Wir möchten, dass Smithfield Farmen zu danken für die intakte Schweinelungengewebe zu spenden. Wir möchten auch Dr. Hu Yang, Dr. Christina Tang und die VCU Abteilung für Plastische Chirurgie für die Erlaubnis, zu nutzen, um ihre Ausrüstung zu danken. Hydrogele und Gewebeproben wurden für SEM bei der VCU Abteilung für Anatomie vorbereitet und Neurobiologie Mikroskopie Einrichtung unterstützt, teilweise durch die Finanzierung von NIH-NINDS-Center Core-Grants 5 P30 NS047463 und zum Teil durch Finanzierungsform NIH-NCI Cancer Center Support Grants P30 CA016059. REM-Aufnahmen von Proben, die bei der VCU Nanotechnologie Kern Charakterisierung Facility (NCC). Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation, CMMI 1351162 finanziert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Lösung </td><td> Sterile Filter </td><td> Richtungen </td></tr><tr><td> DiH 2 O </td><td> ja </td><td> DiH 2 O; steril filtriert </td></tr><tr><td> 0,1% Triton X-100-Lösung </td><td> ja </td><td> Unter Abzugshaube mit 100 &amp; mgr; l Triton-X 100 - Lösung auf 100 ml DiH 2 O und rühren , bis sie gelöst; Sterilfilter. </td></tr><tr><td> 2% Desoxycholat-Lösung </td><td> ja </td><td> Unter Laborabzug 2 g Natriumdesoxycholat-Lösung pro 100 ml DiH 2 O und rühren , bis sie gelöst; Sterilfilter </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> ja </td><td> Hinzufügen , 58,44 g NaCl zu 1 L DiH 2 O; agitieren, bis sie gelöst; Sterilfilter </td></tr><tr><td> DNase-Lösung </td><td> ja </td><td> In 12.000Einheiten DNase auf 1 L DiH 2 O; In 0.156 g MgSO 4 (Wasserfrei) und 0,222 g CaCl 2; agitieren, bis sie gelöst; Sterilfilter </td></tr><tr><td> PBS </td><td> ja </td><td> Kombinieren 27,2 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (dibasisches Heptahydrat), 80 g NaCl, 2 g KCl und mit 10 L DiH 2 O; agitieren, bis sie gelöst; pH-Wert auf 7,4; Sterilfilter </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Lösungen für Tissue Dezellularisierung Erforderlich. Nehmen Sie die oben genannten Lösungen für die Dezellularisierung Prozess. Lagerung bei 4 ° C. Etwa 2,5 L für eine Schweine Lunge benötigt werden. 1. Hydrogelierung <ol><li> Porcine Lung Dezellularisierung (angepasst von Referenzen 9,10) <ol><li> Erhalten, ein en bloc normalen Schweine Lunge, aus einem Schlachthof, mit Herz und vasculature intakt. </li><li> Verwenden Gewebe Schere oder einem Skalpell, das Herz zu sezieren entfernt Vaskulatur so nahe wie möglich an das Herz schneiden, werden verbleibende Vaskulatur in späteren Schritten für die Perfusion verwendet werden. </li><li> sezieren vorsichtig das Bindegewebe rund um die Luftröhre, Bronchien und Gefäßen mit einem Skalpell oder einer Schere entfernt. HINWEIS: Ermitteln Sie die beste Lunge für den Rest des Verfahrens zu verwenden, indem eine Lunge ohne große Schnitte oder Einstiche durch die Pleura und große Mengen an Atelektase oder Gefäßverschluss wählen, die die Wirksamkeit des Dezellularisierung Prozess behindern können. </li><li> Schneiden Sie das suboptimal Lunge verlässt, so viel Bronchus zur Trachea wie möglich angebracht entfernt (Herz, Bindegewebe und den Lappen der Lunge entfernt entsorgt werden kann). Es sollte eine Lunge zur Trachea und Vaskulatur befestigt bleibt sein. HINWEIS: Bewahren Sie Abschnitte für die Histologie, falls gewünscht. 9 </li><li> Schließen Sie nicht angeschlossen Bronchien mit Klammern oder Naht prevent Überschuss Rückstau. </li></ol><ol start="6"><li> Bereiten Sie die Dezellularisierung Lösungen und im Kühlschrank lagern bei 4 ° C , bis sie benötigt (Tabelle 1). </li><li> Mit Hilfe einer Handpumpe eine Kanüle eingeführt, die Lungenarterie zu passen, perfuse sowohl das Lungengewebe 3-mal mit DI-Wasser durch Lungenarterie und der Trachea. Perfuse Gefäß erste jedes Mal. Beginnen Sie mit ca. 1 L in Gefäßen und 1,5 l in der Trachea für jede Perfusion, aber als Zelltrümmer mehr Flüssigkeit entfernt wird, kann durch das System durchblutet werden. </li><li> Perfundieren sowohl Vaskulatur und der Trachea mit Triton X-100-Lösung. </li><li> Unterzutauchen Lungengewebe in Triton X-100-Lösung für 24 h bei 4 ° C. </li><li> Perfuse Gefäßsystem und der Trachea 3 mal mit VE-Wasser zu spülen. </li><li> Perfuse beide Gefäße und der Trachea mit Desoxycholat-Lösung. </li><li> Tauchen Sie die Gewebeschnitte in