Gli autori ringraziano T. Palmer e H. Basile (Stanford neurochirurgia) per la fornitura di murino NPC. Vector art nella Figura 4 è stato usato e adattato da Servier arte medica sotto Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Parte di questo lavoro è stato effettuato presso la Stanford Nano ha condiviso strutture (FNS), sostenuto dalla National Science Foundation sotto Premio ECCS-1542152. N.a.s. riconosce sostegno dal National Institute of General Medical Sciences, della National Institutes of Health (32GM 008412). C.m.m. riconosce il supporto da un NRSA NIH pre-dottorato (F31 EB020502) e il programma di studiosi di Siebel. S.C.H riconosce sostegno dal National Institutes of Health (U19 AI116484 ed EB018407 R21), National Science Foundation (DMR 1508006) e il California Institute for Regenerative Medicine (RT3-07948). Questa ricerca ha ricevuto finanziamenti dall'alleanza rigenerativa riabilitazione Research & Training (AR3T), che è sostenuta dalla Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e Human Development (NICHD), Istituto nazionale di Disordini neurologici e colpo (NINDS) e Istituto nazionale di Imaging biomedico e Bioingegneria (NIBIB) degli istituti nazionali di salute sotto Premio numero P2CHD086843. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni del National Institutes of Health.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Purificazione ed espressione recombinant della proteina è un potente strumento per sintetizzare biomateriali con elevata riproducibilità. A causa dell'avvento della clonazione molecolare commercializzato in gran parte, plasmidi ricombinanti personalizzati possono essere acquistati da diversi fornitori, che riduce significativamente il tempo di lavorare con materiali come ELPs. Allo stesso modo, plasmidi possono essere richiesti direttamente dal laboratorio di origine quando l'opera originale è stata sostenuta da un contratto federale e il lavoro futuro sarà per uso no-profit. La sequenza dell'amminoacido ELP precedentemente è stata pubblicata per diverse varianti ELP31. Tuttavia, il processo da espressione a eventuale purificazione delle proteine ricombinanti coinvolge un numero di passaggi critici che comunemente può portare alla diminuzione della resa o un prodotto di qualità inferiore. Alcuni dei problemi più comuni per la preparazione di ELP derivano in uno dei seguenti: (1) la qualità delle scorte batteriche stored, (2) il primo gelo-disgelo ciclo per disturbare la membrana batterica e purificazione (3) della proteina attraverso cicli termici.
Una grande differenza tra l'espressione della proteina e altri mezzi non-biologici di produzione di materiali è che noi stiamo sfruttando le macchine biologiche degli eserciti ricombinante per sintetizzare polimeri. Successivamente, questa tecnica viene fornito con un unico limite: danni o morte cellulare. Morte delle cellule più comunemente si manifesta come un ridotto numero di colonie batteriche dopo striature una piastra o anormalmente piccole colonie che si sviluppano relativamente lentamente. Batterica delle scorte, se mantenute con attenzione, possono rimanere stabile per anni; Tuttavia, cicli di gelività successivi a causa di ripetuti fallimenti di uso o congelatore possono ridurre la vitalità cellulare o portare a danni al DNA. Scorte di batteri tipiche BL21 utilizzano tra 10% e 40% glicerolo in volume miscelato con cellule sospese. Lo scopo del glicerolo è di ridurre il danno della membrana da nucleanti cristalli di ghiaccio durante il congelamento. Pertanto, l'utilizzo di basse concentrazioni (< 10%) può portare ad una membrana compromessa, mentre le più alte concentrazioni (> 40%) può sopprimere il punto di congelamento sufficientemente a dove lo stock non gela mai che porta alla morte delle cellule. Tuttavia, anche all'interno di livelli ottimali di glicerolo, scorte batteriche non essere debba completamente disgelo come una combinazione di danno della membrana dagli effetti citotossici e ri-congelamento dal glicerolo può portare a ridotta redditività stock e danno del DNA. Pertanto, se si osserva che uno stock batterico provoca un conteggio basso Colonia o che le cellule si dividono a una velocità costantemente lenta (che si manifesta come una lenta velocità di rampa600 OD durante espressione), ri-trasformando il plasmide e fare un nuovo stock è un semplice primo approccio per risolvere questo problema. Con questo in mente, per assicurare il mantenimento a lungo termine delle scorte batteriche e integrità del DNA, si consiglia di archiviare le copie del vostro plasmide come DNA purificato congelato in acqua e non all'interno delle cellule. Conservazione del DNA in questo modo farà in modo che in eventi imprevisti come un magazzino non riuscita o il fallimento di congelatore, una fonte affidabile di DNA originale può essere utilizzata per la trasformazione.
