저자 감사 토니 파머와 H. 간디 (스탠포드 신경외과) 그림 4에서 murine NPCs 벡터 아트를 제공 하는 사용 하 고 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 3.0 Unported 라이센스 (https://creativecommons.org/ 아래 Servier 의료 예술에서 적용 licenses/by/3.0/legalcode)입니다. 이 작품의 일부에는 스탠포드 나노 공유 시설 (SNSF), 수상 ECCS-1542152에서 국립 과학 재단에 의해 지원 되는 수행 되었다. N.A.S. 지원 국립 과학 연구소에서의 일반 의료 건강의 국가 학회 (32 GM 008412)의 인정합니다. C.M.M. 사전 박사 친목 (F31 EB020502) 그리고 Siebel 학자 프로그램 NIH NRSA에서 지원을 인정 한다. S.C.H. 재생 의학 (RT3-07948)는 건강의 국가 학회 (U19 AI116484 및 R21 EB018407), 국립 과학 재단 (DMR 1508006), 및 캘리포니아 연구소에서 지원을 인정합니다. 이 연구는 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소의 아동 건강 및 인간 발달 (NICHD), 국립 연구소에 의해 지원 되는 재생 재활 연구 및 교육 (AR3T), 얼라이언스에서 자금 지원을 받은 신경 성 질환 및 치기 (NINDS), 국립 생물 의학 이미징 및 생명 공학 (NIBIB)의 수상 번호 P2CHD086843에서 건강의 국가 학회. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 의견을 대표 하지 않는다.

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저자는 공개 없다.

재조합 형 단백질 표정과 정화 높은 재현성 바이오 소재를 합성 하는 강력한 도구입니다. 때문에 크게 상용화 분자 클로닝의 출현, 사용자 정의 재조합 형 플라스 미드 구입하실 수 있습니다 여러 공급 업체에서 크게 ELPs 같은 재료와 함께 일 하는 시간을 감소 시키는. 마찬가지로, plasmids 원래 작품 연방 계약에 의해 지원 되었다 미래 일 비영리 사용 될 것입니다 때 원래 실험실에서 직접 요청할 수 있습니다. 전체 ELP 아미노산 시퀀스 여러 ELP 변종31이전 게시 되었습니다. 그러나, 재조합 단백질의 최종 정화에 식에서 프로세스는 일반적으로 감소 수익률 또는 낮은 품질의 제품으로 이어질 수 있는 중요 한 단계의 숫자 포함 됩니다. ELP 준비에 대 한 가장 일반적인 문제 중 일부는 다음 중 하나에 발생: (1) 저장된 세균성 주식의 품질, 세균 막, 그리고 (3) 단백질 정화 열 사이클링을 통해 방해 (2) 첫 번째 동결-해 동 주기.
단백질 식 및 다른 비 생물 재료 생산 수단의 사이의 주요 차이점은 우리는 고분자를 합성 하는 재조합 호스트의 생물 학적 기계를 활용 하. 그 후,이 기술은 고유 제한 함께 제공: 세포 죽음 또는 손상. 세포 죽음 가장 일반적으로 접시 또는 상대적으로 천천히 성장 하는 비정상적으로 작은 식민지를 질주 후 세균성 식민지의 감소 된 수로 자체 명단. 세균성 주식, 신중 하 게, 유지 하는 경우 남아 있을 수 있는 안정적인 년; 그러나, 반복 사용 또는 냉장고 실패 연속 동결-해 동 주기 세포 생존 능력을 감소 하거나 DNA 손상으로 이어질 수 있습니다. 전형적인 BL21 박테리아 주식 10%와 40% 글리세롤 간의 볼륨 정지 세포와 혼합 하 여 사용 합니다. 글리세롤의 목적은 동결 시 얼음 결정을 nucleating에서 막 피해를 줄이는 것입니다. 따라서, 낮은 농도 사용 하 여 (< 10%), 높은 농도 동안 손상 된 막으로 이어질 수 있습니다 (> 40%) 충분히 재고는 결코 세포 죽음에 주요한 정지에 어 포인트를 억제 수 있습니다. 그러나, 최적의 글리세롤 수준 내 에서도 세균성 주식 해야 수 없습니다를 완전히 해 동으로 다시 고정 및 세포 독성 효과 글리세롤에서에서 막 손상의 조합으로 이어질 수 있습니다 감소 주식 생존 및 DNA 손상. 그러므로 그것은 세균성 주식 낮은 식민지 수에 결과 또는 셀 (식 동안 느린 OD600 램프 속도으로 각 성) 지속적으로 느린 속도로 나누어는 관찰, 플라스 미드를 다시 변환 하 고 새로운 주식은 간단한 이 문제를 해결 하려면 첫 번째 접근입니다. 이 염두에서에 두고, 세균성 주식의 장기 유지와 DNA의 무결성을 보장 하기 위해 그것이 가장 순화 된 DNA를 세포 내 물에 냉동으로 당신의 플라스 미드의 복사본을 저장 하. 이 방법으로 DNA를 저장 실패 한 주식 또는 냉장고 실패 등 예기치 않은 이벤트, 원래 DNA의 신뢰할 수 있는 소스 사용할 수 있는 변환에 대 한 보장 합니다.
