Yazarlar T. Palmer teşekkür ve H. Şekil 4 fare NPCs. vektör sanat sağlamak için Babu (Stanford Nöroşirürji) kullanılmış ve sunucusu tıbbi Sanat altında Creative Commons Attribution 3,0 dağıtıma açıktır Lisansı (https://creativecommons.org/ uyarlanmıştır licenses/by/3.0/legalcode). Bu eser parçası, Stanford Nano paylaşılan özellikleri (Ödülü ECCS-1542152 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen SNSF), gerçekleştirildi. Üssü destek üzerinden ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri (32 GM 008412) olarak kabul eder. C.M.M. bir NIH NRSA desteğinden önceden Doktora Bursu (F31 EB020502) ve Siebel akademisyenler Program kabul eder. S.C.H. Ulusal Sağlık Enstitüleri (U19 AI116484 ve R21 EB018407), Ulusal Bilim Vakfı (DMR 1508006) ve California Institute desteği rejeneratif tıp (RT3-07948) kabul eder. Bu araştırma Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve insan geliştirme (NICHD), Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen İttifak'ın rejeneratif rehabilitasyon araştırma ve eğitim (AR3T), fon aldı Nörolojik bozukluklar ve kontur (NINDS) ve Ulusal Enstitüsü Biyomedikal görüntüleme ve Biyomühendislik (NIBIB) Ulusal Ödülü numarası P2CHD086843 altında Sağlık Enstitüleri. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri görüşlerini temsil etmiyor.

