mientras levanta la cápsula fibrosa de borde, avance la valva aórtica hacia el bolsillo subcapsular con fórceps contundentes.
      NOTA: Asegúrese de que el tejido esté lo suficientemente lejos de la incisión para que esté firmemente asegurado debajo de la cápsula. Se debe tener cuidado para evitar daños en el parénquima subyacente o un mayor desgarro de la cápsula fibrosa.
   3. La incisión en la cápsula renal se puede dejar abierta.
9. Empuje el riñón suavemente hacia atrás a su posición anatómica utilizando la contratracción aplicada a los bordes de la incisión.
10. Cierre la incisión abdominal con una sutura quirúrgica estéril en ejecución. Cierre la piel con grapas.
11. Cuidados postoperatorios
    1. Después de la operación, coloque a la rata en una jaula limpia en una almohadilla térmica con acceso a alimentos y agua.
    2. Monitoree al animal diariamente para evaluar la cicatrización rutinaria de heridas y los signos de dolor o angustia. Retire las grapas después de 7-10 días.

6. Recolección de tejido para análisis

1. En los puntos finales seleccionados después del trasplante, eutanasiar al animal por exsanguinación. En concreto, realizar una laparotomía mediana y transectar la aorta abdominal por debajo del 5% de isoflurano en oxígeno.
2. Movilice el riñón y apóselo cortando la arteria renal, la vena y el uréter con tijeras.
   NOTA: Tenga cuidado de no agarrar el área que contiene el prospecto trasplantado.
3. Coloque el riñón en formalina durante la noche, intégrelo en parafina y seccionarlo para la tinción deseada. Oriente la muestra con la cápsula renal mirando hacia atrás y el parénquima renal hacia atrás.

Se proporciona una representación gráfica del diseño experimental para el modelo de rata (Figura 1). Además, en la Figura 2 también se muestra una raíz aórtica diseccionada del corazón del donante y una valva de válvula aórtica individual preparada para la implantación. A continuación, se muestra una imagen representativa de la posición de la valva de la válvula aórtica debajo de la cápsula renal para la implantación en la Figura 3A y después de 3, 7 y 28 días dentro de la rata receptora (Figuras 3B-D), lo que demuestra la facilidad de localizar y recuperar el tejido trasplantado.

Las valvas de la válvula aórtica conservan su arquitectura nativa después del trasplante heterotópico en animales singénicos, lo que demuestra la utilidad de este modelo como línea de base para comparar la respuesta inmune en trasplantes alogénicos. Específicamente, la histología con tinción de hematoxilina y eosina (H&E) reveló que las valvas valvulares en trasplantes singénicos después de 7 días estaban estructuralmente intactas sin signos de hinchazón edematosa (Figura 4A). La integridad estructural de la valva valvular fue confirmada por inmunohistoquímica para la actina alfa del músculo liso (aSMA) y CD31 (Figura 4B).

Figura 1: Diseño experimental del trasplante heterotópico de la válvula aórtica bajo la cápsula renal en ratas. El corazón se recoge de la rata donante (A). Las valvas de la válvula aórtica se diseccionan y se mantienen en almacenamiento en frío (B) hasta el proceso de implantación debajo de la cápsula renal en la rata receptora (C). Los folíolos se explantan en puntos de tiempo establecidos y se analizan microscópicamente (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Preparación de la valva valva aórtica para la implantación. Ejemplo de una raíz aórtica diseccionada del corazón donante (A) y disección adicional de una valva de la válvula aórtica para la implantación (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Visualización de la valva valvular aórtica bajo la cápsula renal. La valva de la válvula aórtica se visualiza debajo de la cápsula renal en la implantación (A), después de 3 (B), 7 (C) y 28 días (D) en animales singénicos y después de 3 (E), 7 (F) y 28 días (G) en animales alogénicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Las valvas de la válvula aórtica permanecen estructuralmente intactas después del trasplante bajo la cápsula renal durante 7 días en animales singénicos. La fila superior muestra la tinción de H&E y la inmunotinción para DAPI, aSMA y CD31 para las válvulas cardíacas de control que se adquirieron pero no se trasplantaron. La fila inferior muestra tinción de H&E e e inmunotinción para DAPI, aSMA y CD31 en un prospecto de válvula singénica explantado después de 7 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Importancia y aplicaciones potenciales
Si bien las válvulas cardíacas mecánicas y bioprotésicas se usan rutinariamente en pacientes adultos que requieren reemplazo de válvulas, estas válvulas carecen del potencial de crecimiento y, por lo tanto, no son óptimas para los pacientes pediátricos. El trasplante de válvula cardíaca es una operación experimental diseñada para administrar reemplazos de válvulas cardíacas en crecimiento para neonatos y bebés con enfermedad cardíaca congénita. Sin embargo, a diferencia de la inmunobiología de trasplante de los trasplantes de corazón convencionales, la inmunobiología de trasplante de este nuevo tipo de trasplante sigue siendo poco explorada. Aquí, se describe un modelo único de rata para el trasplante renal subcapsular de valvas de la válvula aórtica, que proporciona un paso significativo hacia adelante en el estudio de la inmunobiología del trasplante de válvula cardíaca.