엘 프 제작에 있는 또 다른 중요 한 단계는 식 호스트에서 대상 단백질의 정화 이다. 대장균 에서 단백질 추출 nucleating 얼음 결정을 형성 하는 일시 중단 된 세포 lysate 동결, 시 연속 동결-해 동 주기와 혼합 추가 통해 사용 하 여 세포 벽을 파괴 함으로써 이루어집니다. 세포 벽을 파열에 대 한 대체 방법은 쥡니다 또는 언론 등 활용할 수 있습니다. 그것만 냉동 및 기타 특수 장비를 필요로 특히, 연속 동결-녹고는 lysate의 유리 하다. 그러나,이 절차는 nonspecifically DNA, RNA 및 단백질 오염 물질, 프로 테아 제 대상 단백질을 저하 가능성이 있는 이외에 출시 하였습니다. 따라서,를 오염을 방지 하 고 감소 하는 수확량, deoxyribonuclease 나 (DNase)와 phenylmethanesulfonyl 불 (PMSF) DNA 저하를 억제 하는 프로 테아 제, 각각 lysate 셀에 추가 됩니다. DNase 추가 하기 전에 DNA의 존재 관찰할 수 있습니다 시각적으로 다시 중단된 셀 통해 '힘 줄' 모양으로 첫 번째 재개 다음 lysate. DNase는 적극적으로이 DNA를 저하 하 고 따라서 세포 lysate 쉽게 원심 분리를 통해 정화의 점성을 감소 시킨다. DNA의 최적의 고장 세포 lysate 완전히 액체 것 같다 고 힘 줄 모양을 볼 수 이상 함으로써 시각적으로 확인할 수 없습니다. 우리 당 mL 세포 lysate DNase의 ~0.1 mg의 추가 필요한 저하를 달성 하기 위해 충분 한 연습에서 관찰 했습니다. 그러나, DNA의 존재, 여전히 관찰 하는 경우 더 많은 DNase 추가할 수 있습니다 다음 동요의 추가 2 ~ 3 시간. 전에 lysate의 잠재력을 충분히 녹여 DNase 성급 하 게 추가 되는 경우에 비슷한 문제가 발생할 수 있습니다. 이 경우에, 추운 온도 DNase의 조기 비활성화로 인해 DNA 저하의 효율성을 제한할 수 있습니다. 이 문제를 피하기 위해, 그것은 종종 DNase 치료 전에 약 8 시간에 대 한 해 동 다시 일시 중단 된 펠 릿을 허용 하는 것이 좋습니다. 또한, 낮은 단백질 수익률 보고 DNA의 붕괴는 충분 한 되었습니다 경우 더 프로 테아 제에서 잠재적인 단백질 저하를 줄일 수 있도록 더 많은 PMSF 추가 필요할 수 있습니다.
최적의 표현의 ELPs 보장에 대 한 추가 고려 사항 이득의 주의 깊은 이해 등 선택한 항생제의 한계. 여기, pET15b 벡터는 암 피 실린 저항 유전자를 포함 하는 단백질 식에 사용 되었다. 기능적으로, 애완 동물 벡터 시리즈 성공적인 유도32,33다음 대상 단백질에 전념 하는 박테리아의 단백질 식의 50%와 함께 중요 한 단백질 표정 허용. 그러나, 암 피 실린 선택 항생제로 최적의 식을 방해할 수 있는 몇 가지 제한이 함께 제공 됩니다. 첫째, 암 피 실린 대장균 의 존재의 beta lactamase의 출시로 인해 빠르게 발생할 수 있습니다. 경우에 암 피 실린의 충분 한 수량 저하 암 피 실린 인코딩 플라스 미드 (즉 ELP 인코딩 플라스 미드) 완전히 손실 될 수 있습니다. 결과적으로 때 더 긴 기간을 위한 ELPs 표현, 단백질 표정 수준 해야 신중 하 게 모니터링 ELP 인코딩 유전자의 충분 한 양의 바람직한 식 수 있도록 유지 하려면 연속 시간 시점. Beta lactamases의 형성 문제 해결 가능한 방법 초보 문화 아래로 회전 하 고 다시 항생제 무료 매체 표현 매체를 접종 이전에 셀 중단 포함 됩니다. 이 프로세스 효과적으로 항생제 타락 하는 효소의 양도 제한 하 고의 큰 부분을 보장 대상 단백질 인코딩 벡터를 포함 하는 셀. 또한, 암 피 실린의 약 2-3 주 제한 된 수명 있다. 따라서, 단백질 식 문화 접시 사용 하기 2 주 전에 최대 4 ° C에서 저장 되어야 한다. 마지막으로, 시작 및 식 미디어, 암 피 실린 재고 솔루션 내 암 피 실린의 효 험 사용 해야 합니다 수 생산된 신선한 즉시 전에, 장기 저장 덜 효과적인 항생제를 끌 수 있습니다.