<ol>
	<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+Cell-Matrix+Adhesions+to+the+Third+Dimension.">Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li><li>Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+perturbation+in+vitro-A+growing+case+for+three-dimensional+(3D)+culture+systems.">Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).</li><li>G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expression+of+differentiated+functions+in+hepatocytes+cultured+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix.</a> Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).</li><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+opens+new+dimensions+in+cell-based+assays.">3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays.</a> Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture.">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Madl, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+neural+progenitor+cell+stemness+in+3D+hydrogels+requires+matrix+remodelling.">Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling.</a> Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate.">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li><li>Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+Regulates+Fate+Decisions+of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells.</a> PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).</li><li>Ehrbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+Role+of+Matrix+Stiffness+in+3D+Cell+Migration+and+Remodeling.">Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling.</a> Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).</li><li>Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+osteogenic+and+myogenic+differentiation+of+MSCs:+interplay+of+stiffness+and+adhesive+ligand+presentation.">Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).</li><li>Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+three-dimensional+engineered+protein+hydrogels+for+tailored+control+of+neurite+growth.">Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth.</a> Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).</li><li>Kilian, K. A., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+Stem+Cell+Fate+by+Controlling+the+Affinity+and+Density+of+Ligand-Receptor+Interactions+at+the+Biomaterials+Interface.">Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).</li><li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Hydrogel+Substrates+with+Tunable+Mechanical+Properties.">Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+A+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+Materials+through+Modular+Protein+Engineering.">Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering.</a> Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+and+characterization+of+elastin-like+polypeptides+(ELPs)+with+variable+guest+residues.">Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues.</a> Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).</li><li>McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Topographic+Imaging+of+Environmentally+Responsive,+Elastin-Mimetic+Hydrogels.">High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels.</a> Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).</li><li>McMillan, R. A., Conticello, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Characterization+of+Elastin-Mimetic+Protein+Gels+Derived+from+a+Well-Defined+Polypeptide+Precursor.">Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor.</a> Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).</li><li>Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrakis(hydroxymethyl)+Phosphonium+Chloride+as+a+Covalent+Cross-Linking+Agent+for+Cell+Encapsulation+within+Protein-Based+Hydrogels.">Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).</li><li>Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+RGD+ligand+density+and+L1CAM-mediated+Schwann+cell+interactions+synergistically+enhance+neurite+outgrowth.">Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth.</a> Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).</li><li>Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+elastin-like+polypeptide+nanoparticles.">Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles.</a> Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).</li><li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering.">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).</li><li>Madl, C. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine-Selective+Functionalization+for+Bio-Orthogonal+Cross-Linking+of+Engineered+Protein+Hydrogels.">Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels.</a> Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).</li><li>Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-like+protein-hyaluronic+acid+(ELP-HA)+hydrogels+with+decoupled+mechanical+and+biochemical+cues+for+cartilage+regeneration.">Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration.</a> Biomaterials. , 132-140 (2017).</li><li>Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Orthogonally+Crosslinked,+Engineered+Protein+Hydrogels+with+Tunable+Mechanics+and+Biochemistry+for+Cell+Encapsulation.">Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation.</a> Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).</li><li>Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+synthesis+of+elastin-like+polypeptide+hydrogels+with+grafted+VEGF-mimetic+peptides.">One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides.</a> Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).</li><li>Straley, K. S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+tuning+of+multiple+biomaterial+properties+using+protein+engineering.">Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering.</a> Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).</li><li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli.">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li><li>Graumann, K., Premstaller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+recombinant+therapeutic+proteins+in+microbial+systems.">Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems.</a> Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).</li><li>Tashiro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Peptide+Containing+the+IKVAV+Sequence+from+the+A+Chain+of+Laminin+Mediates+Cell+Attachment,+Migration,+and+Neurite+Outgrowth.">A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Rekombinant protein ifade ve arıtma ile yüksek tekrarlanabilirlik Biyomalzeme sentezlemek için güçlü bir araç var. Ticari moleküler klonlama advent büyük ölçüde nedeniyle, özel rekombinant plazmid birkaç terdarikçilerin ELPs gibi malzemeler ile çalışmak için zaman önemli ölçüde küçültür satın alınabilir. Benzer şekilde, plazmid doğrudan kaynak laboratuvardan ne zaman orijinal çalışma bir federal anlaşma tarafından desteklenen ve gelecekteki iş kar amacı gütmeyen kullanım için olacak istenebilir. Tam ELP amino asit dizisi daha önce birkaç ELP türevleri31için yayınladı. Ancak, ifade işlemi rekombinant proteinlerin nihai arıtma için genellikle düşük verimleri veya daha düşük kaliteli bir ürün yol açabilir kritik adımlar bir dizi içerir. ELP kursları en yaygın sorunlardan bazıları aşağıdakilerden birini ortaya çıkar: (1) saklı bakteriyel stokları kalitesini, (2 ilk donma-çözülme döngüsü bakteriyel membran ve termal aracılığıyla (3) protein saflaştırma bozmaya.