Desoxycholat für 24 h bei 4 ° C. </li><li> Perfuse Gefäßsystem und der Trachea 3 mal mit VE-Wasser zu spülen. </li><li>Perfuse beide Gefäße und der Trachea mit NaCl-Lösung. </li><li> Unterzutauchen Gewebe in filtriert NaCl-Lösung für 1 h bei 4 ° C. </li><li> Perfuse Gefäßsystem und der Trachea 3 mal mit VE-Wasser zu spülen. </li><li> Perfuse beide Gefäße und der Trachea mit DNase-Lösung. </li><li> Unterzutauchen Gewebe in filtriert DNase-Lösung für 1 Stunde bei 4 ° C. </li><li> Perfuse beide Gefäße und der Trachea 5-mal mit PBS. </li><li> Sezieren weg bemerkbar Knorpelgewebe, Luftröhre und alle Tubuli 2 mm oder größer im Durchmesser (in erster Linie um den Hilus und medialen Abschnitte der Lunge) aus Atemwege leitet, so dass nur Atmungszonen (in erster Linie die Randbereiche). </li><li> Präparieren Gewebe in 1-Zoll-Abschnitte oder kleiner. Ausrichtung des Gewebes keine Rolle spielt für diesen Schritt. </li><li> überschüssige Flüssigkeit und Stelle Gewebe in 50 ml konischen Röhrchen abgießen. Frieren Sie das Gewebe bei -80 ° C. HINWEIS: Bewahren Abschnitte für die Histologie Entfernung von Zellen und Zell debri zu gewährleistens, wenn gewünscht. Wir verwenden H &amp; E, α-Galactosidase, PicoGreen, Hydroxyprolin, Ninhydrin, Alcianblau, SDS-PAGE und Massenspektrometrie charakterisiert werden. 9 </li></ol></li><li> Lung Verarbeitung <ol><li> Entfernen Sie Deckel aus gefrorenen Röhrchen dezellularisierter Lungengewebe enthält. </li><li> Legen Sie Filterpapier über die Rohröffnung einsetzen und mit Gummiband. HINWEIS: Rohr und der Inhalt sollte noch sonst in -80 ° C platzieren eingefroren werden, bis gefroren. </li><li> Lyophilisieren das Gewebe, bis das gesamte überschüssige Flüssigkeit weg ist, einen Gefriertrockner mit nach Hersteller Richtungen. Bei -80 ° C bis zum fertig zu fräsen. </li><li> Vor flüssigem Stickstoff zu Gefrierschrank Mühle beginnt hinzufügen Isolierung zu kühlen und interne Komponenten auf die Arbeitsbedingungen. </li><li> Entfernen Sie magnetische Mühle bar aus Mühle Rohr und fügen Gewebe Boden zu bedecken. </li><li> Ersetzen Mühle bar und fügen Sie locker gepackten Gewebe. Die Mühle Bar sollte noch frei bewegen. </li><li> Schließen Sie die Mühle Rohr und place in Gefrierschrank Mühle. </li><li> Füllen von flüssigem Stickstoff bis max Fülllinie. </li><li> Gefrierschrank Mühle alle Gewebe in ein feines Pulver (ca. 5 min, Impaktion Rate von ~ 600 min -1), in einem Polycarbonat - Zylinder mit einem Edelstahl - Impaktor sowie Edelstahl Endstopfen mit der Gefriermühle nach den Herstelleranweisungen. Bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Mikroporöse Gelbildung (8 mg / ml) ( in Anlehnung an Referenzen 9,11) <ol><li> 1% (w / v) des dezellularisierten Pulver und 0,1% (w / v) des Pepsins auf 0,01 M HCl, unter konstantem Rühren (sollte in der Lage sein Strömung auf der obersten Ebene der Flüssigkeit zu sehen), bei Raumtemperatur, 48 Std. HINWEIS: Das Pulver statisch aufgeladen ist, so das HCl-Zugabe, nachdem das Pulver die Möglichkeit bietet den Überschuss aus den Rohrwänden zu waschen. </li><li> Nach der Verdauung 48 h, legen Sie die Lösung und Reagenzien auf Eis für 5 min. </li><li> Verwendung gekühlter 10% (v / v) 0,1 M NaOH, eind 11.11% (v / v) 10 x PBS (die gesamte Lösung zu bringen Konzentration 1x), bringen die verdauten Proteinlösung auf physiologischen pH von 7,4. HINWEIS: Die Lösung kann jetzt bis zu einer Woche bei 4 ° C gelagert werden. Führen Sie Gelieren Kinetik mit rheometry 9 , falls gewünscht. </li></ol></li></ol> 2. Vernetzungs Hydrogele mechanische Festigkeit zu verbessern <ol><li> Lösungen von 1%, 0,1% und 0,01% w / v Genipin Vernetzungslösung wurden durch Lösen der erforderlichen Menge Genipin Pulver in 10% DMSO hergestellt. </li><li> Vortex, um die Lösung alle 15 min für 1 Stunde. </li><li> In Genipin Lösung ECM Hydrogele zu decken (100 &amp; mgr; l für jede Vertiefung einer 96-Well-Platte), die zuvor in Teil 1.3.4 zusammengestellt. </li><li> Verlassen jedes ECM Hydrogel für 24 h bei 37 ° C zu vernetzen. </li><li> Spülen Sie das ECM-Hydrogel 3-mal mit PBS, bis die Waschlösung nicht mehr blau. Die vernetzten Hydrogele werden dann bereit sein, für die weitere Charakterisierung und cell Kulturstudien. </li></ol> 3. Zellkultur mit mikroporöser Gel <ol><li> Zweidimensionale Beschichtungs <ol><li> Verwendung der Lösung aus 1.3.3 werden 20 ul Pregel-Lösung in jede Vertiefung einer 96-well nicht behandelten Gewebekulturplatte. </li><li> Kühlen Sie über Nacht bei 4 ° C Proteinadsorption an der Platte zu ermöglichen. </li><li> Absaugen Vorgelats Lösung und Spülen mit PBS. </li><li> Passage Zellen 9. </li><li> In 10.000 Zellen / cm 2 in die Vertiefungen. </li><li> Erhöhen Medien zu 100 ul pro Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Dreidimensionale Zellkultur 9 <ol><li> Verwendung Lösung aus 1.3.3 resuspendieren pelletierten Zellen auf eine Konzentration von 1 Million Zellen / ml Vorgellösung. </li><li> Schnell 16 ul Pregel-Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte verzichtet werden kann, ein ~ 500 &amp; mgr; m dicke Hydrogel für 3D-Zellkultur zu bilden. </li><li> bei 37 ° C inkubieren 30min für Gel zu bilden. </li><li> 100 l Medien an die Spitze der gebildeten Hydrogele und bei 37 ° C inkubiert. </li></ol></li><li> Dreidimensionale Zellkultur auf variabler Steifigkeit Gele <ol><li> Mit Lösung von 1.3.3, Pipette 100 ul Pregel-Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. </li><li> bei 37 ° C 30 Minuten inkubieren für Gel zu bilden. Hinweis: Die Vernetzung Schritte von Teil 2 kann hier verwendet werden. </li><li> Passage Zellen 9. </li><li> In 10.000 Zellen / cm 2 in die Vertiefungen. </li><li> Erhöhen Medien zu 100 ul pro Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C. </li></ol></li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Einer der integralen Aspekte der Biologie ist die Selbstorganisation der Moleküle in hierarchischer Strukturen, die eine bestimmte Aufgabe auszuführen. 13 Im Labor Selbstorganisation hängt von zahlreichen Faktoren wie Salzkonzentration, pH, und die Verdauung Dauer. Wie gezeigt ist, selbstorganisierend Hydrogel bildet sich, wenn solubilisiert Proteine ​​Rückkehr zu einer physiologischen Temperatur. Das Hydrogel gebildet ist in der Lage zur Förderung der Zellanhaftung und Proliferation in vitro. Zelluläre Antwort auf biophysikalische Signale von ECM kann nicht unter Verwendung von Polymeren untersucht werden. Gewebe-spezifische zelluläre Reaktion auf biophysikalischen Signale nicht durch die Verwendung anderer Gewebe untersucht werden. Regeneration Forscher und Kliniker glauben, mit dezellularisierter Gerüste Geweberegeneration und Wundheilung verbessert. Chronische Lungenkrankheit Erkrankten benötigen therapeutische Verbesserungen Organverfügbarkeit zu erhöhen und Immunogenität zu verringern. Organspezifische, zell ECM-Wechselwirkungen müssenzu weiteren Organbiologie erforscht. Mit ECM als Zellgerüst für Lungenzellen hat konsistente Ergebnisse gezeigt. 14,15 Verwendung von Lungenschnitten von erkrankten Modellen fördert Krankheit Erneuerung 16 Stamm- oder Vorläuferzellen, in distale Lunge, 17,18 und erfordert spezielle Nischen Bildung von teratomas zu verhindern. Verwendung von gewebespezifischen ECM als Abgabevehikel kann regenerative Wirkungen von Vorläuferzellen verbessert werden. Das ECM-Hydrogel wird ein anwendbarer Umwelt zellulären Reaktionen auf extrazellulären Matrix zu bewerten. Eine große Anzahl von Studien existiert Blick auf Steifigkeit, wie es zu zellulären Signal bezieht. Unsere Methode der Genipin Vernetzung ermöglichen zell Steifigkeit sowie Zell-ECM-Komponente Wechselwirkungen signalisiert. Während kann Hydrogels Steifigkeit durch ECM Menge und das Verhältnis von Proteinen manipuliert werden, ermöglicht die Verwendung von Genipin Änderungen Hydrogels Steifigkeit etwas unabhängig von ECM-Gehalt. Einstellen genePIN Konzentration kann für eine genaue Abstimmung der mechanischen Eigenschaften ermöglichen, am ehesten natürliche Lungengewebe 6 ähneln. Von Genipin Daten unter Verwendung von Hydrogelen, die aus peripheren Lunge in der vorliegenden Studie erhalten, einen 15-fachen Anstieg (von 5 Pa bis 75 Pa) wurde festgestellt. Basierend auf rheologischen Daten von biopsierten normalen Rattenlungengewebe, das dezellularisiert wurde mit den gleichen Methoden, können wir approximate periphere Lungengewebe Steifigkeit erreichen, indem (Daten nicht gezeigt) Zugabe von 1% Genipin peripherer Lungen Hydrogele oder Zugabe von 0,01% auf ganze Lunge Hydrogele (geschätzt ). Die peripheren Lungen ECM Verwendung von Lungenparenchym bestehend aus einem