열 순환 통해 ELPs의 간단한 정화는 LCST의 존재 수 있습니다. 특히, 높은 온도 소금의 존재, 엔트로피 세력 덜 용 해 되 고 이후 형성 폴리머 풍부한 coacervate 단계 ELPs 발생할. 다른 한편으로, 낮은 온도에서 ELPs 수용 성 유지 하 고 쉽게 솔루션으로 해산. 원심 분리 단계를 수집 하 고 엘 프 포함 된 단계를 연속적으로 삭제와 결합이 두 온도 정권 사이 자전거 단백질을 집중 하 고 동시에 비 ELP 오염 물질의 존재를 감소 시킨다.
그러나, 있다 단계의 수 어디 ELPs이 정화 과정에서 손실 될 수 있습니다. 첫째, 모든 감기 스핀 이전 솔루션을 포함 하는 단백질은 알칼리 화 된 9.0의 pH에. 이 높은 산도 제공 deprotonate 특정 아미노산은 단백질 중추, 효과적으로 충전된 상태에서 그들을 떠나 그들의 가용성을 더욱 향상에. 따라서,이 단계를 전술한 또는 단백질 해산에 대 한 충분 한 시간을 허용 하지 발생할 수 있습니다 수확량에서 감소 비 solubilized 단백질 원심 분리 동안 수송과 되며 삭제로.
마찬가지로, 대상 단백질 수 손실 뜨거운 회전 절차는 ELP는 일지도. 처음에, NaCl는 ELP의 용 해도 줄이기 위해 단백질이 풍부한 상쾌한에 추가 됩니다. 소금 수성 단계에서 분리 하기 위하여 단백질을 일으키는 단백질와 물 분자 간의 정전기 상호 작용을 보호 하는 작업. 이 효과 있는 게 엔트로피 효과 인해 더 ELPs 주변 함수의 '케이지' 분해 하 고 단백질의 집계 강제로 솔루션을가 열 하 여 증폭 됩니다. 낮은 단백질 농도에서 (즉., 첫 번째 열 사이클), 혼자 소금의 추가 종종이 단계 분리를 일으킬 충분 하지 않습니다. 그러나, 단백질의 농도 증가 (즉., 나중 열 사이클), 적은 보조 오염 물질 소금 상호 작용할 수 있다는 ELP 침전 더 쉽게 것입니다. 그 결과, 염 분을 너무 빨리 추가 하는 경우 그들은 갇혀 수 있습니다 될 물리적으로 단백질, 집계 하 여는 효과적으로 솔루션의 소금 농도 감소 하 고 더 단백질 강 수를 제한. 따라서, 소금 그들이 homogenously 솔루션 통해 배포할 충분 한 시간을 가질 수 있도록 3 개의 작은 일괄 처리에 추가 되어야 합니다. 최종 메모로 서, ELP 백본 통해 유사 더 엘라 스 틴 같은 지역의 게스트 잔류물에 대 한 수정 또는 바이오 액티브 지역 변경 LCST 동작 영향 크게 수 있습니다. 따라서, 단백질 이체에 걸쳐 최적의 단백질 수율을 보장 하기 위해, 그것은 pH, 염 농도, 및 소금 종류를 최적화 하는 중요 한 (예., 여러차례 또는 divalent) 추위와 뜨거운 회전에 대 한.
SDS 페이지 프로토콜 완료 되 면 실행 것이 좋습니다 쉽게 중요 한 ELP 손실 정화 단계 동안 발생 하는지 확인 하는 데 사용할 수 있습니다. 짧게, ELP 상쾌한 뜨거운 스핀 다음에 감지 되 면 다음 단백질은 안 되 고 효과적으로 시 켰 던. 마찬가지로, ELPs solubilized 펠 릿 감기 스핀 다음의 샘플에서 식별 하는 경우 다음 단백질은 안 되 고 효과적으로 해산.
