Die Autoren danken T. Palmer und H. Babu (Stanford Neurochirurgie) für die Bereitstellung von murinen NPCs. Vektorgrafiken in Abbildung 4 wurde eingesetzt und angepasst von Servier Medical Art unter Creative Commons Attribution 3.0 Unported Lizenz (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Teil dieser Arbeit wurde an der Stanford Nano geteilt Einrichtungen (SNF), unterstützt von der National Science Foundation unter Award ECCS-1542152 durchgeführt. N.A.S erkennt Unterstützung aus dem National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health (32GM 008412). C.M.M. würdigt Unterstützung durch ein NIH NRSA Pre Promotionsstipendium (F31 EB020502) und Siebel Scholars Program. S.C.H. räumt Unterstützung von den National Institutes of Health (U19-AI116484 und R21 EB018407), National Science Foundation (DMR-1508006) und am California Institute for Regenerative Medicine (RT3-07948). Diese Forschung finanziell unterstützt von der Allianz für Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), die von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und menschlichen Entwicklung (NICHD), National Institute of unterstützt wird Neurologische Erkrankungen und Schlaganfall (NINDS) und National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) von den National Institutes of Health unter Nummer P2CHD086843 Award. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die Ansichten von den National Institutes of Health.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Rekombinante Proteinexpression und Reinigung ist ein leistungsfähiges Werkzeug, Biomaterialien mit hoher Reproduzierbarkeit zu synthetisieren. Aufgrund weitgehend das Aufkommen der kommerzialisierten molekularen Klonen, können benutzerdefinierte rekombinante Plasmide von mehreren Lieferanten gekauft werden die reduziert die Zeit zum Arbeiten mit Materialien wie ELPs. In ähnlicher Weise können Plasmide direkt aus dem ursprünglichen Labor angefordert werden, wenn das ursprüngliche Werk durch einen Bundesvertrag unterstützt wurde und die künftige Arbeit wird für Non-Profit-Einsatz. Die vollständige ELP-Aminosäure-Sequenz wurde zuvor für mehrere ELP Varianten31veröffentlicht. Der Prozess vom Ausdruck auf eventuelle Reinigung von rekombinanten Proteinen beinhaltet jedoch eine Reihe von kritischen Schritte, die häufig zu Ertragseinbußen oder eine niedrigere Qualitätsprodukt führen kann. Einige der am häufigsten auftretenden Probleme für ELP Zubereitung entstehen in eines der folgenden: (1) Qualität der gespeicherten bakterielle Aktien, (2) der erste Frost-Tau-Zyklus um die bakterienmembran und (3) Proteinreinigung durch Temperaturwechsel stören.
Ein Hauptunterschied zwischen Proteinexpression und anderen nicht-biologischen Materialien zu produzieren ist, wir die biologische Maschinen von rekombinanten Hosts nutzen, die Polymere zu synthetisieren. Anschließend diese Technik verfügt über eine eindeutige Einschränkung: Zelltod oder Schäden. Zelltod manifestiert sich am häufigsten als eine reduzierte Anzahl der Bakterienkolonien nach Schlieren einen Teller oder ungewöhnlich kleine Kolonien, die relativ langsam wachsen. Bakterielle Aktien können wenn sorgfältig gepflegt seit Jahren stabil; jedoch können aufeinanderfolgende Frost-Tau-Zyklen wegen wiederholter Gebrauch oder Gefrierschrank Zellviabilität reduzieren oder zu DNA-Schäden führen. Typische BL21 Bakterien Aktien verwenden zwischen 10 % und 40 % Glycerin nach Volumen gemischt mit suspendierten Zellen. Das Glycerin dient zur Membran Schadensreduzierung von Nukleierungsmittel Eiskristalle beim Gefrieren. Daher ist die Verwendung niedriger Konzentration (< 10 %) führen zu einer kompromittierten Membran, während höhere Konzentrationen (> 40 %) können unterdrücken den Gefrierpunkt ausreichend, wo die Aktie nie führt zum Zelltod führt friert. Aber auch innerhalb optimale Glycerin Ebenen, bakterielle Aktien zu voll darf nicht Tauwetter Lager Lebensfähigkeit und DNA-Schäden als eine Kombination von Membranschäden aus wieder einfrieren und zytotoxische Wirkung von Glycerin zu führen kann reduziert. Wenn es festgestellt wird, dass eine bakterielle Aktie ergibt sich eine geringe Kolonie zählen oder die Zellen mit einer konstant niedrigen Übertragungsrate (manifestiert als OD600 Rampe Langsamkeit beim Ausdruck) dividiert werden, deshalb erneut transformieren das Plasmid und eine neue Aktie zu machen eine einfache erster Ansatz, um dieses Problem zu beheben. In diesem Sinne empfiehlt es zur Gewährleistung der langfristigen Erhaltung der bakterielle Aktien und Integrität der DNA, die Kopien von Ihrem Plasmid als gereinigte DNA eingefroren im Wasser und nicht in den Zellen zu speichern. Speicherung von DNA auf diese Weise wird sichergestellt, dass bei unvorhergesehenen Ereignissen wie einer gescheiterten Lager oder Gefrierschrank, eine zuverlässige Quelle für die ursprüngliche DNA für die Transformation verwendet werden kann.