wesentlich weicher Gel im Vergleich zu unseren bisher ganze Lunge ECM Hydrogel Ergebnisse veröffentlicht 7. Daher neben Genipin, bestimmte Bereiche des Lungengewebes Auswahl dramatisch Dezellularisieren die Steifigkeit beeinflussen können. Es gibt Möglichkeiten, dieses Verfahren zu verbessern, die häufig in perfusi verwendet, um zusätzliche Schritte umfassen könnenauf Dezellularisierung ganzer Lungengewebe. Diese Methode wurde auf normalem Lungengewebe verwendet und können Modifikation für Dezellularisierung von erkrankten Lungen erfordern. Wir haben noch nicht, diesen Prozess in bestimmten Krankheitszuständen untersucht. Wir beziehen unsere Lungen auf Eis verschifft über Nacht aus einem Schlachthof. Dieses Verfahren könnte die Wirksamkeit unseres Verfahrens aufgrund Atelektase oder vaskulären Okklusion begrenzen; aber wir haben nur selten Bereiche der Lunge zu entfernen, die nicht gründlich dezellularisiert worden. Wenn frisches Lungengewebe zu erhalten, würden wir, bevor sie in die Lunge erforderlich machen alle Lösungen empfehlen alle Pausen bei der Gewebeverarbeitung zu verhindern. Frühere Untersuchungen haben festgestellt , dass Peressigsäure als abschließende Sterilisationsschritt mit der Produktion zur Matrix eine regenerative M1 - Makrophagen - Phänotyp in infiltrieren Immunzellen verursacht, 19 potenziell proregenerative Effekte von dezellularisierter Gewebe zu verbessern. Andere Forschung hat in der Verwendung anderer Reiniger gegangen, um den Vorgang abzuschließen, aber die appear zu sein Labor spezifischen Präferenzen letztlich die gleichen Auswirkungen auf Dezellularisierung. Die Dezellularisierung Verfahren und die Verdauung Schritte können je nach der spezifischen Anwendung des Forschers optimiert werden. Zum Beispiel kann das Gel Aufschlusszeit oder Neutralisierungsverfahren Änderung der Zusammensetzung Protein verändern, mechanische Eigenschaften oder Gelieren Kinetik. Alternativen zu dem Verfahren hier diskutiert wurden, können in Höhe der Komplexität variieren je nach gewünschten experimentellen Ergebnissen. Zum Beispiel, wenn das Ziel, die Basalmembran intakt, so viel wie möglich, eine Perfusions-Pumpe mit einem Druck begrenzte Kontrolle zu halten war möglicherweise ein Barriereschaden verringern. Außerdem, wenn man einen Laboraufbau zur Verfügung hatte, um beide Lungen für größere Arten intakt zu halten, kann der Dezellularisierung Prozess um die Wirksamkeit zu verbessern. Umgekehrt wird ein Handschleiftechnik mit einem Mörser und Stößel kann für Labors mit dem gefriergetrockneten Gewebe angewendet werden, die keine Cryomühle haben. Wir würden Hand grindin erwarteng größere Fragmente zu erzeugen, um die Oberfläche für den Säureaufschluss zur Verfügung zu begrenzen, so dass die Aufschlusszeiten müssen in diesem Fall geändert werden. Alternativen sind nicht auf die Dezellularisierung Schritte und Ausbildung von Hydrogelen beschränkt. Glutaraldehyd wurde als Vernetzer für Hydrogele verwendet worden, um eine mögliche Alternative bieten Erhöhung der mechanischen Festigkeit der biologischen Hydrogele für Modellsysteme verwendet. Andere Modellsysteme umfassen intakte dezellularisierter Lungen als in vitro 3D - Kultursystem oder häufiger an Lungenschnitte als Modell aussehende 3D - In - vitro - Gerüst. 20 Wir haben bereits erwähnt , die Einschränkungen , die von der Arbeit mit Polymergerüsten sowie einzelne Komponente Gerüste kommen, aber die bleiben als mögliche Alternativen zu dem Verfahren vorgestellt. Darüber hinaus gibt es alternative Methoden zur Bestimmung Dezellularisierung Wirksamkeit (wie DNA-Isolierung), Gelieren (kann Trübung Assays verwendet werden), und die Zellbindung einnd Proliferation (wie die Verwendung von CCK8). Wir fanden, dass die Methoden, die hier sind beschrieben als ausreichend Hydrogele für als 3D-Modell Gerüste Verwendung zu charakterisieren. Die Lungen ECM Hydrogele wir hier beschreiben, bieten eine effektive Plattform Zell-ECM-Wechselwirkungen zu studieren. Pregel Lösung hat als Beschichtung für Polymerarzneimittelträger Potential, in die Lieferung von mesenchymalen Stammzellen Beihilfe oder als Drug-Delivery-Plattform von selbst aus. Das Protokoll vorgestellt bietet hier die grundlegenden Schritte für ein vielseitiges Hydrogel aus der Lunge ECM abgeleitete Werke zu erstellen.