ELP hydrogels 합성 또는 자연스럽 게 파생 된 자료를 통해 많은 이점을 제공합니다. 특히, 아민 반응 crosslinker THPC 사용 하 여 단백질 가교의 저비용, 단순 하 고 조정할 수 있는 메커니즘을 제공합니다. 그러나, 주목 해야 한다 가교 프로토콜 내에서 뚜렷한 한계가 있다. THPC 산소 민감한, 그리고 부적 절 한 조건 하에서 저장 하는 경우 그것은 신속 하 게 반응 효율에서 저하 수 있습니다. 또한, 주 아민과의 반응으로 인해 THPC 아민에서 부유한 미디어 또는 세포 표면에 있는 단백질을 주변으로 반응할 수 있습니다. 따라서, ELP hydrogels 형성 때 그것 가교 효율성에서 가능한 exogenous 단백질 분 및 따라서 감소를 셀 펠 릿으로 미디어 오염을 방지 하 고 좋습니다. 마지막으로,이 가교 메커니즘 바이오 액티브 지역 순서 없는 리 진 잔류물을 포함 하는 걸로 하 고 일부 셀 접착제 모티프의 잠재적인 통합을 따라서, 제한 (예., IKVAV34). 이러한 제한, 수정 해결 하기 위해 아 지 드와 bicyclononyne (BCN) ELP 백본 반응 파트너 앞에서 설명한27바이오 직교 가교에 대 한 수 있습니다.
그것은 ELP LCST 동작 히드로 미세 지시에 중요 한 역할을 지적 한다. LCST 이상의 온도 정권에서 ELPs 매트릭스 다공성에 영향을 줄 수 있는 단백질이 풍부한 고 단백질 결핍 단계의 형성 및 매트릭스9의 가교 효율 솔루션에서 침전. 대부분 세포 배양 실험 ELP LCST 이상의 순수 관련 온도 (~ 37 ° C)에서 실시 하는, 때문에 이러한 효과 고려 한다. 효과적으로 crosslink 및 양식 hydrogels 상호 단백질 네트워크 주 아민은 리에서 수 있어야 합니다 THPC crosslinker에 물리적으로 액세스할 수 있습니다. 있습니다 ELP 집계 충분 한 가교에 도달 하기 전에 발생 하는 경우 액세스할 수 없는 및 따라서 가교에 참여할 수 없습니다 ELPs 단백질이 풍부한 단계 안에 갇혀 있을 수 있습니다. 이 한계를 해결 하기 위해 우리의 프로토콜에는 실내 온도에, 예비 가교는 히드로의 전에 ELP의 열 단계 변화를 겪 습 수 있는 초기 15 분 가교 기간을 필요 합니다. 이 실내 온도 인큐베이션 히드로 가교 마무리를 37 ° C에서 추가로 15 분 인큐베이션 옵니다. 이 절차는 충분 한 가교와 ELP 물자의 강력 하 고 재현 가능한 겔 화에 대 한 중요 한.
결론적으로, 엘 프를 사용 하 여 조작 하는 재조합 형 단백질 hydrogels 단백질 시퀀스 및 따라서 3D 셀 microenvironment의 뛰어난 tunability를 제공 합니다. ELP 고분자 생체 외에서 그리고 vivo에서 시스템의 다양 한 쉽게 때문에 LCST 동작, 정화, 높은 수율에 표현할 수 표시 및 생체 되었습니다. 재조합 호스트 대장균 의 사용 상승 근처의 고분자 분자량과 기능의 완벽 한 제어를 제공 하는 간단 하 고 저렴 한 절차를 제공 합니다. 함께,이 기술은 강력한 tunability와 히드로 플랫폼 차원에서 세포 유형의 다양 한 문화에 대 한 수의 재현성에 대 한 수 있습니다. 마지막으로,이 ELP 히드로 플랫폼은 의무가 qRT-PCR, 서쪽 오 점, DNA 추출 및 셀 immunostaining9를 포함 하 여 많은 다운스트림 생 화 확 적인 분석 실험.

지난 세기 동안 2 차원 (2D) 조직 문화는 근본적인 세포 생물학에서 공부 시험관에대 한 통합 도구 집합으로 개발 했다. 또한, 2 차원 세포 배양에 대 한 상대적으로 저렴 하 고 간단한 프로토콜은 많은 생물학과 의학 분야에 걸쳐 그것의 채용에 이르렀다. 그러나, 과거의 연구 표시 했다 전통적인 2D 플랫폼 이어질 수 있는 결과 그 수집 된 vivo에서에서 현저 하 게 이탈, 귀중 한 시간을 일으키는 원인이 되 고 자금 낭비 임상 지향적인된 연구1,2, 3. 우리와 다른 가설 것이 불일치 최적의 확산 및 다양 한 종류의 세포 성숙에 필요한 수 있는 2D 표면에 경작 하는 셀에 제공 하는 네이티브 생화학 및 생물 단서의 부족에 표시 될 수 있습니다.