Un altro passo fondamentale nella fabbricazione di ELP è la purificazione della proteina dell'obiettivo dall'host espressione. Estrazione di proteine da e. coli è raggiunto dalla rottura della parete cellulare utilizzando nucleanti cristalli di ghiaccio che si formano in tutta la cellula sospesa lisata al congelamento, che è ulteriormente aggravata con cicli di gelo-disgelo successivi. Metodi alternativi per la rottura della parete cellulare possono essere utilizzati ad esempio sonicazione o un tasto. In particolare, consecutivo congelamento-scongelamento del lisato è vantaggioso in quanto richiede solo un congelatore e senza altre attrezzature speciali. Tuttavia, questa procedura rilascia non specifico di DNA, RNA e proteine contaminanti, oltre alle proteasi che hanno il potenziale per degradare la proteina bersaglio. Pertanto, per evitare la contaminazione e ridotto rendimento, desossiribonucleasi I (DNasi) ed il fluoruro di fenilmetanosolfonil (PMSF) stiamo aggiunta la cella lysata di degradare il DNA e di inibire le proteasi, rispettivamente. La presenza di DNA prima dell'aggiunta della dnasi può essere osservata visivamente come un aspetto 'filante' in tutta la cellula ri-sospensione lisata seguendo il primo disgelo. Dnasi attivamente degrada questo DNA e così riduce la viscosità della cella lysata rendendo più facile per purificare tramite centrifugazione. Abbattere ottimale del DNA può essere confermata visivamente facendo in modo che il lisato cellulare sembra essere completamente liquido e che l'aspetto filante non è più visibile. In pratica abbiamo osservato che l'aggiunta di ~0.1 mg di dnasi al lysate delle cellule mL è sufficiente per raggiungere la necessaria degradazione. Tuttavia, se ancora si osserva la presenza di DNA, DNasi ulteriori possono essere aggiunti seguita da ulteriori due o tre ore di agitazione. Un problema simile può verificarsi anche se dnasi viene aggiunto in modo anomalo prima di qualsiasi del lisato ha avuto il potenziale sufficientemente scongelare. In questo caso, le temperature più fredde possono limitare l'efficienza di degradazione del DNA a causa dell'inattivazione precoce della dnasi. Per evitare questo problema, è spesso consigliabile consentire risospeso a scongelare per circa 8 ore prima del trattamento con dnasi. Inoltre, se rese povere in proteine sono segnalate e la ripartizione del DNA è stata sufficiente, l'aggiunta di ulteriori PMSF per contribuire a ridurre ulteriormente il potenziale degradazione proteica da proteasi può essere richiesto.
Considerazioni aggiuntive per garantire l'espressione ottimale di ELPs includono un'attenta comprensione dei benefici e le limitazioni di un antibiotico scelto. Qui, i vettori di pET15b contenente un gene di resistenza all'ampicillina sono stati utilizzati per l'espressione della proteina. Funzionalmente, la serie di animali vettore consentono l'espressione della proteina significativo con oltre il 50% dell'espressione della proteina di un batterio dedicato alla proteina bersaglio seguendo una riuscita induzione32,33. Tuttavia, ampicillina come antibiotico di selezione viene fornito con alcune limitazioni che potrebbero interferire con l'espressione ottimale. In primo luogo, la degradazione di ampicillina in presenza di Escherichia coli può accadere rapidamente a causa del rilascio di beta-lactamase. Se una quantità sufficiente di all'ampicillina è degradata, il plasmide che codifica ampicillina (cioè il plasmide che codifica ELP) vadano perso completamente. Di conseguenza, quando esprimendo ELPs per periodi più lunghi, i livelli di espressione di proteine devono essere attentamente monitorati in momenti successivi per garantire una quantità sufficiente del gene codifica ELP rimane per consentire l'espressione desiderabile. Possibili metodi per la risoluzione dei problemi l'accumulo di beta-lattamasi includono filatura giù la coltura starter e ri-sospende le cellule in medium senza antibiotico prima di inoculare il mezzo di espressione. Questo processo in modo efficace limita il trasferimento degli enzimi degradanti Antibiotico e assicura una maggiore porzione di cellule contengano il vettore di codifica di destinazione-proteina. Inoltre, ampicillina ha una durata limitata di circa due o tre settimane. Pertanto, piastre di coltura per l'espressione della proteina dovrebbero essere conservati a 4 ° C per un massimo di due settimane prima di utilizzare. Infine, per garantire l'efficacia di ampicillina nei media starter ed espressione, la soluzione di riserva di ampicillina dovrebbe essere fresco prodotto immediatamente prima dell'uso, come stoccaggio a lungo termine può portare a un antibiotico meno efficace.
La presenza di un LCST consente la semplice purificazione di ELPs attraverso cicli termici. In particolare, ad una temperatura superiore e in presenza di sali, forze entropiche causano ELPs diventare meno solubili e successivamente formano una fase di coacervate ricca di polimero. D'altra parte, a temperature più basse, ELPs rimangono solubili e prontamente si dissolvono nella soluzione. In bicicletta tra questi regimi di due temperatura accoppiati con procedura di centrifugazione per raccogliere e scartare la fase non contenente ELP successivamente si concentra la proteina e contemporaneamente riduce l'esistenza di contaminanti non-ELP.
Tuttavia, ci sono una serie di fasi, dove ELPs può essere perso in questo processo di purificazione. In primo luogo, prima di ogni giro freddo, la soluzione contenente proteine è alcalinizzata ad un pH di 9,0. Questo pH superiore serve a deprotonate alcuni aminoacidi sulla spina dorsale della proteina, efficacemente lasciandoli in uno stato di caricato e rafforzare ulteriormente la loro solubilità. Di conseguenza, precede questo passaggio o non consentire tempo sufficiente per lo scioglimento di proteine può portare a una diminuzione delle rese come proteine solubilizzate non saranno pellettati durante la centrifugazione e scartati.