Ein weiterer entscheidender Schritt im ELP-Fertigung ist die Reinigung des Zielproteins vom Ausdruck Host. Proteingewinnung aus E. Coli wird erreicht durch das Brechen der Zellwand mit nukleierenden Eiskristalle, die bilden in der hängenden Zelle lysate auf Einfrieren, die mit aufeinanderfolgenden Gefrier-tau-Zyklen noch verstärkt wird. Alternative Methoden zur Brechung der Zellwand können z. B. Ultraschall oder eine Presse genutzt werden. In Folge Einfrieren Auftauen von der lysate ist insbesondere vorteilhaft, da bedarf es nur ein Gefrierschrank und keine andere Spezialausrüstung. Dieses Verfahren löst jedoch nonspecifically DNA, RNA und Protein Verunreinigungen, neben Proteasen, die das Potenzial haben, das Zielprotein verschlechtern. Daher, um Kontamination zu vermeiden und Ertrag, Deoxyribonuclease ich (DNase) und Phenylmethanesulfonyl Fluorid (PMSF) werden hinzugefügt, um die Zelle lysate zu erniedrigen die DNA und hemmen Proteasen, bzw. reduziert. Das Vorhandensein von DNA vor der Zugabe von DNase kann visuell als einen "sehnig" Auftritt im gesamten Re hängenden Zelle lysate, nach dem ersten Tauwetter beobachtet werden. DNase aktiv verschlechtert diese DNA und so verringert die Viskosität der Zelle lysate erleichtert das Reinigen durch Zentrifugation. Optimalen Abbau von DNA kann visuell bestätigt werden, indem sichergestellt wird, dass die Zelle lysate scheint ganz flüssig sein und strähnige Aussehen nicht mehr sichtbar ist. Wir haben in der Praxis beobachtet, dass die Zugabe von ~0.1 mg pro mL Zelle lysate DNase ausreichen, um die notwendigen Abbau zu erreichen. Allerdings wird das Vorhandensein von DNA noch eingehalten, kann weitere DNase gefolgt durch weitere zwei bis drei Stunden Agitation hinzugefügt werden. Ein ähnliches Problem kann auch auftreten, wenn DNase vorzeitig hinzugefügt wird, bevor eines der lysate hat das Potenzial, ausreichend Auftauen. In diesem Fall können die kälteren Temperaturen die Effizienz von DNA-Abbau aufgrund der vorzeitigen Inaktivierung von DNase begrenzen. Um dieses Problem zu vermeiden, empfiehlt es oft neu suspendierten Pellet Auftauen für ca. 8 Stunden vor der Behandlung mit DNase zu ermöglichen. Darüber hinaus möglicherweise wenn eiweißarme Erträge gemeldet und der Abbau von DNA hat ausgereicht, die Zugabe von mehr PMSF zur Verringerung der weitere potenzielle Proteinabbau aus Proteasen erforderlich.
Weitere Überlegungen zur Gewährleistung optimaler Ausdruck der ELPs gehören eine sorgfältige Verständnis für die Vorteile und Grenzen des gewählten Antibiotikums. Hier wurden pET15b Vektoren mit einem Ampicillin-Resistenz-Gen für Protein-Expression verwendet. Funktional, ermöglichen das Haustier Vector Serie bedeutende Proteinexpression mit weniger als 50 % der Proteinexpression ein Bakterium das Zielprotein nach einer erfolgreichen Induktion32,33gewidmet. Als Auswahl Antibiotikum Ampicillin kommt jedoch mit einigen Einschränkungen, die optimalen Ausdruck stören können. Abbau von Ampicillin in Anwesenheit von E. Coli kann erstens schnell durch die Freisetzung von Beta-Lactamase auftreten. Wenn eine ausreichende Menge an die Ampicillin abgebaut wird, kann die Ampicillin-Codierung Plasmid (d. h. die ELP-Codierung Plasmid) vollständig verloren gehen. Infolgedessen wenn ELPs für längere Laufzeiten mit dem Ausdruck, werden Ausdruck proteingehalte überwacht zu aufeinander folgenden Zeitpunkten um sicherzustellen, dass ausreichender Menge des Gens ELP-Codierung bleibt um wünschenswerte Ausdruck zu ermöglichen. Mögliche Methoden zur Problembehandlung des Aufbau von Beta-Lactamases gehören Spinnen sich die Starterkultur und erneut Aussetzung der Zellen in antibiotikafreien Medium vor dem impfen die Ausdruck-Medium. Dieser Prozess effektiv begrenzt die Übertragung von Antibiotika-abbauenden Enzymen und sorgt für einen größeren Teil der Zellen enthalten die Ziel-Protein-encoding-Vektor. Darüber hinaus hat Ampicillin eine begrenzte Haltbarkeit von etwa zwei bis drei Wochen. Daher sollten Kultur Platten für Protein-Expression bei 4 ° C für maximal zwei Wochen vor dem Gebrauch gespeichert werden. Schließlich, um die Wirksamkeit von Ampicillin innerhalb der Starter und Expression Media, Ampicillin-Stammlösung zu gewährleisten sollte werden produziert frische sofort vor verwenden, Langzeitspeicher zu einem weniger wirksames Antibiotikum führen.
Das Vorhandensein einer LCST ermöglicht die einfache Reinigung der ELPs durch Temperaturwechsel. Insbesondere verursachen bei höheren Temperaturen und in Anwesenheit von Salzen entropische Kräfte ELPs werden weniger wasserlöslich und bilden anschließend eine Polymer-reichen coacervate Phase. Auf der anderen Seite, bei niedrigeren Temperaturen, ELPs bleiben löslich und lösen sich leicht in die Lösung. Radfahren zwischen diesen zwei Temperaturregime gepaart mit Zentrifugation Schritte, sammeln und entsorgen Sie die nicht-ELP-haltigen Phase nacheinander konzentriert sich das Protein und reduziert gleichzeitig die Existenz von nicht-ELP Verunreinigungen.
Allerdings gibt es eine Reihe von Stadien, wo ELPs in diesem Reinigungsprozess verloren gehen können. Erstens ist vor jedem kalten Spin, die Protein-haltigen Lösung zu einem pH-Wert von 9,0 alkalisiert. Diese höheren pH-Wert dient zum Deprotonate bestimmte Aminosäuren auf das Protein Rückgrat, so dass sie effektiv in geladenem Zustand und die weitere Verbesserung ihrer Löslichkeit. Infolgedessen kann Verzicht auf diesen Schritt oder nicht genügend Zeit für die Protein-Auflösung zu einem Rückgang der Rendite führen, wie Proteine nicht solubilisiert werden bei der Zentrifugation oelletiert und verworfen.