이러한 제한 및 도움 다리 2D 간의 격차를 해결 하기 위해 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문, 연구원은 세포 캡슐화1,4,5 개발된 3 차원 (3D) 히드로 플랫폼을가지고 ,6. Hydrogels는 이상적인 재료는 세포 외 기질 (ECM) 생체 내에서 그들의 조직 같은 기계적 성질 및 영양분의 빠른 수송을 가능 하 게 물을 부 어 구조의 내 인 성 microenvironment을 정리 하 고 신호7,8요인. 또한, 3D hydrogels 독립 제어할 발판의 기계 및 생 화 확 적인 속성을 설계할 수 있습니다. 매트릭스 역학9,10,,1112 와 셀 접착제 ligands13,,1415 셀에 영향을 잘 알려져 있습니다. 생체 외에서 행동 하 고 vivo에서. 따라서, 가변 속성 3D hydrogels 셀과 그들의 microenvironment 간의 인과 관계를 연구 하는 플랫폼을 제공 합니다. 이상적인 3D 하이드로 겔 매트릭스에 대 한 기준 간단 하 고, 비 세포 독성 세포 캡슐화로 생리 적으로 관련 된 기계적 특성의 독립적인 tunability 및 기본 세포 접착 모티프의 모방을 포함.
모두 합성 (예., 폴 리 에틸렌 글리콜, polylactic 산, 폴 리 (glycolic acid)) 자연스럽 게 파생 (예., alginate, 콜라겐, Matrigel) hydrogels 있다 이점이 문화 플랫폼 2D 생체 외에서 ; 그러나, 그들은 또한 그들의 적용을 제한 하는 중요 한 단점이 있다. 첫 번째, 포유류 세포에 잠재적으로 독성이 될 수 있는 가혹한 가교 조건을 요구 하는 많은 합성 하 고 자연스럽 게 파생 된 플랫폼, 선도적인 세포 생존7감소. 또한, 많은 합성 플랫폼 네이티브 bioactivity 부족 그리고 증가 비용 및 복잡성16을 추가할 수 있는 보조 화학 반응을 통해 공업화 될 해야 합니다. 마지막으로, 자연스럽 게 파생 된 자료는 일반적으로 내장 바이오 액티브 도메인을 포함, 그들은 종종 높은 일괄 배치 변화를 시달려 고 종종 상대적으로 약한 젤7,17형성에 제한 됩니다.
재조합 단백질 공학 단백질 시퀀스를 명시적으로 제어 함으로써 재료 설계에 대 한 고유한 도구 집합을 제공 하 고, 확장 하 여, 최종 하이드로 겔의 잠재적인 기계 및 생 화 확 적인 재산18발판. 또한, 대장균 (대장균) 단백질을 표현 하의 잘 알려진 생물 학적 기계를 활용 하 여 재료 생산 수 있습니다 효율적이 고 일관 되 게 제한 남북 및 내부-일괄 가변성. 여기에 제시 된 엘라 스 틴 같은 단백질 (ELP)는 3 개의 조작된 도메인: 항 체를 태그를 통해 붙일 라벨을 허용 (1) T7, His6 태그, 수 여 탄성 기계적 성질 및 화학에 대 한 (2)는 ' 엘라 스 틴 같은 ' 지역 가교, (3) 세포 접착 모티프에 대 한 인코딩 ' 바이오-액티브 ' 지역.
엘라 스 틴 같은 지역 4 'Xaa' 아미노산 사이트 이소류신 (Ile), 하지만 될 수 있는 어떤 아미노산 프롤린 제외 될 하도록 정식 (발-프로-Gly-Xaa-Gly)5 엘라 스 틴 시퀀스를 기반으로 합니다. 이 시퀀스는 간단한 정화 후 식 열 사이클링19,20를 통해 악용 될 수 있는 낮은 중요 한 솔루션 온도 (LCST) 동작으로 재조합 ELPs endows. 이 LCST 속성 열 집계에 다른 온도에 게스트 'Xaa' 찌 꺼 기21,22를 수정 하 여 조정 될 수 있습니다.