Allo stesso modo, proteine bersaglio possono essere persi durante la procedura di rotazione caldo quando l'ELP è pellettati. Inizialmente, NaCl è aggiunto al supernatante ricco di proteine per ridurre la solubilità del PEL. I sali di lavorano per proteggere interazioni elettrostatiche tra le molecole di acqua e proteine, causando la proteina separare dalla fase acquosa. Questo effetto è amplificato riscaldando la soluzione, che, a causa di effetti entropici, ulteriormente l'idrato 'gabbia' che circonda ELPs si rompe e costringe l'aggregazione delle proteine. Alle concentrazioni più basse di proteina (cioè., il primo ciclo termico), l'aggiunta di sali da solo spesso non è sufficiente a causare questa separazione di fase. Tuttavia, come la concentrazione di proteina aumenta (cioè., più tardi i cicli termici) e ci sono meno contaminanti secondari per interagire con i sali, l'ELP precipiterà più prontamente. Di conseguenza, se sali vengono aggiunti troppo rapidamente, essi potrebbe diventare fisicamente intrappolati mediante l'aggregazione di proteine, che efficacemente riduce la concentrazione salina della soluzione e limita ulteriore precipitazione della proteina. Così, il sale deve essere aggiunto in tre piccoli lotti per garantire che abbiano il tempo sufficiente per distribuire omogeneamente attraverso la soluzione. Come nota finale, variazioni per la spina dorsale ELP, sia attraverso ulteriori modifiche al residuo degli ospiti della regione elastino-simili o cambiamenti nella regione di bio-attivi possono influenzare notevolmente il comportamento LCST. Di conseguenza, per garantire rendimenti ottimali della proteina in varianti della proteina, è fondamentale ottimizzare il pH e la concentrazione di sale sale tipo (ad es., monovalenti o bivalenti) per i giri caldi e freddi.
Come può essere utilizzato per determinare facilmente se perdita significativa di ELP si verifica durante una qualsiasi delle fasi di purificazione, è consigliabile eseguire SDS-PAGE al completamento del protocollo. Brevemente, se ELP è rilevato nel surnatante seguendo un giro caldo, quindi la proteina non è essere efficacemente precipitata. Allo stesso modo, se ELPs sono identificati in un campione di pellet solubilizzate seguendo un giro freddo, quindi la proteina non viene efficacemente dissolto.
ELP idrogel offrono molti vantaggi rispetto ai materiali sintetici o di derivazione naturale. In particolare, l'uso dell'ammina-reattivo crosslinker THPC offre un meccanismo di basso costo, semplice e sintonizzabile di reticolazione della proteina. Tuttavia, esistono limitazioni distinte all'interno del protocollo di reticolazione che dovrebbe essere notato. THPC è ossigeno sensibile, e se conservati in condizioni non adeguate, può rapidamente deteriorarsi in efficienza di reazione. Inoltre, a causa della sua reattività con le ammine primarie, THPC può reagire con circostante proteine nei media o quelli sulla superficie delle cellule che sono ricche di ammine. Di conseguenza, quando si formano gli idrogeli ELP, è consigliabile per evitare la contaminazione di media con il pellet cellulare per ridurre la reattività crociata possibili proteine esogene e così, una riduzione nell'efficienza di reticolazione. Infine, questo meccanismo di reticolazione preclude la sequenza di bio-attivi regione a quelli non contenenti residui di lisina e limita quindi, potenziale integrazione di alcuni motivi di cella-adesivo (ad es., IKVAV34). Per risolvere queste limitazioni, modifiche per la spina dorsale ELP con azide e bicyclononyne (BCN) soci di reazione permette di reticolazione bio-ortogonali, come descritto in precedenza27.
Si deve osservare che il comportamento di ELP LCST svolge un ruolo importante nel dettare idrogel microstruttura. A regimi di temperatura sopra il LCST, ELPs precipitare dalla soluzione la formazione di fasi ricche in proteine e proteina-carente che possono influenzare la porosità della matrice e dell'efficienza di reticolazione della matrice9. Perché maggior parte degli esperimenti di coltura cellulare sono condotti a temperature fisiologicamente rilevanti (~ 37 ° C) sopra il LCST ELP, questi effetti dovrebbero essere considerati. Nel caso degli idrogeli efficacemente crosslink e forma una rete interconnessa di proteina, l'ammina primaria dalla lisina deve essere fisicamente accessibile per il reticolante THPC. Se l'aggregazione di ELP si verifica prima di raggiungere la reticolazione sufficienti, ELPs intrappolato all'interno della fase ricca di proteine può essere inaccessibile e quindi incapace di partecipare a reticolazione. Per risolvere questa limitazione, il nostro protocollo richiede un periodo di reticolazione iniziale 15 min a temperatura ambiente, che consente di reticolazione preliminare dell'idrogel prima l'ELP subisce la transizione di fase termica. Questa incubazione a temperatura ambiente è seguita da un'incubazione di ulteriori 15 min a 37 ° C per finalizzare la reticolazione di idrogel. Questa procedura è fondamentale per reticolazione sufficienti e robusto, riproducibile gelificazione del materiale ELP.
In conclusione, la proteina ricombinante idrogeli fabbricati con ELP offrono eccezionale accordabilità della sequenza della proteina e quindi il microambiente cellulare 3D. Polimeri ELP sono stati dimostrato di essere esprimibili in alti rendimenti, facilmente purificati a causa del loro comportamento LCST e biocompatibile in un'ampia varietà di sistemi in vitro e in vivo . L'uso di e. coli come un host ricombinante fornisce una procedura semplice e poco costoso che dà origine al vicino perfetto controllo del peso molecolare del polimero e la funzionalità. In concomitanza, questa tecnica permette di accordabilità robusto e riproducibilità della piattaforma idrogel permettendo per la cultura di una vasta gamma di tipi di cellule in 3D. Infine, questa piattaforma di idrogel ELP è suscettibile di molti saggi biochimici a valle tra cui qRT-PCR, Western blot, estrazione del DNA e delle cellule che immunostaining9.