Translating in vitro results to the clinic is one of the most challenging issues facing biomedical researchers. In vitro research on tissue culture plastic is easier, more convenient, and maintains high cell viability.1 This approach is a reasonable starting point, but the results have limited clinical translation. Increasingly, laboratories are incorporating three-dimensional constructs to replace the traditional two-dimensional methods. Reviews are available for many three-dimensional environments, from biological scaffolds to polymeric scaffolds.2,3
Biological frameworks can mimic characteristics of in vivo environments as they contain many of the protein and glycosaminoglycan components of the native matrix and provide familiar binding sites for cells to attach to and recognize. Extracellular matrix (ECM) derived materials have been shown to be capable scaffolds for cell attachment and proliferation.4 One challenge that limits the application of ECM hydrogel platforms stems from their inherently weak mechanical properties following gelation. Native tissue often has mechanical properties that are magnitudes higher than hydrogels. Non-toxic crosslinking agents can increase the mechanical properties of hydrogels to better mimic the native tissue environment. Genipin is a non-toxic, natural crosslinker derived from Gardenia plants with the ability to closely tailor mechanical properties of ECM with changes in genipin concentration5,6. 
Nearly all cells in the body exist in, and organize on, ECM that they either produce or maintain. New focus on the universal importance of ECM in the organization, condition, and function in every organ or system has sparked the production of matrix based platforms for in vitro investigation. Porcine small intestine submucosa is the most extensively studied naturally-derived scaffold, and it has been used to regenerate tendons, ligaments, skeletal muscle4, and even bone7. Matrices from other organs and donor species have also demonstrated good tissue regeneration potential. The use of foreign ECM components causes minimal issues with immunomodulation. After elimination of host cellular matter, the remaining ECM will be similar in amino acid content and organization to all other mammalian species8. There is a growing line of thinking that the best way to examine cell-ECM interactions in vitro is to utilize organ-specific ECM scaffolds. Each organ provides a unique composition of proteins and proteoglycans to create cellular niches. Niches provide structural, functional and even the enzymatic breakdown of the extracellular matrix contributing to biophysical signaling. To attain an in vitro microenvironment most similar to the in vivo microenvironment, use of tissue specific ECM would optimize the cellular niches for research. 
The goal of this protocol is to provide a method for establishing a hydrogel scaffold unique to the lung ECM. This method provides a platform for in vitro research on lung cell-ECM interactions.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP151-100</td>
			<td style="width:371px;">Use in fume hood with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Deoxycholate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6750-100g</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7506-500g</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1016-500g</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>Use in fume hood with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP359-500</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Genipin</td>
			<td style="width:135px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">078-03021</td>
			<td>Use in fume hood with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 10x</td>
			<td style="width:135px;">Quality Biological</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>45000-448</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td align="right">8519</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hand pump</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-239-1</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Graduate Beaker</td>
			<td style="width:135px;">VitLab</td>
			<td align="right" style="width:119px;">445941</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryomill</td>
			<td>SPEX</td>
			<td>6700</td>
			<td>Use cryogloves and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lyophilizer</td>
			<td>FTS FlexiDry</td>
			<td></td>
			<td>Use gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rheometer</td>
			<td>Discovery</td>
			<td>HR-2</td>
			<td>Use gloves and eye protection.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tunable hydrogels from pulmonary extracellular matrix for 3d cell culture