여기, 5 엘라 스 틴 같은 반복 중 하나에 'Xaa' 위치는 아민 제시 리 (리스) 아미노산, 히드로 가교에 이용 되는 대체 되었습니다. 우리의 이전 작품 비 세포 독성과 강력한 아민 반응 crosslinker tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium 염화 (THPC)23반응을 통해 가교를 보이고 있다. 다양 한 전체 단백질 콘텐츠 및 crosslinker 농도, 우리 hydrogels 순수 관련 강성 범위 (~0.5-50 kPa)9,,2324스팬 조정 될 수 있습니다 생산 수 있습니다. 기계적 성질, 튜닝 외에 히드로 내 세포 접착 ELP 단백질의 백본 내의 정식 셀 접착제 도메인의 통합에서 유래한 다. 예를 들어 비 바인딩 'RDGS' 변종 세포-매트릭스 접착24을 제한 확장된 fibronectin 파생 'RGDS' 아미노산 시퀀스의 세포 접착 및 스크램블, 동안 구조적 유연성을 허용 합니다. 세포 접착 비 접착 단백질 뿐만 아니라 총 단백질 농도의 비율을 변조, 우리가 효과적으로 리간드 농도의 넓은 범위에 걸쳐 hydrogels 생산 수 있습니다. 릴리스할, 히드로 플랫폼 독립적으로 튜닝할 수 없는 다양 한 종류의 세포 최적의 3D 문화에 대 한 분리 된 생 화 확 및 생물 속성을 개발 했습니다.
매트릭스 강성 및 접착제 ligand tunability, 재조합 hydrogels 셀 확산, 확산, 및4 3D 컨텍스트 내에서 마이그레이션에 필요한 디자인 특정 소재 저하 프로필 기능 제공 , 9.이 저하 특히 대상으로 확장된 'RGDS'9 또는 엘라 스 틴 같은 시퀀스25프로 테아의 분 비 세포에서 제공. ELP hydrogels 세포 생존 능력 및 기능 immunocytochemistry 양적 역에 대 한 DNA/RNA/단백질 추출 등 공부에 필요한 후속 생 화 확 적인 분석 실험을 지원 하기 위해 표시 되었습니다 또한 전사-연쇄 반응 (qRT-PCR)와 서 부 오9점. ELP 변종 vivo에서 모델의 수에도 사용 되었습니다 그리고26면역 시스템 의해 잘 용납 될 것으로 알려져 있습니다.
합쳐, ELP 다양 한 합성 또는 자연스럽 게 파생 된 소재 플랫폼, 생화학 및 생물 tunability의 동일한 정도 부족에 비해 혜택을 자랑 하는 셀 캡슐화 연구 소재 플랫폼으로 고 재현성입니다. 또한, ELP의 간단 하 고 세포 독성 비 사용 다양 한 세포 유형 (예., 병아리 지 루트 중추14,24, murine 신경 조상 세포9, 인간 간 엽 줄기 세포27, 소 신생아 chondrocytes28, 인간 내 피 세포29,30) 2 차원 세포 배양에 비해 생 3D ECM의 더 순수 관련 모델에 대 한 수 있습니다. 여기, 우리 recombinantly 파생의 표현에 대 한 프로토콜을 제시, 3D에 대 한 가변 히드로 플랫폼으로 사용 하기 위해 ELPs 세포 캡슐화. 우리는 더 다운 스트림 형광 라벨 및 캡슐화 된 세포의 confocal 현미경 검사 법에 대 한 방법론을 제시.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="904">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Elastin-Like Protein Expression and Purification</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% Ethanol</td>
			<td>RICCA Chemical</td>
			<td style="width:123px;">2546.70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A3920-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1760-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">9002-18-0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21(DE3)pLysS Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:260px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0230-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA disodium salt, dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">O2793-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1755-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:260px;">EMD Millipore</td>
			<td>1.10285.5007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:123px;">52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">195381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S 8045-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe Filter Unit (0.22 &#956;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific Broth</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">71754-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#956;m syringe filters</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 mm thick silicone sheet</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:123px;">70338-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (2 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (4 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (5 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">No. 1 12 mm glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">404861-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5% Tryspin/EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td style="width:123px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:260px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">D1306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:260px;">Lampire Biological Labs</td>
			<td style="width:123px;">7332100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16210-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Mouse Nestin Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">556309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Sox2 Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">23064S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Nail Polish</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Hardset Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:123px;">H-1400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of elastin-like protein hydrogels for encapsulation and immunostaining of cells in 3d

2 차원 (2D) 조직 문화 기술 근본적인 세포 생물학의 우리의 이해에 필수적인 되었습니다. 그러나, 전통적인 2D 조직 문화 시스템 부족 결과 사이의 중요 한 결과 3 차원 (3D) 매트릭스 분리 수집 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 한계를 해결 하기 위해 연구자는 vivo에서 세포 microenvironment의 생 화 확 및 생물 속성을 흉내낼 수 있는 3 차원 하이드로 겔 조직 문화 플랫폼 설계 있다. 이 연구는 3D 셀 캡슐화 및 다운스트림 생 화 확 적인 분석 실험을 지 원하는 소재 플랫폼을 개발할 필요가 동기가 있다. 재조합 단백질 공학 단백질 시퀀스의 특정 컨트롤에 대 한 허용 및 따라서, 확장, 결과의 잠재적인 기계 및 생 화 확 적인 속성 3D 하이드로 겔 소재 설계 및 개발에 대 한 고유한 도구 제공 매트릭스입니다. 여기, 우리는 recombinantly 파생 된 엘라 스 틴 같은 단백질 (ELP), 양식 hydrogels 독립적으로 조정할 수 있는 기계적 특성 및 세포 접착 ligand 농도에 사용 될 수 있는 표현에 대 한 프로토콜을 제시. 우리 더 ELP hydrogels 내 셀 캡슐화에 대 한 방법론을 제시 하 고 다운스트림 분석 및 정량화에 대 한 셀을 포함의 후속 immunofluorescent 얼룩.