Ebenso können Zielproteine während des heißen Spin-Verfahrens verloren sein, wenn das ESP pelleted ist. Zunächst wird der eiweißreichen überstand die Löslichkeit der ELP reduzieren NaCl hinzugefügt. Die Salze Arbeiten zur Abschirmung von elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen den Proteinen und Wasser Molekülen, verursacht das Protein aus der wässrigen Phase zu trennen. Dieser Effekt wird noch verstärkt durch Erhitzen der Lösung, die aufgrund der entropische Effekte weiter bricht die wasserhaltigen "Käfig" rund um ELPs und zwingt die Aggregation der Proteine. Bei niedrigeren proteinkonzentrationen (i.e., der ersten thermischen Zyklus), Zugabe von Salzen allein ist oft nicht ausreichend, um diese Phasentrennung führen. Allerdings erhöht sich die Konzentration des Proteins (i.e., später thermischen Zyklen), und es gibt weniger sekundäre Verunreinigungen zur Interaktion mit den Salzen, das ESP wird leichter Niederschlag. Infolgedessen wenn Salze zu schnell hinzugefügt werden, können sie physisch eingeklemmt werden durch Aggregation der Proteine, die effektiv reduziert den Salzgehalt der Lösung und weitere Proteinfällung begrenzt. So sollte das Salz hinzugefügt werden, in drei kleinen Chargen um sicherzustellen, dass sie genügend Zeit, um durch die Lösung homogen verteilen. Als abschließende Bemerkung Variationen mit dem ELP-Backbone, entweder durch weitere Änderungen in der Gast-Rückstand der Elastin-ähnliche Region oder Änderungen an der Bio-aktiven Region können das LCST Verhalten erheblich beeinträchtigen. Folglich um optimale Protein Erträge über Protein-Varianten zu gewährleisten, ist es entscheidend zur Optimierung der pH-Wert, Salzgehalt und Salz Typ (zB., monovalenten oder zweiwertige) für die kalt- und Spins.
SDS-PAGE nach Protokoll Abschluss ausgeführt wird empfohlen, da es lässt sich leicht feststellen, ob signifikanter ELP Verlust tritt auf, während der die Reinigungsschritte. Kurz, wenn im Anschluss an einer heiße Runde überstand ELP erkannt wird, wird dann das Protein nicht effektiv ausgefällt werden. Ebenso wenn ELPs in einer Stichprobe von solubilisiert Pellet nach einem kalten Spin gekennzeichnet sind, ist dann das Protein nicht effektiv aufgelöst wird.
ELP Hydrogele bieten viele Vorteile gegenüber synthetischen oder natürlich gewonnenen Materialien. Insbesondere bietet die Verwendung von Amin-reaktive Vernetzer THPC einen kostengünstige, einfachen und einstellbaren Mechanismus der Protein-Vernetzung. Es gibt jedoch verschiedene Einschränkungen innerhalb der Vernetzung-Protokolls, die beachtet werden sollten. THPC Sauerstoff empfindlich, und wenn unter falschen Bedingungen gelagert, kann es schnell Reaktion Effizienz verschlechtern. Darüber hinaus kann aufgrund seiner Reaktivität mit primären Aminen, THPC mit den umliegenden Proteine in Medien oder diejenigen auf der Zelloberfläche, die reich an Aminen reagieren. Daher, wenn ELP Hydrogele bilden, empfiehlt es sich, Medien Kontamination mit der Pellet-Zelle möglich exogene Protein Kreuzreaktivität und somit eine Reduzierung in vernetzungseffizienz zu reduzieren. Zu guter Letzt dieser Vernetzung Mechanismus schließt die Bio-aktiven Region-Sequenz, die diejenigen, die keine Rückstände von Lysin enthalten und somit begrenzt möglichen Integration von einigen Zelle-Klebstoff-Motive (zB., IKVAV34). Diese Einschränkungen, Änderungen an dem ELP-Backbone mit Natriumazid und Bicyclononyne (BCN) ermöglicht Reaktionspartner für Bio-orthogonal Vernetzung, wie zuvor beschrieben27.
Es sei darauf hingewiesen, dass das ELP LCST Verhalten eine wichtige Rolle im diktieren Hydrogel Mikrostruktur spielt. Im Temperaturregime oberhalb der LCST Niederschlag ELPs aus der Lösung führt zur Bildung von Protein-reiche und Protein-defizienten Phasen, die Matrix Porosität beeinflussen können und vernetzungseffizienz der Matrix9. Da die meisten Zelle Kultur Experimente bei physiologisch relevanten Temperaturen (~ 37 ° C) über das ELP LCST durchgeführt werden, diese Effekte zu berücksichtigen. Für die Hydrogele effektiv vernetzen und Form muss ein Netzwerk von miteinander verbundenen Protein, das primäre Amin aus Lysin physisch THPC Vernetzer zugänglich. Tritt die ELP-Aggregation vor erreichen ausreichende Vernetzung, möglicherweise ELPs gefangen innerhalb der Protein-reiche Phase nicht zugänglich und somit nicht zur Teilnahme an Vernetzung. Um diese Einschränkung zu beheben, erfordert unser Protokoll eine erste 15 min Vernetzung bei Raumtemperatur, die für die vorläufige Vernetzung von Hydrogel ermöglicht, bevor das ESP die thermische Phasenübergang durchläuft. Diese Raumtemperatur Inkubation folgt eine weitere 15 min Inkubation bei 37 ° C, Hydrogel Vernetzung abzuschließen. Dieses Verfahren ist für ausreichende Vernetzung und robust, reproduzierbare Gelierung des ELP Materials entscheidend.
Abschließend bieten rekombinanten Proteins Hydrogele hergestellt mit ELP außergewöhnliche Einstellbarkeit der Proteinreihenfolge und damit die 3D Zelle Mikroumgebung. ELP Polymere wurden in einer Vielzahl von in Vitro und in Vivo -Systemen gezeigten ausdrückbare in hohe Erträge, aufgrund ihres Verhaltens LCST leicht gereinigt werden und biokompatibel. Die Verwendung von E. Coli als rekombinante Host bietet eine einfache und kostengünstige Verfahren, die perfekte Kontrolle des Polymers Molekulargewicht und Funktionalität in der Nähe von entstehen. In Verbindung erlaubt diese Technik für robuste Einstellbarkeit und Reproduzierbarkeit der Hydrogel-Plattform für die Kultur einer Vielzahl von Zelltypen in 3D ermöglichen. Schließlich ist diese ELP-Hydrogel-Plattform offen für viele nachgeschaltete biochemische Tests einschließlich qRT-PCR, Western-Blot, DNA-Extraktion und Zelle Immunostaining9.