Biz biyolojik makine polimerler sentezlemek için rekombinant ana yararlanarak protein ifade ve malzemeleri üreten diğer biyolojik olmayan araçlarla arasında büyük bir fark olduğunu. Daha sonra bu teknik bir benzersiz sınırlama ile gelir: hücresel ölüm ya da zarar. Hücre ölümü en çok bakteri kolonileri azaltılmış bir dizi olarak bir tabak ya da nispeten yavaş yavaş büyümeye anormal derecede küçük koloniler çizgiler sonra ortaya çıkmaktadır. Bakteriyel hisse senetleri, dikkatli bir şekilde muhafaza Eğer yıl boyunca kararlı kalabilir; Ancak, art arda gelen donma-çözülme döngüsü tekrarlanan kullanımı ya da dondurucu hatası nedeniyle hücre canlılığı azaltmak veya DNA hasara yol. Tipik BL21 bakteri stokları askıya alınan hücrelerle karışık hacmen % 10 ve % 40 gliserol arasında kullanın. Gliserol membran zarar donma sırasında buz kristalleri nucleating azaltmak için amaçtır. Bu nedenle, düşük konsantrasyonlarda kullanarak (< % 10) daha yüksek konsantrasyonlarda sırasında güvenliği aşılan bir membran yol açabilir (> % 40) yeterince için nerede hisse senedi donuyor hiç hücre ölümü için önde gelen donma noktası önleyebilirsiniz. Ancak, en iyi gliserol seviyede bile, bakteriyel hisse senetleri için tamamen yeniden donma ve sitotoksik etkilerinden gliserol membran hasarı birleşimidir yol açabilir gibi tezcan hisse senedi canlılığı ve DNA hasarı azaltmak izin verilmemelidir. Bu bakteriyel bir hisse senedi bir düşük koloni sayımı sonuçları veya hücre sürekli olarak yavaş bir hızda (yavaş OD600 rampa oranı ifade sırasında tecelli) bölünmesi görülmektedir, bu nedenle, plazmid yeniden dönüştürme ve yeni bir stok yapma basit bir ise Bu sorunu gidermek için ilk yaklaşım. Bunu aklýnýzda tutarak, bakteriyel hisse senetleri uzun vadeli bakım ve DNA, bütünlüğünü sağlamak için bu saf DNA su ve hücre içinde donmuş olarak, plazmid kopyalarını depolamak en iyisidir. Bu şekilde DNA depolamak başarısız hisse senedi veya dondurucu başarısızlık gibi beklenmedik olaylar, dönüşüm için orijinal DNA'ın güvenilir bir kaynak kullanılabilir sağlayacaktır.
Başka bir kritik ELP imalat ifade ana hedef protein saflaştırma adımdır. E. coli çıkarma protein daha fazla ardışık donma-çözülme çevrimleri ile bileşik olduğunu askıya alınan hücre dondurma üzerine, lysate boyunca formu nucleating buz kristalleri kullanarak hücre duvarı kırarak elde edilir. Hücre duvarı parçalanma için alternatif yöntemler sonication veya bir basın gibi yararlı olabilir. Sadece bir dondurucu ve diğer özel ekipman gerektirir gibi özellikle, lysate, üst üste dondurma çözdürme avantajlıdır. Ancak, bu yordamı nonspecifically DNA, RNA ve protein kirleticiler, hedef protein bozulmasına yol açar potansiyeline sahip proteaz yanı sıra serbest bırakır. Bu nedenle, için kirlenmesini önlemek ve verim, ben (DNaz) ve phenylmethanesulfonyl florür (PMSF) hücre DNA aşağılamak ve proteaz, sırasıyla inhibe lysate eklenir deoksiribonükleaz azaltılmış. DNA'ın varlığını DNaz eklenmesi önce görsel olarak yeniden askıya alınan hücre boyunca 'kılçıklı' bir görünüm olarak ilk tezcan takip lysate görülebilmektedir. DNaz aktif olarak bu DNA'yı düşürür ve böylece viskozite Santrifüjü arındırmak daha kolay hale lysate hücrenin azaltır. DNA'ın en iyi bozulmak görsel olarak hücre lysate tamamen sıvı gibi görünüyor ve lifli görünüm artık görünür olduğundan emin olarak onaylanabilir. Biz pratikte DNaz ~0.1 mg mL hücre lysate başına eklenmesi gerekli bozulması ulaşmak için yeterli olduğunu gözlemledim. DNA varlığı hala görülmektedir, ancak, daha fazla DNaz takip ajitasyon an munzam iki ya da üç saat tarafından eklenebilir. Herhangi bir lysate olmuştur önce yeterince çözülme potansiyeline DNaz zamanından önce eklenirse, benzer bir sorunu da ortaya çıkabilir. Bu durumda, daha soğuk sıcaklıklarda DNA bozulması nedeniyle DNaz erken inactivation verimliliğini sınırlayabilirsiniz. Bu sorunu önlemek için bu kez yaklaşık 8 saat önce DNaz tedaviyle çözülme yeniden askıya alınmış Pelet izin vermek için en iyi yöntem var. Buna ek olarak, düşük protein verimleri bildirilir ve DNA dökümünü yeterli oldu, daha fazla potansiyel protein yıkımı proteaz üzerinden azaltmaya yardımcı olmak için daha fazla PMSF eklenmesi gerekli olabilir.
ELPs en iyi ifade sağlamak için dikkat edilecek diğer noktalar faydaları dikkatli bir anlayış ve seçilmiş bir antibiyotik sınırlamaları içerir. Burada, ampisilin direnç geni içeren pET15b vektörler için protein ifadesi kullanıldı. İşlevsel olarak, evde beslenen hayvan vektör serisi kadar %50 ile önemli protein ifadesidir bir başarılı indüksiyon32,33takip hedef protein adanmış bir bakteri'nın protein ifade sağlar. Ancak, Obama seçim antibiyotik olarak en iyi ifade ile girişime neden olabilir bazı sınırlamalarla birlikte gelir. İlk olarak, ampisilin E. coli huzurunda bozulma hızla beta-lactamase yayın nedeniyle oluşabilir. Ampisilin yeterli miktarda bozulmuş, ampisilin kodlama plazmid (yani ELP kodlama plazmid) tamamen kaybolabilir. Sonuç olarak, ELPs daha uzun süreler için ifade edilirken, protein ifade düzeyleri dikkatle her başarılı zaman noktalarda arzu ifade için izin vermek için yeterli miktarda ELP kodlama gen kalır emin olmak için takip edilmelidir. Beta-laktamaz birikimini sorun giderme için olası yöntemleri starter kültür iplik ve ifade orta aşı önce Orta antibiyotik içermeyen hücreleri yeniden askıya alma içerir. Bu işlem etkin antibiyotik aşağılayıcı enzim devrinin sınırlar ve daha büyük bir bölümünü sağlar hedef protein kodlama vektör hücre içeriyor. Ayrıca, ampisilin yaklaşık 2-3 hafta sınırlı bir raf ömrü vardır. Bu nedenle, kültür plakaları protein ifade için en fazla iki hafta kullanmadan önce 4 ° C'de muhafaza edilmelidir. Son olarak, ampisilin starter ve ifade medya, ampisilin hisse senedi çözüm içinde etkinliği sağlamak için olmak üretilen taze hemen kullanmadan önce uzun süreli depolama için daha az etkili bir antibiyotik neden olabilir gibi.