ELPs이이 프로토콜에 사용 되는 5 개 영역으로 구성: T7 태그, His6 태그, enterokinase (EK) 분열 사이트, 생체 활성 영역 및 엘라 스 틴 같은 지역 (그림 1). T7 His6 태그 표준 서쪽 오 점 기술을 통해 쉽게 식별할 수 있습니다. EK 분열 사이트의 소개 태그 영역의 효소 제거 필요한 경우 수 있습니다. 바이오 액티브 지역 확장, fibronectin 파생 셀-접착제 ('RGDS') 또는 비-접착제 ('RDGS') 시퀀스를 인코딩합니다. 마지막으로, 엘라 스 틴 같은 영역의 중앙 반복 이용 잔류물 사이트 측면에 서 반복 포함 ~ 32 ° C31의 LCST를 달성 하기 위해 이소류신 THPC 통해 가교를 가능 하 게에서 lysine 그룹을 포함 합니다.
게시물 식, SDS 페이지 또는 서쪽 오 점 시각화 하는 분자량 고 ELPs T7 (MASMTGGQQMG) 또는 His6 (HHHHHH) (그림 2)와 같은 항 체 태그를 포함 하는 신원 확인 사용할 수 있습니다. 제어 조건 하에서 성공적인 식 대략적인 분자량 (~ 37 kDa)에서 단일 어두운 밴드의 존재에 의해 표현 매우 균질 제품 모두 SDS 페이지 (그림 2A)를 사용 하 여 이러한 단백질의 및 서쪽 오 점 ( 그림 2B)입니다.
통제 조건에서 서쪽 오 점에 낮은 분자량 밴드의 존재는 단백질의 어떤 일부분은 완전히 번역 및 후 식 (그림 2C) 저하 했다 나왔다. 특히, 여기 대 중 약 또는 해당 하는 한 생물 활동 영역과 3 엘라 스 틴 같은 지역 ('반복'), 무게 약 대상 단백질의 4 ~ 9 kDa에 의해 균등 하 게 분포 됩니다. 이 작은 단백질 조각은 일반적으로 식이 더 높은 온도에서 실시 하는 때 (> 32 ° C) 그림 2C처럼. 이러한 낮은 분자량 단백질의 존재는 예측할 수 없는 기계적 특성으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 일반 게시물 식 검사 것이 좋습니다 높은 품질의 최종 제품을 보장 하기 위해.
ELP 기반 hydrogels의 기계적 강성 ELP의 농도 또는 THPC 반응 그룹: ELP 1 차 아민의 비율을 조작 하 여 수정할 수 있습니다. 동시에, 농도 세포 접착 ligands의 어떤 강성 정권 내 비 접착제 (RDGS) 시퀀스에 ELP 변종 세포 접착제 (RGDS)의 비율을 변경 하 여 조정 될 수 있습니다. 이 두 개의 변수를 조작 하 여 우리는 기계적 특성 및 리간드 농도 (그림 3)의 스펙트럼을 젤을 생성할 수 있습니다.
3D ELP hydrogels 내의 셀을 캡슐화 하기 위해 셀의 원하는 수 매체에 일시 중단 하 고 centrifuged 셀 펠 릿 (그림 4A)을 생성 하는. 매체는 튜브에서 발음 되며 셀 다시 원하는 농도의 ELP 솔루션 균일 하 게 정지. 다음, THPC 솔루션 셀/ELP 현 탁 액에 추가 하 고 동질적인 혼합물을 형성 하기 위하여 철저 하 게 pipetted 이다. 이 솔루션은 신속 하 게 24-잘 접시는 피 펫을 사용 하 여 내 살 균 실리콘 금형을 전송 하며 각 (그림 4B) 실내 온도 15 분 동안 37 ° C에서 crosslink 허용. 마지막으로, 매체 잘 접시에 추가 하 고 실험에서 37 ° C에서 incubated입니다.