Durante il secolo passato, coltura del tessuto bidimensionale (2D) è sviluppato in un set di strumenti integrato per lo studio della biologia fondamentale delle cellule in vitro. Inoltre, i protocolli relativamente basso costo e semplici per la coltura cellulare 2D hanno condotto alla sua adozione attraverso molte discipline biologiche e mediche. Tuttavia, ricerca passata ha dimostrato che le tradizionali piattaforme 2D possono portare a risultati che si discostano sensibilmente da quelli raccolti in vivo, causando tempo prezioso e finanziamenti sprecati per ricerca clinicamente orientata1,2, 3. Noi ed altri suppongono che questa discrepanza può essere attribuita alla mancanza di nativi biochimiche e biofisiche spunti forniti per le cellule coltivate su superfici 2D, che possono essere necessarie per la proliferazione ottimale e maturazione dei vari tipi di cellule.
Per risolvere queste limitazioni e aiuto ponte il divario tra 2D in vitro e in vivo gli studi, i ricercatori hanno sviluppato idrogel tridimensionale (3D) piattaforme per cellulari-incapsulamento1,4,5 ,6. Idrogeli sono materiali ideali per ricapitolare il microambiente endogeno della matrice extracellulare (ECM) in vivo a causa di loro proprietà meccaniche del tessuto-come e struttura gonfio d'acqua che consente il rapido trasporto di nutrienti e segnalazione fattori7,8. Inoltre, idrogeli 3D possono essere progettati per avere controllo indipendente sulle proprietà meccaniche e biochimiche dell'impalcatura. Sia matrice meccanica9,10,11,12 e ligandi cellulari-adesivo13,14,15 sono ben noti per influenzare la cella comportamento in vitro e in vivo. Così, idrogeli 3D con proprietà sintonizzabile offrono una piattaforma per studiare le relazioni causali tra cellule e loro microambiente. Criteri per una matrice di idrogel 3D ideale includono semplice, non citotossica delle cellule-incapsulamento come pure accordabilità indipendente di proprietà meccaniche fisiologicamente rilevanti e mimici di nativi cella-adesivo motivi.
Entrambi sintetico (ad es., polietilenglicole, acido polilattico, poli (acido glicolico)) e di derivazione naturale (ad es., alginato, collagene, Matrigel) idrogeli presentano vantaggi rispetto 2D in vitro piattaforme di cultura; Tuttavia, essi hanno anche notevoli lacune che limitano la loro applicabilità. Primo, molte piattaforme di derivazione naturale e sintetiche richiedono condizioni di reticolazione duro che possono essere potenzialmente tossiche per le cellule di mammiferi, che porta alla diminuzione di attuabilità delle cellule7. Inoltre, molte piattaforme sintetici mancano nativa bioattività e bisogno di essere funzionalizzate attraverso reazioni chimiche secondarie, che possono aggiungere maggiore costo e complessità16. Infine, mentre materiali di derivazione naturale contengono tipicamente intrinseche bio-attivi domini, essi sono spesso afflitti da un'elevata variabilità lotto e spesso sono limitate a formare gel relativamente debole7,17.
Ingegneria delle proteine ricombinanti presenta un unico set di strumenti per la progettazione di materiali consentendo controllo esplicito sulla sequenza della proteina e, per estensione, le potenziali proprietà meccaniche e biochimiche dell'idrogel finale dell'impalcatura18. Inoltre, sfruttando il ben nota macchine biologiche di Escherichia coli (Escherichia coli) per esprimere proteine, materiali possono essere prodotto in modo conveniente e coerente con la variabilità limitata inter - e intra-batch. La proteina elastina-come (ELP) presentata qui ha tre domini ingegnerizzati: (1) un tag T7 e His6 che consente per etichettatura tramite fluorescente contrassegnati gli anticorpi, (2) una regione 'elastin-like' che conferisce proprietà meccaniche elastiche e consente per l'industria chimica reticolazione e (3) una regione 'bio-attivi' che codifica per motivi di cella-adesivo.
Nostra regione di elastina-come si basa sulla canonica sequenza di elastina (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 dove quattro dei 'Xaa' siti dell'amminoacido isoleucina (Ile), ma potrebbero essere progettato per essere qualsiasi amminoacido ad eccezione della prolina. Questa sequenza dota ricombinante ELPs con comportamento di temperatura (LCST) soluzione critica inferiore che può essere sfruttata per post-l'espressione purificazione semplice via19,20di cicli termici. Questa proprietà LCST può essere sintonizzata per termicamente aggregato a temperature diverse modificando l'ospite 'Xaa' residuo21,22.
Qui, la posizione di 'Xaa' su una delle cinque ripetizioni elastina-come è stata sostituita con la presentazione di ammina lisina (Lys) dell'aminoacido, che è utilizzata per la reticolazione di idrogel. Il nostro lavoro precedente ha indicato non citotossica e robusto reticolazione tramite reazione con l'ammina-reattivo crosslinker tetrachis (idrossimetil) fosfonio cloruro (THPC)23. Di varie proteine contenuti e crosslinker concentrazione complessiva, siamo in grado di produrre idrogel che può essere sintonizzato per estendersi su una rigidità fisiologicamente rilevanti gamma (~0.5-50 kPa)9,23,24. Oltre alle proprietà meccaniche di tuning, cellula adesione all'interno dei risultati di idrogel dall'integrazione dei domini canonici di cella-adesivo all'interno la spina dorsale della proteina ELP. Ad esempio, l'incorporazione di estesa fibronectin-derivato 'RGDS' sequenza dell'amminoacido permette delle cellule adesione e flessibilità conformazionale, mentre le uova strapazzate, variante di 'RDGS' non vincolante limita di adesione cellula-matrice24. Modulando il rapporto di cella-adesivo non adesivo proteine come pure la concentrazione nella proteina totale, siamo in grado di produrre in modo efficace gli idrogel che abbracciano una vasta gamma di concentrazione del ligando. Resultantly, abbiamo sviluppato una piattaforma di idrogel con proprietà biochimiche e biofisiche disaccoppiate, che può essere regolato in modo indipendente per coltura ottima 3D di vari tipi cellulari.