Bir LCST varlığı ELPs basit arıtma termal aracılığıyla sağlar. Özellikle, daha yüksek bir sıcaklıkta ve tuzları huzurunda, Entropik kuvvetleri ELPs daha az çözünür hale ve daha sonra bir polimer zengini coacervate faz oluşturmak neden. Öte yandan, daha düşük sıcaklıklarda ELPs çözünür kalır ve çözüm içine kolayca çözülür. Toplamak ve ELP içeren faz sırayla atmak için Santrifüjü adımları ile birleştiğinde bu iki sıcaklık rejimleri arasında bisiklet protein konsantreleri ve aynı anda ELP olmayan kirletici varlığı azaltır.
Ancak, nerede ELPs bu arıtma işleminde kayıp olabilir aşamaları bir dizi vardır. İlk olarak, soğuk her spin öncesinde protein içeren çözüm pH 9.0 için alkalized. Bu daha yüksek pH deprotonate için hizmet etkili onları dolu bir durumda bırakarak ve daha fazla kendi çözünürlük geliştirme protein omurga üzerindeki belirli amino asitler. Sigara çözündürüldükten proteinler olması sırasında Santrifüjü pelleted atılır gibi ve sonuç olarak, bu adım yukarıda veya protein dağılması için yeterli zaman izin vermiyor verim bir azalma yol açabilir.
Benzer şekilde, ne zaman seminerine pelleted, sıcak spin işlemi sırasında hedef proteinler kaybolmuş olabilir. Başlangıçta, NaCl seminerine çözünürlük azaltmaya protein açısından zengin süpernatant için eklenir. Tuzları neden sulu faz ayırmak protein protein ve su molekülleri arasındaki elektrostatik etkileşimler kalkan çalışmak. Bu etki, Entropik etkileri nedeniyle daha fazla ELPs çevreleyen sulandırılmışperklorid 'kafes' tatili ve proteinlerin toplama zorlar çözüm Isıtma tarafından güçlendirilmiş. Düşük protein konsantrasyonlarda (i.e., ilk termal döngüsü), tuzları yalnız eklenmesi sık sık bu aşama ayrılık neden için yeterli değil. Ancak, protein konsantrasyonu artırır (i.e., daha sonra ısı devir) ve orada tuzları ile etkileşim daha az ikincil kirleticiler, ELP daha kolay çökelti. Tuzları çok hızlı bir şekilde eklenirse, sonuç olarak, onlar fiziksel olarak proteinler, toplayarak tarafından hangi etkili çözüm tuz konsantrasyonu azaltır ve daha fazla protein yağış sınırlar tuzak haline. Böylece, tuz homojen çözüm dağıtmak için yeterli zaman sahip emin olmak için üç küçük gruplar halinde eklenmelidir. Son bir not olarak Konuk kalıntı değişiklikler elastin benzeri bölgesinin çeşitlemeleri ELP omurgasına, yoluyla daha ya da biyo-aktif bölgesine değişikliklerin önemli ölçüde LCST davranışını etkileyebilir. Sonuç olarak, protein çeşitleri arasında en iyi protein verim sağlamak için bu pH, tuz konsantrasyonu ve tuz türü optimize etmek önemlidir (Örn., monovalent veya divalent) sıcak ve soğuk spin için.
Gibi kolayca önemli bir ELP kayıp herhangi bir arıtma adım sırasında oluşup oluşmayacağını belirlemek için kullanılabilir SDS-sayfa iletişim kuralı tamamlandıktan sonra çalışan öneririz. ELP sıcak bir spin takip süpernatant içinde tespit edilirse, kısaca, sonra protein etkili çöktürülmüş değil. ELPs çözündürüldükten Pelet soğuk bir spin aşağıdaki örnekte tanımlanan, benzer şekilde, sonra protein etkili bir şekilde feshedilmiştir değil.
ELP hydrogels sentetik veya doğal olarak elde edilen malzemeler birçok avantajlar sunuyor. Özellikle, Amin-reaktif crosslinker THPC kullanımı protein crosslinking ucuz, basit ve akort mekanizmasının affords. Ancak, unutulmamalıdır crosslinking iletişim kuralına farklı sınırlamalar vardır. THPC oksijen hassas olduğunu ve uygun olmayan koşullarda depolanmış olsa, hızlı bir şekilde tepki verimliliği bozulabilir. Buna ek olarak, Birincil aminler ile onun reaktivite nedeniyle THPC aminler içinde zengin proteinler medya veya hücre yüzeyinde çevreleyen ile tepki. Bu nedenle, ELP hydrogels oluşturan, bu mümkün eksojen protein olan ve bu nedenle, bir azalma crosslinking etkinliğini azaltmak için hücre Pelet ile medya kirlenmesini önlemek için önerilir. Son olarak, bu crosslinking mekanizma yok lizin kalıntılar içeren biyo-aktif bölge dizisine önler ve böylece, bazı hücre yapışkanlı motifler potansiyel tümleştirme sınırlar (Örn., IKVAV34). Bu sınırlamalar, değişiklikleri adrese ELP omurgasına azid ve bicyclononyne (BCN) ile reaksiyon ortaklarının verir yukarıda açıklanan27olarak biyo-ortogonal crosslinking için.
ELP LCST davranış hidrojel mikroyapı dikte önemli bir rol oynadığı unutulmamalıdır. LCST yukarıda sıcaklık rejimleri ELPs dışarı matris porozite etkileyebilir protein açısından zengin ve protein eksikliği aşamaları oluşumu ve matris9crosslinking verimliliği için önde gelen çözüm çökelti. ELP LCST üzerindeki fizyolojik ilgili sıcaklıklarda (~ 37 ° C) çoğu hücre kültür deneyler yaptı çünkü bu etkiler dikkate alınmalıdır. Hydrogels etkili bir şekilde crosslink ve form için bir birbirine bağlı protein ağ lizin gelen birincil Amin THPC crosslinker fiziksel olarak erişilebilir olmalıdır. ELP toplama yeterli crosslinking ulaşmadan önce ortaya çıkarsa, protein açısından zengin faz içinde sıkışıp ELPs ulaşılmaz ve böylece crosslinking içinde katılmak kurulamıyor olabilir. Bu sınırlama gidermek için bir ilk 15 dk crosslinking dönem ELP onun termal faz geçiş geçer önce hidrojel ön polietilenin sağlayan oda sıcaklığında bizim protokol gerektirir. Bu oda sıcaklığında kuluçka bir ek 15 dk kuluçka 37 ° C'de hidrojel crosslinking sonuçlandırmak için izler. Bu yordamı yeterli crosslinking ve sağlam, tekrarlanabilir jelleşme ELP malzeme için önemlidir.
Sonuç olarak, ELP kullanarak fabrikasyon Rekombinant protein hydrogels protein sıra ve bu nedenle 3D Cep microenvironment olağanüstü ayar sunuyoruz. ELP polimerler vitro ve in vivo sistemleri çok çeşitli olarak gösterilen ifade yüksek verimleri, kolayca LCST davranışlarını sayesinde, saf olmak ve biyouyumlu olmuştur. E. coli kullanımı rekombinant ana bilgisayar olarak polimer molekül ağırlığı ve fonksiyonelliği mükemmel kontrol yakınındaki açmaktadır basit ve ucuz bir yordam sağlar. Birlikte, bu teknik sağlam ayar ve tekrarlanabilirlik bırakmak için geniş bir hücre tiplerinin 3D kültür hidrojel platformu sağlar. Son olarak, bu ELP hidrojel için birçok aşağı akım biyokimyasal deneyleri qRT-PCR, Western blot, DNA ekstraksiyon ve hücre immunostaining9dahil olmak üzere mükellef bir platformdur.