Hier stellen wir ein Verfahren zur Mehrkomponenten - Zellkultur - Hydrogele für in - vitro - Lungen - Zellkultur zu etablieren. Beginnend mit gesunden en bloc Lungengewebe von Schweinen, Ratte oder Maus wird das Gewebe durchblutet und unter Wasser in nachfolgenden chemischen Reinigungsmittel , die Zelltrümmer zu entfernen. Histologische Vergleich des Gewebes vor und nach der Verarbeitung bestätigt Entfernung von mehr als 95% der Doppelstrang-DNA und alpha-Galactosidase-Färbung schlägt die Mehrheit der Zelltrümmer entfernt wird. Nach Dezellularisierung wird das Gewebe lyophilisiert und dann in ein Pulver cryomilled. Das Matrixpulver wird 48 h in einer sauren Pepsinverdau Lösung verdaut und dann die Pregel-Lösung neutralisiert zu bilden. Gelieren der Pregel Lösung kann durch Inkubation bei 37 ° C induziert werden und kann unmittelbar nach der Neutralisation oder bei 4 ° C gelagert werden für bis zu zwei Wochen. Beschichtungen können unter Verwendung der Vorgellösung auf einer nicht behandelten Platte für c gebildet werdenell Befestigung. Zellen können in dem Vorgel vor Selbstmontage ausgesetzt werden, um eine 3D-Kultur zu erreichen, die auf der Oberfläche eines geformten Gels plattiert, aus dem die Zellen durch das Stützgerüst migrieren können oder auf den Beschichtungen überzogen. Änderungen der Strategie vorgestellt kann Gelierungstemperatur, Stärke oder Protein Fragmentgrößen auswirken. Jenseits Hydrogelbildung kann das Hydrogel Steifigkeit erhöht werden Genipin verwenden.