Oltre alla matrice di rigidezza e accordabilità legante adesivo, ricombinante idrogel offrono la possibilità di profili di degrado del materiale specifico design, che è necessaria per la diffusione delle cellule, la proliferazione e la migrazione all'interno di un contesto 3D4 , 9. questo degrado è garantito dalla secrezione delle cellule delle proteasi che si rivolgono specificamente elastina-come sequenza25o estesa 'RGDS'9 . ELP idrogeli inoltre sono stati indicati per sostenere le successive analisi biochimiche che sono necessari per lo studio di attuabilità delle cellule e la funzione compreso immunocytochemistry così come estrazione di DNA/RNA/proteine per inversione quantitativa reazione a catena della polimerasi della trascrizione (qRT-PCR) e Western blot9. ELP varianti inoltre sono stati usati in un certo numero di modelli in vivo e sono noti per essere tollerato dal sistema immunitario26.
Presi insieme, ELP come una piattaforma di materiale per gli studi delle cellule-incapsulamento vanta una vasta gamma di vantaggi rispetto alle piattaforme di materiale sintetiche o di derivazione naturale, che spesso non hanno lo stesso grado di accordabilità biochimiche e biofisiche e riproducibilità. Inoltre, non citotossica un di ELP uso semplice e con un'ampia varietà di tipi cellulari (ad es., pulcino radice dorsale dei gangli14,24, progenitrici neurali murini cellule9, cellule staminali mesenchimali umane27, bovino condrociti neonatale28, human endothelial cells29,30) consente per un modello più fisiologicamente rilevante del ECM 3D endogeno rispetto alla coltura delle cellule 2D. Qui, presentiamo un protocollo per l'espressione di recombinantly-derivati, ELPs per l'uso come una piattaforma di idrogel sintonizzabile per 3D cell incapsulamento. Vi presentiamo ulteriormente la metodologia per l'etichettatura fluorescente downstream e microscopia confocale delle cellule incapsulate.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="904">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Elastin-Like Protein Expression and Purification</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% Ethanol</td>
			<td>RICCA Chemical</td>
			<td style="width:123px;">2546.70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A3920-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1760-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">9002-18-0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21(DE3)pLysS Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:260px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0230-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA disodium salt, dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">O2793-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1755-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:260px;">EMD Millipore</td>
			<td>1.10285.5007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:123px;">52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">195381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S 8045-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe Filter Unit (0.22 &#956;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific Broth</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">71754-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#956;m syringe filters</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 mm thick silicone sheet</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:123px;">70338-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (2 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (4 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (5 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">No. 1 12 mm glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">404861-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5% Tryspin/EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td style="width:123px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:260px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">D1306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:260px;">Lampire Biological Labs</td>
			<td style="width:123px;">7332100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16210-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Mouse Nestin Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">556309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Sox2 Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">23064S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Nail Polish</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Hardset Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:123px;">H-1400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of elastin-like protein hydrogels for encapsulation and immunostaining of cells in 3d

