Die Bedeutung des Protokolls beruht auf der Reduzierung menschlicher Fehler und mikrobiologischer Kontamination. Darüber hinaus verantwortlich für die Herstellung von Tausenden von Sphäroiden für 3D-Bioprinting-Ansätze. Der Hauptvorteil dieser Angelegenheit ist jedoch, dass die Arbeitszeiten optimiert sind.
Die Softwareparameter sind entscheidend, da sie die endgültige Qualität der Sphäroide beeinflussen können. Und der beste Rat wäre, Tests nur mit Zellkulturmedien durchzuführen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es sich um eine alte traditionelle 3D-Zellkulturmethode handelt, die auf Begin basiert, indem die Stammzellsuspension mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette geerntet und in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen übertragen wird.
Dann zentrifugieren Sie bei 400 RCF für 5 Minuten, um das ASC-Pellet zu erhalten. Resuspendiert das Zellpellet mit DMEM-Low mit 10%FBS. Nach der Zellzählung nehmen Sie ASCs in separaten 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, um die 81- und 256-Rezessionen zu säen, die mit nicht haftendem Hydrogel mikrogeformt wurden.
Einzelheiten zur Anzahl der verwendeten Zellen finden Sie im Textmanuskript. Fügen Sie 500 Mikroliter sterile 2% hochreine Agaroselösung in die Mitte einer Silikonform mit 81 oder 256 kreisförmigen Aussparungen hinzu. Nach 40 Minuten die hochreine Agarose aus der Silikonform entformen und in eine Vertiefung einer 12-Well-Kunststoffplatte legen.
Fügen Sie zwei Milliliter DMEM-Low in das Bohrloch mit der mikrogeformten Agarose hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 5% atmosphärischer Kohlendioxidzufuhr für mindestens 12 Stunden, bevor Sie die ASCs aussäen. Stellen Sie sicher, dass die laminare Strömung eingeschaltet ist und der Luftstrom des Schranks ordnungsgemäß funktioniert. Vergewissern Sie sich, dass das Gerät an die richtige Spannung angeschlossen ist und das Tablet an das Gerät angeschlossen ist.
Prüfen Sie, ob die Höhe des Schrankschutzglases auf dem Niveau der Sensorkennzeichnung des Gerätes liegt. Drücken Sie die Ein- oder Aus-Taste auf der linken Seite des Geräts. Warten Sie dann, bis das Tablet und das Gerät gestartet sind.
Positionieren Sie die Spitzenkästen, das Rack für Zentrifugenröhrchen und die Platte mit dem mikrogeformten Agarosehydrogel im Arbeitsbereich der Ausrüstung. Klicken Sie in der auf dem Tablet geöffneten Software auf LabWare Editor. Richten Sie einen virtuellen Arbeitstisch ein und wählen Sie die Positionen der Pipetten, Spitzenkästen, des Racks für die Kunststoffrohre und der Platten.
Klicken Sie auf die Schaltfläche "Schalter zum Verfahren", um alle Parameter und Befehle aufzunehmen, die von den Geräten während des gesamten Experiments ausgeführt werden. Warten Sie, bis eine Symbolleiste und eine Prozedurliste in der Software geöffnet sind. Um die Befehle anzugeben, integrieren Sie zunächst die Anzahl der zu pipettierenden Proben und ziehen Sie sie in die Prozedurliste.
Klicken Sie dann auf die Befehlsschaltfläche "Reagent Transfer" in der Software, um die ASC-Suspension auf die Vertiefungen der 12-Well-Platte mit den Mikroformen zu übertragen und in die Verfahrensliste zu ziehen. Klicken Sie auf Eigenschaften, um die Start- und Endpositionen für das Gerät einzurichten, um die Probe zu übertragen. Warten Sie, bis die Software zur Seite Arbeitstabelle zurückgekehrt ist.
Richten Sie die Parameter für die automatisierte Seeding der ASCs wie im Textmanuskript beschrieben ein. Wählen Sie Wasser als Standardflüssigkeitstyp aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Optionen", um die Parameter so einzustellen, dass eine homogene Aussetzung der ASCs wie im Textmanuskript beschrieben erstellt wird.
Klicken Sie auf die Schaltfläche mit einem Häkchensymbol in der oberen Leiste der Software, um sicherzustellen, dass kein Programmierfehler vorliegt. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Play" in der oberen Leiste der Software, um das Programm zu starten. Lassen Sie das Gerät wie programmiert starten.
Und warten Sie, bis es ein Geräusch macht, das anzeigt, dass es fertig ist. Sammeln Sie die 12-Well-Platte und inkubieren Sie sie dann bei 37 Grad Celsius mit einer atmosphärischen Kohlendioxidversorgung von 5% für mindestens 18 Stunden, um eine vollständige und kompakte Sphäroidebildung zu ermöglichen. Ernten Sie die Sphäroide manuell nach einem, drei und sieben Tagen Kultur zur Analyse.
Spülen Sie das Medium mit einer Mikropipette, um die Sphäroide aus dem mikrogeformten, nicht anhaftenden Agarosehydrogel freizusetzen. Sammeln Sie die Sphäroide manuell mit einer Mikropipette und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Insgesamt wurden 85 und 160 Sphäroide aus mikrogeformten nicht adhäsiven Hydrogelen mit 81 bzw. 256 kreisförmigen Rezessionen gemessen.
Das automatische Pipettensystem säte die ASC-Zellsuspension in 15 Minuten in 12 Vertiefungen einer einzigen 12-Well-Platte. Unter Verwendung des 81 mikrogeformten nicht anhaftenden Hydrogels wurden in dieser Studie 972 Sphäroide hergestellt. Während das 256 mikrogeformte, nicht adhärente Hydrogel, 3072 Sphäroide produzierte.
ASC-Sphäroide wurden auf die Homogenität ihrer Größe und Form analysiert. ASC-Steroide aus Mikroformen mit 81 Rezessionen zeigten während der Kulturperiode einen homogenen Durchmesser. Im Gegensatz zu ASC-Steroiden aus Mikroformen mit 256 Rezessionen lag das kleinste und größte Durchmesserverhältnis bei ASC-Sphäroiden aus Mikroformen mit 81 und 256 Rezessionen nahe bei eins.
Die Lebensfähigkeits-, Morphologie- und Kraftanalysen lieferten den Nachweis für die erfolgreiche, großtechnische Produktion von ASC-Sphäroiden. Der größte Fall ist, sicherzustellen, dass das Problem abrupt ohne Fehler gelöst wurde.