Unter Verwendung dieses Verfahrens haben wir Hydrogele aus normalen Schwein, Ratte produziert und Mauslungen (Abbildung 1). Verarbeitet Lungen liefern schätzungsweise 5 mg, 40 mg und 10 g ECM-Pulver sind. Ein Überblick über das Verfahren ist in Abbildung 2 dargestellt. Key-Visualisierungen während des Prozesses sind: weißes Aussehen der Lunge nach deoxycholate Spülen; nach der Bildung Pregel sollte die Lösung opak sein, und die Lösung sollte für Monate homogen erscheinen, wenn bei 4 ° C gelagert. Wir haben eine grundlegende Maßnahmen zur Fehlerbehebung Tabelle enthalten Fehlerquellen während des gesamten Prozesses (Tabelle 2) zu identifizieren. Nach dem Gelieren kann Hydrogele unmittelbar oder für eine spätere Verwendung gespeichert werden. Rheologische Tests bestätigt , dass mehr als 90% des Geliermittels in den ersten Minuten tritt nach Erreichen 37 ° C (Abbildung 3). Gebildet Hydrogele sind für lange Zeiträume stabil in PBS, aber die Zellhaftung und proliferation ändern kann (Abbildung 4). Während dieses Protokoll für Schweinelungen geschrieben ist, begrenzen Platzbeschränkungen uns nur eine Lunge zu verwenden, wenn Schweinelungen Dezellularisieren. Wir haben das gleiche Verfahren mit geringen Modifikationen verwendet, um beide Lungen für andere Arten Dezellularisieren. Für Ratten und Mäuse, können die Lungen und das Herz intakt angebracht gelassen werden, aber das Bindegewebe sollte noch mit einem Skalpell oder einer Schere entfernt werden. Wir halten das Herz intakt und angebracht für Ratten und Mäuse und perfuse die Lösungen durch den rechten Ventrikel statt der Lungenarterie. Perfusion der Trachea ist immer noch die gleiche; jedoch kann die Kanüle für kleinere Spezies in der Trachea für einen leichten Zugang vernäht werden. Wir haben mehrere Zelltypen, humanen mesenchymalen Stammzellen, 9 mesenchymale Stammzellen der Maus, humanen epithelialen Zelllinien (A549s), primäre menschliche mikrovaskuläre endo hinzugefügtthelial Zellen (HpuVECs) und menschlichen Nabelvene Epithelzellen (HUVECs) innerhalb und auf der Oberfläche der Lunge ECM Hydrogelen. Wir haben keine Probleme in Bezug auf die xenogenen Natur der gebildeten Gele angetroffen. Unsere vorherige Arbeit ist in den porcinen Hydrogele eine signifikante Reduktion der α-Galactosidase gezeigt. 9 Die Pre-Gel - Lösung kann auch als Beschichtung bei 4 ° C verwendet werden , die Zellanheftung zu verbessern. Pregel Lösung verbessert HpuVEC Anhaftung und Proliferation, wenn der Lungen ECM beschichteten Gewebekulturplatten gegeben. Beschichteten Vertiefungen demons Anheftung der Zellen deutlich verbessert im Vergleich zu nicht behandelten Wells (Abbildung 5). Hinzufügen Genipin erhöht Hydrogel Vernetzung. Diese erhöhte Vernetzung kann eine physiologisch relevante Steifigkeit bieten, während eine Verschlechterung der ECM abnimmt. Der Rückgang der Abbau, wenn auch kleinere in vitro auftreten können aufgrund einer erhöhten Bindung zwischenProteine ​​und damit mehr Widerstand gegen ECM Umbau von Zellen. Wir verwendeten Frequenzdurchläufe auf einem Rheometer der mechanischen Eigenschaften des vernetzten Hydrogels zu messen. Hydrogele Steifigkeit gefunden wurde direkt korreliert werden Konzentration mit dem Median zu Genipin und relevanteste - Konzentration von 0,01% (Abbildung 6, nativem Gewebe nicht gezeigt). Ein MTT-Assay wurde verwendet, die Zellproliferation und das Überleben auf dem vernetzten Hydrogel zu quantifizieren. Zellproliferation ist höher auf dem vernetzten Hydrogel (Abbildung 7). Dies unterstützt eine erhöhte Zellproliferation von anderen auf eine erhöhte Steifigkeit. 12 Wechselnde Genipin Vernetzungszeit oder Temperatur kann in verschiedenen Vernetzungsgraden führen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig1.jpg" /> Abbildung 1: Bilder von Lungs Wir Dezellularisierte Haben. Bilder aus (A) Mauslunge nach decellularisation und Herz entfernt, (B) Ratte nach Triton X-100 weggespült, (C) Schwein, vor dem ersten Spülgang; sie ergeben ~ 5 mg, 40 mg und 10 g der Lung ECM, respectively. (D) Maus Lunge und Herz intakt, nach Dezellularisierung, mit Kanüle noch an Ort und Stelle vernäht. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55094/55094fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55094/55094fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig2.jpg" /> Abbildung 2: Überblick über die Methoden. Dies ist ein Überblick über die Methode Hydrogele aus den Lungen zu erzeugen. Beginnend mit en bloc Schwein Lunge Dezellularisierung tritt nur undurchsichtige weiße oder durchscheinende Gewebe zu verlassen, die von ECM-Proteinen besteht. Dann, nachdem das restliche Wasser zu entfernen, und die Erhöhung der Oberflächenbereich Säureaufschluss zu optimieren, ist das Gewebe solubilisiert. Neutralisieren der acid und Erhöhung der Salz auf physiologische Werte schafft die Pregel Lösung bereit zum Gelieren. Sobald die Lösung ein Hydrogel bei 37 ° C bildet, erfolgt die Charakterisierung Stelle mit einem Gel-Rheometer und Rasterelektronenmikroskopie. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55094/55094fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55094/55094fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig3.jpg" /> Abbildung 3: Repräsentative rheologische Daten für Gelieren unter Temperatur Ramping. Nach einer ersten Amplitude Sweep linear viskoelastischen Bereich zu bestimmen, wurde eine Temperaturrampe verwendet Gelierung Kinetik zu bestimmen. Daten werden als Mittelwert +/- Standardabweichung dargestellt. n = 4. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig4.jpg" /> Abbildung 4: Langzeitstabilität. Ein imAlter eines Schweinelungen ECM Hydrogels in PBS aufbewahrt für über 6 Monate bei Raumtemperatur. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig5.jpg" /> Abbildung 5: Metabolic Assay von HpuVECs. MTT Proliferationsdaten aus primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HpuVECs) gewachsen auf nicht-behandelten Gewebekulturplatten. Pregel Lösung von 1.3.3 wurde auf Platten gegeben, über Nacht gekühlt und Pre-Gel-Lungen-ECM-beschichteten Platten zu bilden gespült. HpuVECs zeigten höhere MTT-Aktivität auf ECM-beschichteten Platten im Vergleich zu unbeschichteten. * P &lt;0,05 im Vergleich zur Kontrolle. Die Daten sind Mittelwert ± Standardabweichung n = 3 pro Gruppe. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig6.jpg" /> Abbildung 6: Rheologische Daten für verbesserte Vernetzung. Rheometrie Daten für Genipin Vernetzung. Die Steifigkeit erhöht sich mit erhöhten Konzentrationen von genibei 1% Genipin auf einem Plateau stecken. Die Daten werden normiert, um eine fache Steigerung um zu zeigen, mit Genipin bei der Vernetzung. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig7.jpg" /> 7; Zellproliferation auf Genipin Vernetzte Gele. Normierte MTT Daten für A549s auf Genipin vernetzten Hydrogelen. Erhöhte Zellproliferation mit erhöhter Steifigkeit gesehen. p &lt;0,05 im Vergleich zur Kontrolle. Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung. n = 3 pro Gruppe. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Problem </td><td> Problem </td><td> Lösung </td></tr><tr><td> Rot / rosa Farbe nach Dezellularisierung beibehalten </td><td> Unwirksame Dezellularisierung </td><td> Von vorn anfangen mit neuen Lungen </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Entfernen Bereichen unvollständig Dezellularisierung &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td></td><td> Gefäßverschluss </td><td> Von vorn anfangen mit neuen Lungen </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Entfernen Bereichen unvollständig Dezellularisierung </td></tr><tr><td> Signifikante Zelltrümmer beibehalten </td><td> Unwirksame Dezellularisierung </td><td> Von vorn anfangen mit neuen Lungen </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Entfernen Bereichen unvollständig Dezellularisierung </td></tr><tr><td></td><td> Gefäßverschluss </td><td> Von vorn anfangen mit neuen Lungen </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Entfernen Bereichen unvollständig Dezellularisierung </td></tr><tr><td></td><td> Atelektase </td><td> Von vorn anfangen mit neuen Lungen </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Entfernen Bereichen unvollständig Dezellularisierung </td></tr><tr><td> Zerstörung von Membranen in histologischen Proben gefunden </td><td> Überdruck von Schiffen während der Perfusion </td><td> Reduzieren Sie Perfusionsdruckvon Waschmitteln </td></tr><tr><td> Große Partikel bleibt nach dem Mahlen </td><td> Zu viel gefriergetrocknete Material in Rohr </td><td> Reduzieren Sie Material in Schleifzylinder </td></tr><tr><td></td><td> Nicht lange genug gemahlen </td><td> erhöhen Mahldauer </td></tr><tr><td> Pregel Lösung nicht geliert </td><td> Lösung pH-Wert zu hoch </td><td> Machen Sie pH-Wert 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Beginnen Vorgelats Lösung mit frischem Pulver </td></tr><tr><td></td><td> Lösung pH-Wert zu niedrig </td><td> Machen Sie pH-Wert 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Beginnen Vorgelats Lösung mit frischem Pulver </td></tr><tr><td></td><td> ECM über verdaute </td><td> Beginnen Vorgelats Lösung mit frischem Pulver </td></tr><tr><td> Die Zellen nicht überleben </td><td> Microbes nach HCl Verdauung eingeführt </td><td> Beginnen Sie wieder mit frischem Pulver und verwenden steril filtriert Lösungen </td></tr><tr><td></td><td> pH-off </td><td> Beginnen Vorgellösung wieder </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Machen Sie pH-Wert 7,4 </td></tr><tr><td></td><td> Die Zellen platzen </td><td> Fix Salzgehalt in Vorgellösung </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Fehlerbehebung zu identifizieren Quellen möglicher Fehler.