El espacio subcapsular renal proporciona un ambiente óptimo para estudiar la inmunobiología del trasplante de las válvulas cardíacas. El tejido trasplantado está contenido de forma segura en un lugar bien vascularizado con acceso a células inmunes circulantes²⁰. Además, los modelos subcapsulares se han utilizado previamente con éxito para probar el rechazo del aloinjerto en muchos tejidos como el páncreas, el hígado, el riñón y los otros tipos de células 22,23,24,25,26,27, lo que indica que este modelo está justificado en el estudio de la inmunogenicidad de las valvas de la válvula aórtica.

Este modelo tiene varias aplicaciones protenticales para el estudio de la inmunología del trasplante de válvulas aórticas. En primer lugar, el modelo se puede utilizar para determinar el nivel de inmunosupresión sistémica requerida para el trasplante de válvulas cardíacas para prevenir el rechazo del injerto, como tacrolimus, micofenolato y esteroides. Además, varios estudios han indicado que el tejido valvular puede ser inmunológicamente distinto de otro tejido cardíaco, ya que las válvulas se salvan relativamente durante el rechazo fulminante de los trasplantes de corazón convencionales 28,29,30. Este modelo permite la exploración de este concepto, ya que el espacio subcapsular puede acomodar varios tipos de tejidos, como la valva valvular y el miocardio, para comparar la inmunogenicidad de estos tejidos.

Este modelo es ventajoso porque es técnicamente sencillo, rápido y tiene una alta tasa de supervivencia con un bajo riesgo de complicaciones. Debido a que cada donante puede proporcionar tres valvas de la válvula aórtica, una rata puede servir como donante para tres receptores diferentes. En promedio, la duración de la operación del donante fue de 27,2 min (n = 12), y la duración de la operación del receptor fue de 29,7 min (n = 36). La tasa de supervivencia de la operación del receptor fue del 97,2% (n = 35/36), con una muerte intraoperatoria por depresión respiratoria. Se observó un sangrado mínimo debido a un traumatismo en el parénquima renal mientras se creaba la bolsa subcapsular en el 11,1% de las operaciones del receptor. Sin embargo, el sangrado se controló fácilmente en todos los casos con la compresión de un aplicador de punta de algodón. Una muestra fue desalojada del espacio subcapsular y no se recuperó tras la explicación incluso después de 7 días.

Anteriormente, las valvas de la válvula se explantaban sacándolas del espacio subcapsular y se incrustaban, seccionaban y teñían sin ningún tejido aórtico adherido. Sin embargo, este método es subóptimo ya que los folletos en sí son extremadamente pequeños, delgados y transparentes, lo que resulta en la pérdida de varias muestras en el procesamiento. En su lugar, se recomienda extraer el riñón en bloque e incrustar y seccionar el tejido mientras aún se asegura debajo de la cápsula renal para garantizar que no se pierdan muestras. Además, este enfoque minimiza el trauma y la manipulación del prospecto.

Pasos críticos
Los pasos críticos del procedimiento son establecer un plano quirúrgico de anestesia, incisión de la pared abdominal sobre los riñones, evisceración del riñón, elevación del colgajo subcapsular, inserción del tejido de trasplante heterotópico, obtención de hemostasia, retorno del riñón a la posición anatómica y cierre de la piel.

Modificaciones y solución de problemas
Si bien esta es la primera descripción del trasplante de tejido cardíaco bajo la cápsula renal, varios otros han descrito el trasplante de otros tipos de tejido en el espacio subcapsular renal 20,22,23,24,25,26,27. En este protocolo, se realizaron pequeños ajustes a los modelos subcapsulares anteriores para optimizar la técnica y minimizar las complicaciones. Específicamente, mientras que otros han recomendado el uso de tijeras de resorte Vannas para hacer la incisión inicial en la cápsula renal^20,26, es más probable que este método cause un traumatismo en el parénquima subyacente y resulte en la formación de hematomas subcapsulares. Demasiado sangrado resultará en la distensión de la cápsula y comprometerá la seguridad del trasplantado²⁶. Por lo tanto, se deben usar fórceps contundentes para abrir la cápsula. Además, mientras que algunos protocolos abogan por la colocación de productos comerciales con propiedad homostática sobre la incisión capsular^26,31, este paso es innecesario siempre y cuando el tejido esté lo suficientemente avanzado en el bolsillo subcapsular.