Tecniche di coltura tissutale (2D) bidimensionali sono stati essenziali per la nostra comprensione della biologia delle cellule fondamentali. Tuttavia, la mancanza di sistemi di coltura del tessuto 2D tradizionale una matrice tridimensionale (3D), risultante in un significativo scollamento tra risultati raccolti in vitro e in vivo. Per risolvere questa limitazione, i ricercatori hanno creato piattaforme di coltura del tessuto 3D idrogel che possono imitare le proprietà biochimiche e biofisiche del microambiente delle cellule in vivo . Questa ricerca ha motivato la necessità di sviluppare materiale piattaforme che supportano incapsulamento cella 3D e analisi biochimiche a valle. Ingegneria delle proteine ricombinanti offre un unico set di strumenti per disegno materiale idrogel 3D e sviluppo, consentendo il controllo specifico di sequenza della proteina e quindi, per estensione, le potenziali proprietà meccaniche e biochimiche della risultante matrice. Qui, presentiamo un protocollo per l'espressione di recombinantly-elastina-come proteina derivata (ELP), che può essere utilizzato per forma idrogel con proprietà meccaniche regolabili in modo indipendente e concentrazione del ligando delle cellule-adesivo. Presentiamo inoltre una metodologia per l'incapsulamento di cellule all'interno di ELP idrogeli e macchiatura immunofluorescente successive di embedded cellule per analisi a valle e la quantificazione.