Son yüzyıl içinde iki boyutlu (2D) doku kültürü temel hücre biyolojisi vitroçalışmak için ayrılmaz bir araç haline geldi. Ayrıca, 2D hücre kültürü için nispeten ucuz ve basit protokoller kabulünün için birçok biyolojik ve tıbbi disiplinler arasında açmıştır. Bununla birlikte, araştırmaları bu toplanan vivo içindegelen belirgin sapma, değerli zaman ayrılır ve fon klinik olarak odaklı araştırma1,2içinboşa olduğunu geleneksel 2D platform sonuçlara yol açabilir göstermektedir, 3. Bu tutarsızlık en uygun yayılması ve çeşitli hücre tiplerinin olgunlaşma için gerekli olabilir 2D yüzeylerde kültürlü hücrelere sağlanan yerel Biyokimya ve biyofizik cues eksikliği ilişkilendirilebilir ki biz ve diğerleri öngörmekteyiz.
Bu sınırlamalar ve yardım Köprüsü 2D arasındaki boşluğu gidermek için Gelişmiş üç boyutlu (3D) hidrojel platformlar için hücre-kapsülleme1,4,5 vitro ve in vivo çalışmalar, araştırmacılar var ,6. Hydrogels doku gibi mekanik özellikleri ve besinlerin hızlı ulaşım sağlar su şişmiş yapısı nedeniyle hücre dışı matriks (ECM) vivo endojen microenvironment özetlemek için ideal maddeler olduğunu ve sinyal7,8faktörler. Ayrıca, 3D hydrogels iskele mekanik ve biyokimyasal özelliklerinin üzerinde bağımsız denetim sağlamak için tasarlanabilir. Matris mekaniği9,10,11,12 ve hücre yapışkanlı ligandlar13,14,15 hücre etkilemek için iyi bilinen davranış vitro ve içinde vivo. Böylece, ayarlanabilir özellikleri ile 3D hydrogels hücreler ve onların microenvironment arasındaki nedensel ilişkiyi incelemek için bir platform sunuyoruz. Bir ideal 3D hidrojel matris için ölçüt basit, Sigara sitotoksik hücre kapsülleme yanı sıra fizyolojik ilgili mekanik özelliği bağımsız ayar ve taklit eder yerel hücre yapışkanlı motifler içerir.
Her iki sentetik (Örn., Polietilen glikol, polylactic asit, poli (Glikolik asit)) ve doğal olarak elde edilen (e.g., aljinat, kollajen, Matrigel) hydrogels var avantajları 2D vitro kültür platformlarına; Ancak, aynı zamanda onların uygulanabilirliği sınırı önemli eksiklikleri var. İlk, birçok sentetik ve doğal olarak elde edilen platformlar memeli hücrelere potansiyel olarak toksik olabilir sert crosslinking koşullar gerektirir, önde gelen azalma hücre canlılığı7. Ayrıca, birçok sentetik platformlar yerli bioactivity eksikliği ve artan maliyetini ve karmaşıklığını16ekleyebilirsiniz ikincil kimyasal reaksiyonlar ile functionalized gerekir. Son olarak, doğal olarak elde edilen malzemeler genellikle iç biyo-aktif etki alanları içerir iken, onlar sık sık yüksek toplu iş toplu iş değişkenlik tarafından boğulmuş ve genellikle nispeten zayıf jelleri7,17şekillendirme için sınırlıdır.
Protein sıra üzerinde açık denetime izin vererek Rekombinant protein mühendislik malzemeleri tasarımı için benzersiz bir araç seti sunar ve uzatma tarafından son hidrojel potansiyel mekanik ve biyokimyasal özelliklerinin18İskele yapısı. Ayrıca, Escherichia coli (e.coliproteinler ifade etmek için) iyi bilinen biyolojik makine yararlanarak, malzemeler düşük maliyetle ve tutarlı bir şekilde sınırlı Inter - ve içi-toplu değişkenliği ile üretilmektedir. Burada sunulan elastin benzeri protein (ELP) üç mühendislik etki alanı vardır: (1) bir T7 ve His6 etiket etiketleme yoluyla fluorescently antikorlar öğesini için izin veren, elastik mekanik özellikleri confers ve kimyasal için izin veren (2) bir 'elastin-gibi' bölgesi Crosslinking ve (3) hücre yapışkanlı motifler için kodlar 'biyo-aktif' bölge.
Elastin benzeri bölgemizde nerede dört 'xaa' amino asit siteleri isoleucine (Ile), ama olabilir herhangi bir amino asit prolin hariç olacak şekilde kurallı (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 elastin sırasını temel alır. Bu sıra rekombinant ELPs19,20Bisiklete binme termal üzerinden basit arıtma sonrası ifade için istismar alt kritik çözüm sıcaklık (LCST) davranışı ile endows. Bu LCST özelliği termal olarak toplamak için farklı sıcaklıklarda Konuk 'Xaa' kalıntı21,22değiştirerek ayarlanabilir.
Burada, bir beş elastin benzeri tekrarlar 'Xaa' konumuna hidrojel crosslinking için kullanılmaktadır Amin sunulması (Lys) lizin amino asit ile değiştirilmiştir. Önceki çalışmalarımız sitotoksik sigara ve sağlam crosslinking Amin-reaktif crosslinker tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium klorür (THPC)23ile reaksiyonu ile göstermiştir. Değişen toplam protein içeriği ve crosslinker konsantrasyon tarafından bir fizyolojik ilgili sertlik aralığı (~0.5-50 kPa)9,23,24span için ayarlanan hydrogels üretmek edebiliyoruz. Mekanik özellikleri ayarlama ek olarak, hücre adezyon hidrojel içinde ELP protein omurga içinde kurallı hücre yapışkanlı etki alanlarının entegrasyonu kaynaklanır. Örneğin, genişletilmiş fibronektin kaynaklı 'RGDS' amino asit dizisi birleşme hücre adezyon ve şifreli, süre konformasyon esneklik sağlar bağlayıcı 'RDGS' değişken hücre-matris yapışması24kısıtlar. Hücre-Yapıştırıcı Yapıştırıcı proteinler hem de toplam protein konsantrasyonu oranını modüle tarafından biz etkili ligand konsantrasyonu geniş bir yayılma hydrogels üretmek edebiliyoruz. Sonuçta, bir hidrojel platform bağımsız olarak çeşitli hücre tiplerinin en iyi 3D kültür için ayarlanan bilgisini iletmiyor biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri ile geliştirdik.
Matris sertlik ve yapışkanlı ligand ayar ek olarak, rekombinant hydrogels hücre yayılan, yayılması ve 3D içerik4 içinde geçiş için gerekli olan tasarım belirli malzeme bozulması profilleri, yeteneği teklif , 9. bu bozulma özellikle genişletilmiş 'RGDS'9 veya elastin benzeri sıra25hedef proteaz hücre salgılanmasını tarafından tanınan. ELP hydrogels hücre canlılığı ve işlev immunocytochemistry yanı sıra DNA/RNA/protein ayıklama nicel reverse için de dahil olmak üzere eğitim için gerekli olan sonraki biyokimyasal testleri desteklemek için de gösterilmiş olan Transkripsiyon-polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) ve Western blot9. ELP türevleri de vivo içinde modeller bir dizi kullandık ve bağışıklık sistemi26tarafından iyi tolere bilinmektedir.
Hücre-kapsülleme çalışmaları için malzeme bir platform çok çeşitli yararları genellikle Biyokimya ve biyofizik ayar aynı derecede eksikliği sentetik veya doğal olarak elde edilen malzeme platformları için karşılaştırıldığında sahiptir olarak birlikte, ELP alınan ve tekrarlanabilirlik. Ayrıca, ELP'ın basit ve sitotoksik sigara kullanımı ile çok çeşitli hücre tiplerinin (Örn., piliç dorsal kök gangliyon14,24, fare nöral progenitör hücre9, insan mezenkimal kök hücrelerin27, sığır Yenidoğan kondrosit28, insan endotel hücreleri29,30) 2D hücre kültürü için karşılaştırıldığında endojen 3D ECM daha fizyolojik ilgili bir model sağlar. Burada, biz recombinantly türetilmiş bir ifade için bir iletişim kuralı mevcut, kapsülleme ELPs tunable hidrojel platformu olarak kullanmak için 3D hücre. Biz daha fazla metodoloji ve kapsüllenmiş hücre confocal mikroskobu aşağı akışı floresan etiketleme için mevcut.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="904">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Elastin-Like Protein Expression and Purification</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% Ethanol</td>
			<td>RICCA Chemical</td>
			<td style="width:123px;">2546.70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A3920-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1760-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">9002-18-0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21(DE3)pLysS Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:260px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0230-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA disodium salt, dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">O2793-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1755-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:260px;">EMD Millipore</td>
			<td>1.10285.5007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:123px;">52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">195381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S 8045-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe Filter Unit (0.22 &#956;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific Broth</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">71754-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#956;m syringe filters</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 mm thick silicone sheet</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:123px;">70338-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (2 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (4 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (5 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">No. 1 12 mm glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">404861-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5% Tryspin/EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td style="width:123px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:260px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">D1306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:260px;">Lampire Biological Labs</td>
			<td style="width:123px;">7332100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16210-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Mouse Nestin Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">556309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Sox2 Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">23064S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Nail Polish</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Hardset Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:123px;">H-1400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of elastin-like protein hydrogels for encapsulation and immunostaining of cells in 3d