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Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Dies ist eine Methode, um eine 3-dimensionale Zellkultur Gerüst von pulmonaler extrazellulären Matrix zu schaffen. Intact Lunge in Hydrogelen verarbeitet, die das Wachstum von Zellen in drei Dimensionen zu unterstützen.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

tunable-hydrogels-from-pulmonary-extracellular-matrix-for-3d-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.5K Aufrufe.  Virginia Commonwealth University.  Dies ist eine Methode, um eine 3-dimensionale Zellkultur Gerüst von pulmonaler extrazellulären Matrix zu schaffen. Intact Lunge in Hydrogelen verarbeitet, die das Wachstum von Zellen in drei Dimensionen zu unterstützen. 

Serie: Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Forschung

Biotechnik

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

Die Herstellung von extrazellulären Matrix-derived Foams und Mikroträgern als gewebespezifische Zellkultur und Delivery-Plattformen

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

Ultradünne derzei-elastischen Hydrogele als eine biomimetische Basalmembran für Dual Zellkultur

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Herstellung einer Niere Cortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

Produktion von Fasern der extrazellulären Matrix über Opfer Hohlfaser-Membran Zellkultur

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Messung der globalen zellulären Matrix Metalloproteinase und metabolische Aktivität in 3D Hydrogele

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

Vorbereitung von tunable Extracellular Matrix Microenvironments zur Bewertung der Schwann Cell Phänotyp Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Kontrollierte Dehnung von 3D-Hydrogelen unter Live-Mikroskopie-Bildgebung

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...