Il ELPs utilizzata nel presente protocollo sono costituite da cinque regioni: un tag di T7, His6 tag, sito di clivaggio Enterochinasi (EK), una regione di bio-attivi e una regione di elastina-like (Figura 1). I tag T7 e His6 consentono per una facile identificazione mediante tecniche di Western blot standard. Introduzione del sito di clivaggio EK permette la rimozione enzimatica della regione tag, se necessario. La regione di bio-attivi codifica per l'estesa, fibronectin-derivato delle cellule-adesivo ('RGDS') o sequenze non-adesivo ('RDGS'). Infine, la ripetizione centrale di elastina-come regione contiene un gruppo di lisina presso il sito di residuo di ospiti che permette la reticolazione tramite THPC mentre le ripetizioni fiancheggianti contengono isoleucina per ottenere un LCST di ~ 32 ° C31.
Espressione di post, SDS-PAGE o Western blot può essere utilizzato per visualizzare il peso molecolare e confermare l'identità di ELPs che contengono tag di anticorpo, come T7 (MASMTGGQQMG) o His6 (Filippo) (Figura 2). Un prodotto altamente omogeneo rappresentato dalla presenza di una singola banda scura al peso molecolare approssimativo (~ 37 kDa) risultato dell'espressione di successo in condizioni controllate di queste proteine usando entrambi SDS-PAGE (Figura 2A) e Western blot ( Figura 2B).
In condizioni non controllate, la presenza di fasce di peso molecolare inferiore su una macchia occidentale suggerisce che alcune frazioni delle proteine non è stato completamente tradotto e/o sono stati degradati dopo espressione (Figura 2). In particolare, le masse qui sono spaziate uniformemente da ~ 9 kDa che corrisponde al peso di una regione bio-attivi e tre regioni di elastina-come (una ' ripetizione'), o circa un quarto della proteina bersaglio. Questi piccoli frammenti di proteine sono solitamente presenti quando l'espressione viene effettuata ad una temperatura superiore (> 32 ° C) come in Figura 2. La presenza di queste proteine di peso molecolare inferiore può condurre alle proprietà meccaniche imprevedibile. Così, screening regolari post espressione raccomanda di garantire un prodotto finale di alta qualità.
La rigidità meccanica di idrogeli ELP-base può essere modificata modificando la concentrazione di ELP o il rapporto delle ammine primarie di THPC gruppi reattivi: ELP. Contemporaneamente, la concentrazione di ligandi cellulari-adesivo può essere regolata modificando il rapporto di varianti ELP con il cellulare-adesivo (RGDS) alle sequenze (RDGS) non adesiva all'interno di qualsiasi regime di rigidità. Manipolando queste due variabili, possiamo produrre gel che hanno uno spettro di proprietà meccaniche e concentrazioni di ligando (Figura 3).
Per incapsulare le celle all'interno di 3D ELP idrogeli, il numero di celle desiderato è sospese nel mezzo e centrifugato per produrre un pellet cellulare (Figura 4A). Il mezzo è aspirato dal tubo, e le cellule sono risospese in modo uniforme nella soluzione ELP della concentrazione desiderata. Successivamente, THPC soluzione è aggiunto alla sospensione cellulare/ELP e pipettato accuratamente per formare un impasto omogeneo. Questa soluzione è rapidamente trasferita a stampi di silicone sterile all'interno di una piastra a 24 pozzetti usando una pipetta e permesso di reticolano a temperatura ambiente e 37 ° C per 15 min ciascuna (Figura 4B). Infine, il mezzo è aggiunto alla piastra ben e incubato a 37 ° C nell'esperimento.
Live/dead macchiatura può essere utilizzata per valutare la vitalità cellulare e incapsulamento riuscito della cellula all'interno di idrogeli ELP. Come illustrato nella Figura 5, le cellule progenitrici neurali murino adulto (NPC) mostrano la vitalità cellulare alta oltre 7 giorni all'interno di un idrogel ELP del 3% (p/v).
3D ELP idrogeli sono stati precedentemente indicati per sostenere la manutenzione di staminali NPC misurato attraverso l'espressione di marcatori di canonico NPC proteina SRY (sesso che determina regione Y)-box 2 (Sox2) e nestina9. NPC incapsulato in idrogel ELP 3% (p/v) con basso THPC reticolazione Visualizza alta espressione del nucleare localizzato Sox2 e filamenti citoplasmici nestina via immunostaining e imaging confocale (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig1.jpg"> Figura 1 : Una rappresentazione schematica della ELP e sequenze dell'amminoacido corrispondente. L'ELP utilizzato in questo studio contiene un tag T7 e His6 per imaging basati su anticorpi, una regione bioattiva per introduzione di cella-adesivo domini e una regione di elastina-come che conferisce proprietà meccaniche elastiche e permette per la reticolazione chimica. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig2.jpg"> Figura 2 : L'espressione della proteina target possa essere convalidato con SDS-PAGE e Western blot per confermare il peso molecolare e l'identità del prodotto liofilizzato finale. ELP full-length puro viene eseguito a un peso molecolare di kDa 37 come riportato da entrambe le SDS-PAGE (A) e Western blot utilizzando il T7 (MASMTGGQQMG) o istidina tag (ALTHEO) 6 (B). (C). lotti impuri di ELP dovuto le deviazioni dal protocollo di espressione di ELP possono portare all'espressione di ELPs con peso molecolare inferiore. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig3.jpg"> Figura 3: Contenuto di legante RGDS può essere regolato in modo indipendente da proprietà meccaniche all'interno di idrogeli ELP. 5% (p/v) e il 3% (p/v) ELP idrogeli hanno moduli di taglio di ~ 800 Pa e ~ 400 Pa, rispettivamente. Idrogel con un rapporto di 1:1 delle ammine primarie di gruppi reattivi: ELP THPC erano reticolato a temperatura ambiente per 15 min, riscaldata a 37 ° C e permesso di equilibrare per 5 minuti prima della misurazione. I dati sono la media ± SD, *p < 0,001. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig4.jpg"> Figura 4: Schematica di incapsulamento di cellule in idrogel ELP. (A). le cellule sono dissociate inizialmente in una sospensione unicellulare a medio e pellettato utilizzando una centrifuga. Il mezzo è aspirato dal tubo, e le cellule sono ri-sospese in soluzione ELP alla concentrazione desiderata e mescolare bene. Infine, la soluzione di reticolazione THPC è aggiunto e mescolata bene. (B). immediatamente dopo l'aggiunta di THPC, la soluzione viene colata in uno stampo in silicone con una pipetta. La soluzione è consentita reticolano a temperatura ambiente per 15 minuti, seguita da una seconda incubazione di 15 min a 37 ° C. Il mezzo viene quindi aggiunto alla cultura bene per tutta la durata dell'esperimento. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig5.jpg"> Figura 5: Cellule progenitrici neurali mantengono alta redditività in idrogel ELP. Immagine rappresentativa di cellule progenitrici neurali incapsulato nel 3% (p/v) ELP idrogel con reticolazione di 1:1 (ammine primarie di gruppi reattivi: ELP THPC) dopo 7 giorni nella cultura. Verde: vivere colorazione (calceina-AM); Rosso: morti macchiatura (omodimero di etidio). Barra della scala = 100 µm.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig6.jpg"> Figura 6 : Supportano 3D ELP idrogeli espressione progenitrici neurali delle cellule staminali maker. Immagine di immunofluorescenza delle cellule progenitrici neurali esprimendo Sox2 e nestina proteine dopo 7 giorni di cultura in idrogel ELP. Le immagini mostrano cellule incapsulate in gel ELP 3% (p/v) con 0.5:1 reticolazione (ammine primarie di gruppi reattivi: ELP THPC). Blu: DAPI (nuclei); Rosso: Sox2; Verde: nestina. Barra della scala = 25 µm. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Idrogeli di ingegneria della proteina ricombinanti sono vantaggiosi per la coltura cellulare 3D poiché consentono completa accordabilità della catena polimerica e di conseguenza, il microambiente delle cellule. Qui, descriviamo il processo di purificazione della proteina ricombinante elastino-simili e la sua applicazione in incapsulamento cella 3D idrogel.