En ratas más grandes, el riñón puede estar cubierto de grasa perirrenal, y la externalización del riñón a través del levantamiento con fórceps curvos puede no ser factible. En estos casos, lo mejor es exteriorizar el riñón tirando suavemente de la grasa perirrenal con fórceps y sacando el riñón de la cavidad abdominal sin causar daño ni sangrado.

Comparación con los modelos de trasplante heterotópico existentes
Mientras que varios otros modelos animales para el trasplante heterotópico de válvula aórtica se han descrito previamente 12,13,14,15,16,17,18, el protocolo actual proporciona una alternativa directa y más práctica que mejora los modelos anteriores de varias maneras. En primer lugar, debido a la naturaleza técnicamente simple del procedimiento, se requiere muy poca capacitación para operar con éxito. Esto está en marcado contraste con los trasplantes de válvula aórtica heterotópica descritos anteriormente en la aorta abdominal. Por lo tanto, este modelo proporciona una alternativa más práctica y rentable para estudiar el trasplante de válvula aórtica al tiempo que minimiza la morbilidad, el dolor y la mortalidad de las ratas. Además, debido a que solo se necesita una valva de válvula aórtica para la operación de receptor y cada rata donante proporciona tres valvas, se requieren menos ratas donantes para cualquier experimento dado. Además, la implantación de tejido en el riñón contralateral o en una bolsa subcapsular separada puede permitir el control interno o la comparación de las respuestas inmunes a los diferentes tejidos dentro de una sola rata. En este caso, el mejor enfoque es a través de una incisión de laparotomía en la línea media.

Además de los modelos animales que describen el trasplante heterotópico de válvula aórtica en la aorta abdominal, otros estudios han utilizado un modelo subcutáneo para estudiar la inmunogenicidad de las válvulas aórticas³². Si bien este enfoque es indudablemente más sencillo que el trasplante en la aorta abdominal, la evidencia existente sugiere que la implantación subcutánea es un método menos efectivo de presentación de antígenos^33,34. La muestra implantada también es difícil de encontrar y analizar. Por lo tanto, el espacio subcapsular renal se propone como un sitio de implantación que es simplificado pero óptimo para estudiar la biología del trasplante de válvula aórtica.

En resumen, el modelo recientemente propuesto sirve como una adición al arsenal de los científicos para estudiar el trasplante de válvulas cardíacas y complementa los modelos descritos anteriormente.

Limitaciones
Aunque el trasplante de valvas de la válvula aórtica bajo la cápsula renal es un método eficaz para estudiar la aloinmunidad in vivo, existen algunas limitaciones de este modelo. Si bien el espacio subcapsular está bien vascularizado, no ofrece el mismo entorno hemodinámico que la posición subcoronaria. Esto puede afectar la respuesta inmune al tejido trasplantado. Algunos han planteado la hipótesis de que las distintas propiedades inmunes observadas en el tejido valvular pueden ser el resultado del flujo sanguíneo de alta presión sobre la válvula aórtica en la posición subcoronaria, anulando la respuesta quimiotáctica^28,35. Además, este modelo es insuficiente para estudiar el efecto de la aloreactividad sobre la función valvular ya que las valvas no están realizando su función fisiológica bajo la cápsula renal. Sin embargo, existen limitaciones similares para los modelos heterotópicos de trasplante de aorta abdominal, ya que el éxito de estos modelos se basa en hacer que las valvas valvulares sean incompetentes para evitar la trombosis del injerto^15,36.

Las limitaciones del protocolo incluyen la posibilidad de que el tejido se desaloje del espacio subcapsular renal y no se pueda recuperar (1 de cada 36 animales). Otra limitación es la muerte del animal durante la cirugía (1 de cada 36 animales); sin embargo, la muerte fue causada por la sobredosis de buprenorfina, y se pueden emplear otros métodos para la dosificación de analgesia.

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

La Figura 1 se creó con biorender.com. Este trabajo fue apoyado en parte por el Programa de Investigadores Quirúrgicos de la Fundación AATS a TKR, el Fondo de Excelencia Infantil sostenido por el Departamento de Pediatría de la Universidad Médica de Carolina del Sur a TKR, una subvención de la Fundación Emerson Rose Heart a TKR, Filantropía por el Senador Paul Campbell a TKR, NIH-NHLBI Institutional Postdoctoral Training Grants (T32 HL-007260) a JHK y BG, y el Fondo de Investigación FLEX de la Facultad de Medicina de la Facultad de Medicina de la Universidad de Carolina del Sur a MAH.