İki boyutlu (2D) doku kültürü teknikleri temel hücre biyoloji anlayışımız için gerekli olmuştur. Ancak, geleneksel 2B doku kültürü sistemleri olmaması önemli bir sonuçlanan bir üç boyutlu (3D) matris kesin-den sonuçlanmak arada toplanan vitro ve içinde vivo. Bu sınırlamaya yönelik olarak, araştırmacılar-si mühendislik in vivo hücre microenvironment Biyokimya ve biyofizik özelliklerini taklit edebilirsiniz 3D hidrojel doku kültürü platformlar. Bu araştırma gerek 3D hücre saklama ve aşağı akım biyokimyasal testleri destek malzeme platformlar geliştirmek için motive vardır. Rekombinant protein mühendisliği protein sıra ayrıntılı denetim için izin vererek ve bu nedenle, dolayısıyla, sonuç potansiyel mekanik ve biyokimyasal özelliklerinin 3D hidrojel malzemesi tasarım ve geliştirme için benzersiz bir araç seti sunar matris. Burada, bağımsız olarak ayarlanabilir mekanik özellikleri ve hücre yapışkanlı ligand konsantrasyonu ile form hydrogels için kullanılan recombinantly türetilmiş elastin benzeri protein (ELP), bir ifade için bir iletişim kuralı mevcut. Daha fazla hücre kapsülleme ELP hydrogels içinde için bir metodoloji sunmak ve sonraki immünfloresan boyama, hücreleri aşağı akım Analizi ve miktar için gömülü.