Im vergangenen Jahrhundert entwickelte zweidimensionale (2D) Gewebekultur zu einer integralen Toolset für die grundlegende Zelle Biologie in-vitro-Untersuchung. Darüber hinaus haben die relativ kostengünstige und einfache Protokolle für 2D Zellkultur zu ihrem Erlass in vielen biologischen und medizinischen Disziplinen geführt. Jedoch hat Forschung gezeigt, dass traditionelle 2D Plattformen zu Ergebnissen führen können, dass deutlich von diesen gesammelten in Vivoabweichen, wodurch wertvolle Zeit und Mittel für klinisch orientierte Forschung1,2verschwendet, 3. Wir und andere stellen die Hypothese auf, dass diese Diskrepanz zugeschrieben werden kann, auf den Mangel an einheimischen biochemischen und biophysikalischen Hinweise bereitgestellt, um die Zellen kultiviert auf 2D Oberflächen, die für optimale Vermehrung und Reifung der verschiedenen Zelltypen erforderlich sein können.
Um diese Einschränkungen und Hilfe Brücke die Lücke zwischen 2D anzugehen haben in Vitro und in Vivo Studien, Forscher entwickelten dreidimensionalen (3D) Hydrogel Plattformen für Zelle-Kapselung1,4,5 ,6. Hydrogele sind ideale Materialien zu rekapitulieren die endogenen Mikroumgebung von der extrazellulären Matrix (ECM) in Vivo aufgrund ihrer Gewebe-ähnliche mechanische Eigenschaften und Wasser geschwollen Struktur, schnellen Transport von Nährstoffen und Signalisierung Faktoren7,8. Darüber hinaus können 3D Hydrogele sollen unabhängige Kontrolle der mechanischen und biochemischen Eigenschaften des Gerüstes zu haben. Matrix Mechanik9,10,11,12 und Zelle-Klebstoff Liganden13,14,15 sind bekannte Zelle beeinflussen Verhalten in Vitro und in-vivo. So bieten 3D Hydrogele mit einstellbaren Eigenschaften eine Plattform, um kausale Zusammenhänge zwischen Zellen und ihrer Mikroumgebung zu studieren. Kriterien für eine ideale 3D hydrogelmatrix sind einfache, nicht-zytotoxische Zelle-Kapselung sowie unabhängige Einstellbarkeit der physiologisch relevanten mechanischen Eigenschaften und Mimik native Zelle-Klebstoff-Motive.
Beide synthetischen (zB., Polyethylenglykol, Polymilchsäure, Poly (glykolische Säure)) und natürlich gewonnen (zB., Alginat, Kollagen, Matrigel) Hydrogele haben Vorteile gegenüber 2D in-vitro- Kultur-Plattformen; Sie haben jedoch auch erhebliche Mängel, die ihre Anwendbarkeit zu begrenzen. Erstens viele synthetische und natürlich gewonnenen Plattformen erfordern harte Vernetzung Bedingungen, die für Säugerzellen potenziell giftig sein können, führt zu verringerte Zelle Lebensfähigkeit7. Darüber hinaus viele synthetische Plattformen fehlt native Bioaktivität und müssen durch chemische Nebenreaktionen funktionalisiert werden die erhöhten Kosten und Komplexität16hinzufügen können. Schließlich, während natürlich gewonnenen Materialien in der Regel innere bioaktive Domänen enthalten, sie sind oft durch hohe Variabilität von Charge zu Charge geplagt und beschränken sich oft auf Bildung relativ schwachen Gele7,17.
Rekombinantes Protein-Engineering präsentiert eine einzigartige Toolset für Materialien Design durch explizite Kontrolle über Proteinreihenfolge und, durch Verlängerung, die möglichen mechanischen und biochemischen Eigenschaften der endgültige Hydrogel Gerüst18. Darüber hinaus können durch die Nutzung der bekannten biologischen Maschinen von Escherichia coli (E. Coli), Proteine zu äußern, Materialien kostengünstig und konsequent mit begrenzten inter - und Intra-Batch Variabilität produziert werden. Das Elastin-wie Protein (ELP) hier vorgestellten hat drei technische Bereiche: (1) ein T7 und His6 Tag, das ermöglicht eine Kennzeichnung über Gewebekulturen Antikörper markiert, (2) ein "Elastin-Like"-Region, das verleiht elastische mechanische Eigenschaften und chemische ermöglicht Vernetzung, und (3) eine "Bio-aktiv"-Region, die für Zelle-Klebstoff Motive kodiert.
Elastin-ähnliche Region basiert auf der kanonischen (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 Elastin Sequenz, wo vier 'Xaa' Aminosäure-Websites sind Isoleucin (Ile), aber könnte so konzipiert, dass jede Aminosäure außer Prolin. Diese Sequenz stiftet rekombinante ELPs mit untere kritische Temperatur (LCST) lösungsverhalten, die für einfache Reinigung nach dem Ausdruck über thermische Radfahren19,20ausgenutzt werden können. Diese LCST Eigenschaft kann bei unterschiedlichen Temperaturen durch Ändern der Gast 'Xaa' Rückstand21,22, thermisch Aggregat abgestimmt werden.
Hier wurde mit Amin-präsentierenden Lysin (Lys) Aminosäure, die "Xaa" Position auf einem der fünf Elastin-artigen Wiederholungen ersetzt, die Hydrogel Vernetzung genutzt wird. Unsere bisherige Arbeit hat nicht zytotoxisch und robuste Vernetzung durch Reaktion mit der Amin-reaktive Vernetzer Tetrakis (Hydroxymethyl) Phosphonium-Chlorid (THPC)23gezeigt. Durch unterschiedliche allgemeine Inhalte und Vernetzer Proteinkonzentration können wir Hydrogele zu produzieren, die optimiert werden können, um eine physiologisch relevanten Steifigkeit Palette (~0.5-50 kPa)9,23,24zu überspannen. Neben der Optimierung der mechanischer Eigenschaften, Zelle Adhäsion innerhalb der Hydrogel-Ergebnisse aus der Integration der kanonischen Zelle-Klebstoff-Domänen innerhalb das Rückgrat des ELP-Proteins. Beispielsweise ermöglicht die Einbeziehung der erweiterten Fibronektin abgeleitet "RGDS" Aminosäure-Sequenz Zelladhäsion und Konformationsänderungen Flexibilität, während das Rührei, unverbindliche "RDGS" Variante schränkt Zellmatrix Haftung24. Durch die Modulation des Verhältnis der Zelle-Klebstoff nichtklebenden Proteine sowie die Gesamt-Protein-Konzentration, können wir effektiv Hydrogele zu produzieren, die eine Vielzahl von Liganden-Konzentration zu überspannen. Resultantly, entwickelten wir eine Hydrogel-Plattform mit entkoppelten biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften, die unabhängig für optimale 3D Culture von verschiedenen Zelltypen abgestimmt werden können.