Produzione di elastina-come proteina idrogeli per incapsulamento e Immunostaining delle cellule in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

production-elastin-like-protein-hydrogels-for-encapsulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.2K Views.  Stanford University. Idrogeli di ingegneria della proteina ricombinanti sono vantaggiosi per la coltura cellulare 3D poiché consentono completa accordabilità della catena polimerica e di conseguenza, il microambiente delle cellule. Qui, descriviamo il processo di purificazione della proteina ricombinante elastino-simili e la sua applicazione in incapsulamento cella 3D idrogel.

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Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Ordinazione di singole cellule e singola embrioni in 3D confinamento: Un nuovo dispositivo per l&#39;alta Screening contenuti

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Ricerca

Bioingegneria

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Migliorata 3D idrogel culture di cellule gliali primari In Vitro modellazione del Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Misurazione della proteinasi metallica della matrice cellulare globale e l'attività metabolica in idrogel 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Ceppo controllato di idrogel 3D in imaging a microscopia dal vivo

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

Fermentazioni a controllo leggero per la produzione chimica microbica e proteica

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Produzione automatizzata su larga scala di sferoidi a cellule staminali di derivazione adiposa per la bioprinting 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have many advantageous properties, including injectability, microscale porosity, and tunability by mixing multiple microgel populations. Methods to fabricate microgels often rely on water-in-oil emulsions (e.g., microfluidics, batch emulsions, electrospraying) or photolithography, which may present high demands in terms of resources and costs, and may not be compatible with many hydrogels. This work details simple yet highly effective methods to fabricate microgels using extrusion fragmentation and to process them into granular hydrogels useful for biomedical applications (e.g., 3D printing inks). First, bulk hydrogels (using photocrosslinkable hyaluronic acid (HA) as an example) are extruded through a series of needles with sequentially smaller diameters to form fragmented microgels. This microgel fabrication technique is rapid, low-cost, and highly scalable. Methods to jam microgels into granular hydrogels by centrifugation and vacuum-driven filtration are described, with optional post-crosslinking for hydrogel stabilization. Lastly, granular hydrogels fabricated from fragmented microgels are demonstrated as extrusion printing inks. While the examples described herein use photocrosslinkable HA for 3D printing, the methods are easily adaptable for a wide variety of hydrogel types and biomedical applications.

This work describes straightforward, adaptable, and low-cost methods to fabricate microgels with extrusion fragmentation, process the microgels into injectable granular hydrogels, and apply the granular hydrogels as extrusion printing inks for biomedical applications.

Frammentazione di idrogel sfusi e lavorazione in idrogel granulari per applicazioni biomediche

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have ...

Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark of cardiac and musculoskeletal tissues. To study cell response to aligned microenvironments in vitro, several protocols have been developed to generate COL1 matrices with defined fiber alignment, including magnetic, mechanical, cell-based, and microfluidic methods. Of these, microfluidic approaches offer advanced capabilities such as accurate control over fluid flows and the cellular microenvironment. However, the microfluidic approaches to generate aligned COL1 matrices for advanced in vitro culture platforms have been limited to thin "mats" (&lt;40 &#181;m in thickness) of COL1 fibers that extend over distances less than 500 &#181;m and are not conducive to 3D cell culture applications. Here, we present a protocol to fabricate 3D COL1 matrices (130-250 &#181;m in thickness) with millimeter-scale regions of defined fiber alignment in a microfluidic device. This platform provides advanced cell culture capabilities to model structured tissue microenvironments by providing direct access to the micro-engineered matrix for cell culture.

This protocol demonstrates the use of a microfluidic channel with changing geometry along the fluid flow direction to generate extensional strain (stretching) to align fibers in a 3D collagen hydrogel (&lt;250 &#181;m in thickness). The resulting alignment extends across several millimeters and is influenced by the extensional strain rate.

Idrogel di collagene 3D di microingegneria con allineamento delle fibre a lungo raggio

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...