Bu protokol için kullanılan ELPs beş bölgelerinde oluşmaktadır: T7 etiketi, His6 etiketi, enterokinase (EK) bölünme sitesi, biyo-aktif bölge ve elastin benzeri bölge (Şekil 1). T7 ve His6 Etiketler standart Western blot teknikleri ile kolay tanımlanması için izin verir. EK bölünme sitenin giriş gerekirse etiket bölge enzimatik kaldırılması için izin verir. Biyo-aktif bölge genişletilmiş, fibronektin türetilmiş hücre-yapıştırıcı ('RGDS') veya non-yapıştırıcı ('RDGS') dizileri için kodlar. Son olarak, elastin benzeri bölge merkezi tekrarı kanat tekrarlar bir LCST ~ 32 ° C31ulaşmak için isoleucine içerirken crosslinking üzerinden THPC sağlayan Konuk kalıntı sitesinde lizin grubunu içerir.
Yazı ifade, SDS-sayfa veya Western blot molekül ağırlığı görselleştirmek ve T7 (MASMTGGQQMG) veya His6 (HHHHHH) (Şekil 2) gibi antikor Etiketler içeren ELPs kimliğini onaylamak için kullanılabilir. Başarılı ifade kontrollü şartlar altında yaklaşık molekül ağırlığı (~ 37 kDa) adlı tek bir karanlık bant varlığı gösterdiği son derece homojen bir ürün her iki SDS-sayfa (Şekil 2A) kullanarak bu proteinlerin verir ve Western blot) Şekil 2B).
Kontrolsüz şartlarda bir Western blot üzerinde düşük moleküler ağırlıklı bandından varlığı bazı proteinler kısmını değil tamamen çevrildi ve/veya ifade (Şekil 2C) sonra bozulmuş olduğunu göstermektedir. Özellikle, burada kitleler tarafından yaklaşık ağırlığı bir biyo-aktif bölge ve üç elastin gibi bölgeler (bir ' tekrar'), veya yaklaşık dördüncü hedef protein karşılık gelen ~ 9 kDa eşit aralıklandırılmış. Bu küçük protein parçaları ifade daha yüksek bir sıcaklıkta işlenirken genellikle mevcut (> 32 ° C) Şekil 2Colduğu gibi. Bu daha düşük moleküler ağırlıklı proteinler varlığı öngörülemeyen mekanik özellikleri için yol açabilir. Böylece, düzenli posta ifade eleme yüksek kaliteli nihai ürün sağlamak için önerilir.
ELP tabanlı hydrogels mekanik sertlik ELP konsantrasyon veya THPC reaktif Grup: ELP Birincil aminler oranını işleyerek değiştirilebilir. Aynı anda, hücre yapışkanlı ligandlar konsantrasyonu ELP değişik hücre-yapıştırıcı (RGDS) ile oranını değiştirerek yapışkan olmayan (RDGS) sıralarını herhangi bir sertlik rejimi içinde ayarlanabilir. Bu iki değişken manipüle ederek, mekanik özellikleri ve ligand konsantrasyonu (Şekil 3) bir spektrum var jelleri üretebilir.
3D ELP hydrogels hücrelerde kapsüllemek için hücreler için istediğiniz sayıyı ortamda askıya ve hücre Pelet (Şekil 4A) üretmek için centrifuged. Orta tüm tüpünden Aspire ve istenen konsantrasyon ELP çözüm aynı şekilde yeniden askıya alınmış hücrelerdir. Daha sonra THPC çözüm için hücre/ELP süspansiyon eklenir ve homojen bir karışım oluşturmak için iyice pipetted. Bu çözüm hızlı bir şekilde steril Silikon kalıplar içinde bir pipet kullanarak bir 24-şey plaka aktarılır ve crosslink oda sıcaklığında ve 37 ° C 15 dakika her (Şekil 4B) izin. Son olarak, orta iyi plakasına eklenir ve deneyinde 37 ° C'de inkübe.
Boyama canlı/ölü hücre canlılığı ve başarılı hücre kapsülleme ELP hydrogels içinde değerlendirmek için kullanılabilir. Şekil 5' te gösterildiği gibi yetişkin fare nöral progenitör hücre (NPCs) yüksek hücre canlılığı üzerinde 7 gün içinde % 3 (w/v) ELP hidrojel göster.
3D ELP hydrogels daha önce gösterilmiştir NPC kök bakım kurallı NPC protein işaretleri SRY (bölge Y belirleme seks) ifade aracılığıyla ölçülen desteklemek için-kutu 2 (Sox2) ve testin9. NPCs %3 (w/v) ELP hydrogels düşük THPC crosslinking Haritayı yüksek ifade lokalize nükleer Sox2 ve sitoplazmik testin filamentler yolu ile immunostaining ve confocal görüntüleme (Şekil 6) ile kapsüllenir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig1.jpg"> Resim 1 : ELP ve karşılık gelen amino asit dizileri şematik gösterimi. Bu çalışmada kullanılan ELP antikor tabanlı görüntüleme, biyoaktif bir bölge için giriş hücre yapışkanlı etki alanlarının ve elastik mekanik özellikleri confers ve kimyasal çapraz için izin veren bir elastin benzeri bölge T7 ve His6 etiket içerir. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig2.jpg"> Resim 2 : Hedef protein ifadesi SDS-sayfa ve Western blot ile molekül ağırlığı ve nihai lyophilized ürün kimliğini onaylamak için doğrulanmış. Saf tam uzunlukta ELP çalışır 6 (HHHHHH) etiket SDS-sayfa (A) ve Western blot T7 (MASMTGGQQMG) veya histidin kullanarak tarafından belirlendiği şekilde 37 kDa bir molekül ağırlığı (B). (C). ELP saf olmayan toplu işlemleri ELP ifade protokolündeki sapmalar nedeniyle ELPs ifadesiyle daha düşük moleküler ağırlık yol açabilir. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig3.jpg"> Şekil 3: RGDS ligand içeriği bağımsız olarak ELP hydrogels içinde mekanik özelliklerindeki ayarlanmış. %5 (w/v) ve % 3 (w/v) ELP hydrogels var kesme dönmeler ~ 800 Pa ve ~ 400 Pa, anılan sıraya göre. Hydrogels THPC reaktif Grup: ELP Birincil aminler 1:1 oranında çapraz 15dk 37 ° C'ye ısıtılmış için oda sıcaklığında vardı ve 5 dk önce ölçüm için equilibrate için izin. Ortalama ± s.d., *p bilgilerse < 0,001. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig4.jpg"> Şekil 4: Şematik ELP hydrogels hücre kapsüllemenin. (A). hücreleri tek hücre süspansiyon orta ve pelleted santrifüj kullanarak içine başlangıçta ayrışmış. Orta tüm tüpünden Aspire ve hücreleri istenilen konsantrasyon, ELP çözümde yeniden askıya ve de karışık. Son olarak, THPC crosslinking çözüm eklenir ve de karışık. (B). THPC eklenmesi hemen ardından, çözüm bir pipet ile bir silikon kalıp içine atıldı. Çözüm için oda sıcaklığında crosslink 15dk 37 ° C'de ikinci bir 15 dk kuluçka takip için izin verilir Orta daha sonra kültür için de deneme süresi için eklenir. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig5.jpg"> Şekil 5: Nöral progenitör hücre korumak yüksek canlılık ELP hydrogels. Temsili resim nöral progenitör hücre kültüründe 7 gün sonra hydrogels 1:1 crosslinking (THPC reaktif Grup: ELP Birincil aminler) ile %3 (w/v) ELP kapsüllü. Yeşil: Canlı Boyama (calcein-AM); Kırmızı: ölü (etidyum homodimer) boyama. Ölçek çubuğu 100 µm =.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig6.jpg"> Şekil 6 : 3D ELP hydrogels nöral progenitör hücre kök maker ifade destek. Ayirt görüntü Sox2 ifade ve kültür ELP hydrogels 7 gün sonra proteinler testin nöral progenitör hücre. Görüntüleri %3 (w/v) ELP jelleri 0.5:1 crosslinking (THPC reaktif Grup: ELP Birincil aminler) ile kapsüllü hücreleri gösterir. Mavi: DAPI (çekirdek); Kırmızı: Sox2; Yeşil: testin. Ölçek çubuğu 25 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D at JoVE.com