Neben Matrix Steifigkeit und Klebstoff Liganden Einstellbarkeit bieten rekombinante Hydrogele die Möglichkeit, bestimmte Materialabbau designprofile, die notwendig ist für die Zelle verbreiten, Proliferation und Migration innerhalb einer 3D Rahmen4 , 9. dieser Abbau wird durch Zelle Sekretion von Proteasen, die gezielt die erweiterte "RGDS"9 oder Elastin-Sequenz25gewährt. ELP Hydrogele haben auch gezeigt, dass die nachfolgenden biochemischen Assays zu unterstützen, die notwendig sind für das Studium Zellviabilität und Immunocytochemistry, sowie DNA/RNA/Proteingewinnung für quantitative Reverse-Funktion Transkription-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) und Western blot9. ELP-Varianten wurden auch in einer Reihe von in Vivo Modellen verwendet und sind dafür bekannt, die vom Immunsystem26gut vertragen werden.
Zusammengenommen, ELP als eine wesentliche Plattform für Zelle-Kapselung Studien verfügt über eine Vielzahl von Vorteilen im Vergleich zu synthetischen oder natürlich gewonnenen Material Plattformen, die oft nicht über den gleichen Grad an biochemischen und biophysikalischen Einstellbarkeit und Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus ELP einfach und nicht zytotoxischen Einsatz mit einer Vielzahl von Zelltypen (zB., Küken Dorsal Root Ganglien14,24, murine neuronalen Vorläuferzellen Zellen9, menschlichen mesenchymalen Stammzellen27, bovine neonatale Chondrozyten28, Human endothelial Zellen29,30) ermöglicht eine mehr physiologisch relevanten Modell des endogenen 3D ECM im Vergleich zu 2D Zellkultur. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für den Ausdruck von rekombinant abgeleitet, ELPs für den Einsatz als Durchstimmbare Hydrogel Plattform für 3D Handy Kapselung. Weiter stellen wir die Methodik für die Downstream-fluoreszierende Kennzeichnung und konfokalen Mikroskopie von verkapselten Zellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="904">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Elastin-Like Protein Expression and Purification</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% Ethanol</td>
			<td>RICCA Chemical</td>
			<td style="width:123px;">2546.70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A3920-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1760-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">9002-18-0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21(DE3)pLysS Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:260px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0230-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA disodium salt, dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">O2793-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1755-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:260px;">EMD Millipore</td>
			<td>1.10285.5007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:123px;">52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">195381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S 8045-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe Filter Unit (0.22 &#956;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific Broth</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">71754-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#956;m syringe filters</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 mm thick silicone sheet</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:123px;">70338-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (2 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (4 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (5 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">No. 1 12 mm glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">404861-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5% Tryspin/EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td style="width:123px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:260px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">D1306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:260px;">Lampire Biological Labs</td>
			<td style="width:123px;">7332100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16210-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Mouse Nestin Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">556309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Sox2 Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">23064S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Nail Polish</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Hardset Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:123px;">H-1400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of elastin-like protein hydrogels for encapsulation and immunostaining of cells in 3d

Zweidimensionale (2D) Gewebekultur Techniken sind wichtig für unser Verständnis der grundlegenden Zelle Biologie gewesen. Jedoch sammelte traditionelle 2D Gewebekultur Systeme fehlen eine dreidimensionale (3D) Matrix, wodurch eine deutliche Trennung zwischen Ergebnisse in Vitro und in Vivo. Um diese Einschränkung zu beheben, haben Forscher 3D Hydrogel Gewebekultur Plattformen entwickelt, die die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften der in Vivo Zelle Mikroumgebung nachahmen kann. Diese Forschung hat die Notwendigkeit, Material Plattformen entwickeln, die 3D Zelle Kapselung und nachgelagerten biochemischen Assays unterstützen motiviert. Rekombinantes Protein-Engineering bietet eine einzigartige Toolset für 3D Hydrogel-Material-Design und Entwicklung, indem Sie für die spezifische Steuerung der Proteinreihenfolge und daher, durch Verlängerung, die möglichen mechanischen und biochemischen Eigenschaften der resultierenden Matrix. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Expression von rekombinant abgeleitet Elastin-Like Protein (ELP), die Form Hydrogele mit unabhängig einstellbaren mechanischen Eigenschaften und Zelle-Klebstoff-Liganden-Konzentration genutzt werden können. Weiter präsentieren wir eine Methodik für die Zelle Kapselung in ELP Hydrogele und anschließende immunofluorescent Färbung der Zellen für nachgelagerte Analyse und Quantifizierung eingebettet.