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Polimer omurga ve bu nedenle, hücre microenvironment tam ayar için izin olarak Rekombinant protein mühendislik hydrogels 3D hücre kültürü için avantajlı olan. Burada, rekombinant elastin benzeri protein arıtma süreci ve kendi uygulamasında 3D hidrojel hücre kapsülleme açıklanmaktadır.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

production-elastin-like-protein-hydrogels-for-encapsulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.2K Görüntüleme.  Stanford University. Polimer omurga ve bu nedenle, hücre microenvironment tam ayar için izin olarak Rekombinant protein mühendislik hydrogels 3D hücre kültürü için avantajlı olan. Burada, rekombinant elastin benzeri protein arıtma süreci ve kendi uygulamasında 3D hidrojel hücre kapsülleme açıklanmaktadır.

Video: Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Tek Hücreleri ve 3D Sınırlaması Tek Embriyolar Sipariş: Yüksek İçerik Tarama için Yeni Bir Cihaz

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Biyomühendislik

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Geliştirilmiş 3D hidrojel Neuroinflammation Vitro modelleme için birincil gliyal hücreler kültürleri

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Canlı Mikroskopi Görüntüleme Altında 3D Hidrojellerin Kontrollü Suşu

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

Mikrobiyal Kimyasal ve Protein Üretimi için Işık Kontrollü Fermantasyonlar

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

3D Biyobaskı için Adipoz Türevi Kök Hücre Sferoidlerinin Büyük Ölçekli, Otomatik Üretimi

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have many advantageous properties, including injectability, microscale porosity, and tunability by mixing multiple microgel populations. Methods to fabricate microgels often rely on water-in-oil emulsions (e.g., microfluidics, batch emulsions, electrospraying) or photolithography, which may present high demands in terms of resources and costs, and may not be compatible with many hydrogels. This work details simple yet highly effective methods to fabricate microgels using extrusion fragmentation and to process them into granular hydrogels useful for biomedical applications (e.g., 3D printing inks). First, bulk hydrogels (using photocrosslinkable hyaluronic acid (HA) as an example) are extruded through a series of needles with sequentially smaller diameters to form fragmented microgels. This microgel fabrication technique is rapid, low-cost, and highly scalable. Methods to jam microgels into granular hydrogels by centrifugation and vacuum-driven filtration are described, with optional post-crosslinking for hydrogel stabilization. Lastly, granular hydrogels fabricated from fragmented microgels are demonstrated as extrusion printing inks. While the examples described herein use photocrosslinkable HA for 3D printing, the methods are easily adaptable for a wide variety of hydrogel types and biomedical applications.

This work describes straightforward, adaptable, and low-cost methods to fabricate microgels with extrusion fragmentation, process the microgels into injectable granular hydrogels, and apply the granular hydrogels as extrusion printing inks for biomedical applications.

Biyomedikal Uygulamalar için Dökme Hidrojellerin Parçalanması ve Granüler Hidrojellere İşlenmesi

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have ...

Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark of cardiac and musculoskeletal tissues. To study cell response to aligned microenvironments in vitro, several protocols have been developed to generate COL1 matrices with defined fiber alignment, including magnetic, mechanical, cell-based, and microfluidic methods. Of these, microfluidic approaches offer advanced capabilities such as accurate control over fluid flows and the cellular microenvironment. However, the microfluidic approaches to generate aligned COL1 matrices for advanced in vitro culture platforms have been limited to thin "mats" (&lt;40 &#181;m in thickness) of COL1 fibers that extend over distances less than 500 &#181;m and are not conducive to 3D cell culture applications. Here, we present a protocol to fabricate 3D COL1 matrices (130-250 &#181;m in thickness) with millimeter-scale regions of defined fiber alignment in a microfluidic device. This platform provides advanced cell culture capabilities to model structured tissue microenvironments by providing direct access to the micro-engineered matrix for cell culture.

This protocol demonstrates the use of a microfluidic channel with changing geometry along the fluid flow direction to generate extensional strain (stretching) to align fibers in a 3D collagen hydrogel (&lt;250 &#181;m in thickness). The resulting alignment extends across several millimeters and is influenced by the extensional strain rate.

Uzun Menzilli Fiber Hizalamalı Mikromühendislik 3D Kollajen Hidrojelleri

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...