Die in diesem Protokoll verwendeten ELPs bestehen aus fünf Regionen: ein T7-Tag, His6 Tag spaltstelle Enterokinase (EK), einer Bio-aktiven Region und ein Elastin-ähnliche Region (Abbildung 1). Die T7 und His6 Tags ermöglichen einfache Identifizierung durch standard-Western-Blot-Techniken. Einführung der EK-spaltstelle ermöglicht für den enzymatischen Abbau des Rayons Tag bei Bedarf. Die Bio-aktiven Region kodiert für die erweiterte, Fibronektin-abgeleitete Zelle-Kleber ("RGDS") oder nicht klebend ("RDGS") Sequenzen. Zu guter Letzt enthält die zentralen Wiederholung der Elastin-ähnliche Region eine Lysin-Gruppe am Gast Rückstände Standort Vernetzung über THPC ermöglicht, während die flankierenden Wiederholungen Isoleucin enthalten um eine LCST ~ 32 ° C31zu erreichen.
Post-Ausdruck, SDS-PAGE oder Western-Blot lässt sich das Molekulargewicht zu visualisieren und bestätigen die Identität von ELP, die Antikörper-Tags wie T7 (MASMTGGQQMG) oder His6 (HHHHHH) (Abbildung 2) enthalten. Erfolgreiche Expression unter kontrollierten Bedingungen ergibt ein sehr homogenes Produkt, vertreten durch die Anwesenheit einer einzigen dunklen Band an das ungefähre Molekulargewicht (~ 37 kDa) dieser Proteine mit beiden SDS-PAGE (Abbildung 2A) und Western-blot) Abbildung 2 b).
In unkontrollierten Bedingungen schlägt das Vorhandensein der unteren Molekulargewicht Bands auf ein Western-Blot, dass ein Teil der Proteine war nicht komplett übersetzt und/oder wurden nach dem Ausdruck (Abbildung 2) degradiert. Insbesondere sind hier die Massen von ~ 9 kDa gleichmäßig entspricht etwa dem Gewicht von einem Bio-aktiven Region und drei Elastin-Regionen (eine "Wiederholung") oder etwa ein Viertel des Zielproteins. Diese kleineren PROTEINFRAGMENTE sind in der Regel vor, wenn der Ausdruck bei einer höheren Temperatur durchgeführt wird (> 32 ° C) wie in Abbildung 2. Das Vorhandensein dieser geringere Molekulargewicht Proteine führen zu unvorhersehbaren mechanischen Eigenschaften. Daher ist regelmäßige screening Post Ausdruck empfohlen, um eine hohe Qualität des Endprodukts zu gewährleisten.
Die mechanische Steifigkeit der ELP-basierte Hydrogele kann geändert werden, durch Manipulation der Konzentration von ELP oder das Verhältnis von THPC reaktive Gruppen: ELP primäre Amine. Gleichzeitig kann die Konzentration der Zelle-Klebstoff-Liganden durch die Änderung des Verhältnis von ELP-Varianten mit der Zelle-Kleber (RGDS) abgestimmt werden, nicht klebend (RDGS) Sequenzen innerhalb jedes Steifigkeit Regime. Durch die Manipulation dieser beiden Variablen, produzieren wir Gele, die ein Spektrum an mechanischen Eigenschaften und Liganden Konzentrationen (Abbildung 3).
Um Zellen in 3D ELP Hydrogele zu kapseln, die gewünschte Anzahl von Zellen in das Medium suspendiert und zentrifugiert, um eine Zelle Pellet (Abb. 4A) zu produzieren. Das Medium wird aus dem Röhrchen abgesaugt, und die Zellen sind einheitlich in der ELP-Lösung der gewünschten Konzentration wieder ausgesetzt. Als nächstes ist THPC Lösung hinzugefügt, um die Zelle/ELP-Aussetzung und pipettieren gründlich um eine homogene Mischung zu bilden. Diese Lösung ist schnell zu sterilen Silikon Formen innerhalb einer 24-Well-Platte mit einer Pipette übertragen und durfte Crosslink bei Raumtemperatur und 37 ° C für 15 min jeden (Abbildung 4 b). Schließlich ist das Medium well-Platte hinzugefügt und bei 37 ° C im Experiment inkubiert.
Lebenden/Toten Färbung lässt sich die Zellviabilität und erfolgreiche Zelle Kapselung in ELP Hydrogele zu bewerten. Wie in Abbildung 5dargestellt, zeigen Erwachsenen murinen neurale Vorläuferzellen (NPCs) hohe Zellviabilität innerhalb von 7 Tagen innerhalb einer 3 % (w/V) ELP Hydrogel.
3D ELP Hydrogele haben bisher gezeigt, dass NPC Stamm Wartung gemessen durch den Ausdruck der kanonischen NPC Protein Marker SRY (Geschlecht-Bestimmung von Region Y) unterstützen-Box 2 (Sox2) und nestin9. NPCs in 3 % (w/V) gekapselt ELP Hydrogele mit niedrigen THPC Vernetzung zeigen hohe Expression von nuklearen lokalisiert Sox2 und zytoplasmatischen nestin Filamente über Immunostaining und confocal Imaging (Abbildung 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig1.jpg"> Abbildung 1 : Eine schematische Darstellung der ELP und entsprechenden Aminosäuresequenzen. Das ESP in dieser Studie verwendeten enthält einen T7 und His6 Tag für Antikörper-basierten Imaging, einer bioaktiven Region für Einführung der Zelle-Klebstoff Domains und eine Elastin-wie Region, die verleiht elastische mechanische Eigenschaften und chemische Vernetzung ermöglicht. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig2.jpg"> Abbildung 2 : Ziel-Protein-Expression mit SDS-PAGE und Western-Blot bestätigen das Molekulargewicht und die Identität des lyophilisierten Produktes überprüft werden kann. Reine Full-Length ELP läuft mit einem Molekulargewicht von 37 kDa wie berichtet von SDS-PAGE (A) und Western-Blot mit dem T7 (MASMTGGQQMG) oder Histidin 6 (HHHHHH) Tag (B). (C). unreine Chargen von ELP aufgrund der Abweichungen in der ELP-Ausdruck-Protokoll können auf die Nennung der ELPs mit niedrigeren Molmassen führen. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig3.jpg"> Abbildung 3: RGDS Liganden Inhalte kann unabhängig von mechanischen Eigenschaften innerhalb von ELP Hydrogele abgestimmt werden. 5 % (w/V) und 3 % (w/V) ELP Hydrogele haben Scherung Moduli ~ 800 Pa und ~ 400 Pa, beziehungsweise. Hydrogele mit einem 1:1 Verhältnis von THPC reaktive Gruppen: ELP primäre Amine waren vernetzt bei Raumtemperatur für 15 min auf 37 ° C erhitzt und für 5 Minuten vor der Messung equilibrate durfte. Daten sind Mittelwert ± s.d., *p < 0,001. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig4.jpg"> Abbildung 4: Der Zelle Kapselung in ELP Hydrogele schematische. (A). Zellen werden zunächst in eine einzelne Zelle Suspension Mittel-und gebeizte mithilfe einer Zentrifuge getrennt. Das Medium wird aus dem Röhrchen abgesaugt, und die Zellen sind neu im ELP-Lösung auf die gewünschte Konzentration ausgesetzt und gut gemischt. Schließlich ist die THPC Vernetzung Lösung hinzugefügt und gut gemischt. (B). unmittelbar nach der Zugabe von THPC, ist die Lösung in eine Silikonform mit einer Pipette geworfen. Die Lösung darf Crosslink bei Raumtemperatur 15 Minuten, gefolgt von einer zweiten 15 min Inkubation bei 37 ° C. Das Medium wird dann die Kultur auch für die Dauer des Experiments hinzugefügt. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig5.jpg"> Abbildung 5: Neurale Vorläuferzellen Erhaltung hohe Lebensfähigkeit in ELP Hydrogele. Repräsentatives Bild der neurale Vorläuferzellen in 3 % (w/V) ELP gekapselt Hydrogele mit 1:1 Vernetzung (THPC reaktive Gruppen: ELP primäre Amine) nach 7 Tagen in der Kultur. Grün: Leben Färbung (Calcein-AM); Rot: tot Färbung (Interkalation Homodimer). Maßstabsleiste = 100 µm.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig6.jpg"> Abbildung 6 : 3D ELP Hydrogele unterstützen neuronalen Vorläuferzellen Zelle Stamm Maker Ausdruck. Immunfluoreszenz-Bild der neurale Vorläuferzellen Ausdrücken Sox2 und nestin Proteine nach 7 Tagen der Kultur in ELP Hydrogele. Bilder zeigen Zellen in 3 % (w/V) ELP Gele mit 0.5:1 Vernetzung (THPC reaktive Gruppen: ELP primäre Amine) gekapselt. Blau: DAPI (Kerne); Rot: Sox2; Grün: nestin. Maßstabsleiste = 25 µm. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Rekombinantes Protein-Engineering Hydrogele sind für 3D Zellkultur von Vorteil, da sie für komplette Einstellbarkeit der Polymer-Rückgrat und sich somit die Zelle Mikroumgebung ermöglichen. Hier beschreiben wir den Prozess der rekombinante Elastin-wie Proteinreinigung und ihre Anwendung in 3D Hydrogel Zelle Kapselung.

Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

production-elastin-like-protein-hydrogels-for-encapsulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.2K Aufrufe.  Stanford University. Rekombinantes Protein-Engineering Hydrogele sind für 3D Zellkultur von Vorteil, da sie für komplette Einstellbarkeit der Polymer-Rückgrat und sich somit die Zelle Mikroumgebung ermöglichen. Hier beschreiben wir den Prozess der rekombinante Elastin-wie Proteinreinigung und ihre Anwendung in 3D Hydrogel Zelle Kapselung.

Serie: Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Forschung

Biotechnik

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Herstellung, Charakterisierung und Einsatzmöglichkeiten von 3D-Tissue-Engineering Menschen Ösophagus-Schleimhaut-Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

3D Hydrogel Kulturen von primären Gliazellen für In-vitro- Modellierung von Neuroinflammation verbessert

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Messung der globalen zellulären Matrix Metalloproteinase und metabolische Aktivität in 3D Hydrogele

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Kontrollierte Dehnung von 3D-Hydrogelen unter Live-Mikroskopie-Bildgebung

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

Lichtgesteuerte Fermentationen für die mikrobielle Chemikalien- und Proteinproduktion

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Großflächige, automatisierte Produktion von aus Fett gewonnenen Stammzellsphäroiden für den 3D-Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have many advantageous properties, including injectability, microscale porosity, and tunability by mixing multiple microgel populations. Methods to fabricate microgels often rely on water-in-oil emulsions (e.g., microfluidics, batch emulsions, electrospraying) or photolithography, which may present high demands in terms of resources and costs, and may not be compatible with many hydrogels. This work details simple yet highly effective methods to fabricate microgels using extrusion fragmentation and to process them into granular hydrogels useful for biomedical applications (e.g., 3D printing inks). First, bulk hydrogels (using photocrosslinkable hyaluronic acid (HA) as an example) are extruded through a series of needles with sequentially smaller diameters to form fragmented microgels. This microgel fabrication technique is rapid, low-cost, and highly scalable. Methods to jam microgels into granular hydrogels by centrifugation and vacuum-driven filtration are described, with optional post-crosslinking for hydrogel stabilization. Lastly, granular hydrogels fabricated from fragmented microgels are demonstrated as extrusion printing inks. While the examples described herein use photocrosslinkable HA for 3D printing, the methods are easily adaptable for a wide variety of hydrogel types and biomedical applications.

This work describes straightforward, adaptable, and low-cost methods to fabricate microgels with extrusion fragmentation, process the microgels into injectable granular hydrogels, and apply the granular hydrogels as extrusion printing inks for biomedical applications.

Fragmentierung von Bulk-Hydrogelen und Verarbeitung zu granularen Hydrogelen für biomedizinische Anwendungen

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have ...

Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark of cardiac and musculoskeletal tissues. To study cell response to aligned microenvironments in vitro, several protocols have been developed to generate COL1 matrices with defined fiber alignment, including magnetic, mechanical, cell-based, and microfluidic methods. Of these, microfluidic approaches offer advanced capabilities such as accurate control over fluid flows and the cellular microenvironment. However, the microfluidic approaches to generate aligned COL1 matrices for advanced in vitro culture platforms have been limited to thin "mats" (&lt;40 &#181;m in thickness) of COL1 fibers that extend over distances less than 500 &#181;m and are not conducive to 3D cell culture applications. Here, we present a protocol to fabricate 3D COL1 matrices (130-250 &#181;m in thickness) with millimeter-scale regions of defined fiber alignment in a microfluidic device. This platform provides advanced cell culture capabilities to model structured tissue microenvironments by providing direct access to the micro-engineered matrix for cell culture.

This protocol demonstrates the use of a microfluidic channel with changing geometry along the fluid flow direction to generate extensional strain (stretching) to align fibers in a 3D collagen hydrogel (&lt;250 &#181;m in thickness). The resulting alignment extends across several millimeters and is influenced by the extensional strain rate.

Mikrotechnische 3D-Kollagen-Hydrogele mit Faserausrichtung mit großer Reichweite

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...