라이브/죽은 얼룩이 지는 세포 생존 능력 및 ELP hydrogels 내 성공적인 세포 캡슐화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 성인 murine 신경 조상 세포 (Npc) 표시 높은 세포 생존 능력 3% (w/v) ELP 히드로 내에서 7 일 동안.
3D ELP hydrogels 이전 정식 NPC 단백질 마커 SRY (섹스 지역 Y 결정)의 표현을 통해 측정 NPC 줄기 유지 보수를 지원 하기 위해 표시 되었습니다-상자 2 (Sox2) 및 nestin9. NPCs는 ELP hydrogels Sox2 핵 지역화 및 immunostaining 및 confocal 영상 (그림 6)를 통해 세포질 nestin 필 라 멘 트의 낮은 THPC 가교 쇼 높은 식이 3% (w/v)에 캡슐화.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig1.jpg"> 그림 1 : ELP와 해당 아미노산 시퀀스의 도식 대표. 이 연구에 사용 된 엘 프 항 체 기반 이미징, 세포 접착 도메인의 도입에 대 한 생리 활성 영역 및 수 여 탄성 기계적 특성 및 화학적 가교에 대 한 엘라 스 틴 같은 지역에 대 한 t 7과 His6 태그를 포함 되어 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig2.jpg"> 그림 2 : 대상 단백질 발현 SDS 페이지 및 서쪽 오 점 분자량 및 동결 건조 된 완성품의 정체성 확인 유효성을 검사할 수. 순수한 전체 길이 ELP 6 (HHHHHH) 태그 SDS 페이지 (A) 와 서쪽 오 점 T7 (MASMTGGQQMG) 또는 히스티딘을 사용 하 여 보고 37 kDa의 분자량에서 실행 (B). (C). ELP 식 프로토콜에 편차 때문에 ELP의 불순 한 일괄 낮은 분자 무게를 가진 ELPs 표현 될 수 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig3.jpg"> 그림 3: RGDS ligand 콘텐츠 조정 될 수 있다 독립적으로 하지 ELP hydrogels 내 기계적 성질에서. 5% (w/v) 및 3% (w/v) ELP hydrogels ~ 800의 전단 계수는 Pa와 ~ 400 Pa, 각각. THPC 반응 그룹: ELP 1 차 아민의 1:1 비율로 Hydrogels 37 ° C에가 열 하는 15 분 동안 실내 온도에서 가교 화 그리고 측정 전에 5 분 동안 equilibrate 수 있습니다. 데이터는 평균 ± 사 우 스 다코타, *p < 0.001. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig4.jpg"> 그림 4: ELP hydrogels에 셀 캡슐화의 도식. (A). 셀 처음 매체 및 수송과 원심 분리기를 사용 하 여 단일 세포 현 탁 액에 해리 했다. 매체는 튜브에서 발음 그리고 셀은 다시 원하는 농도에 ELP 솔루션에 정지 잘 혼합. 마지막으로, THPC 가교 솔루션은 추가 하 고 잘 혼합. (B). THPC의 추가 직후, 솔루션 한 피 펫을 가진 실리콘 형으로 캐스팅 됩니다. 솔루션 수 crosslink 실 온에서 15 분 뒤에 두 번째 15 분 부 화 37 ° c.에 대 한 매체는 잘 실험의 기간에 대 한 다음 문화에 추가 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig5.jpg"> 그림 5: 신경 조상 세포 유지 ELP hydrogels 높은 생존. 신경 조상 세포의 대표 이미지 캡슐화 3% (w/v) ELP hydrogels 1:1 가교 (THPC 반응 그룹: ELP 주 아민)와 7 일 후에 문화. 녹색: 라이브 얼룩 (calcein-오전); 레드: 죽은 (브로민 homodimer) 얼룩입니다. 눈금 막대 = 100 µ m.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig6.jpg"> 그림 6 : 3D ELP hydrogels 지원 신경 조상 세포 줄기 메이커 식. Sox2 표현 및 ELP hydrogels 문화의 7 일 후 단백질 nestin 신경 조상 세포의 면역 형광 이미지. 이미지는 3% (w/v) 0.5:1 가교 (THPC 반응 그룹: ELP 주 아민)와 ELP 젤에 셀을 표시 합니다. 블루: DAPI (핵); 레드: Sox2; 녹색: nestin. 눈금 막대 = 25 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

그들은 완전 한 tunability 폴리머 백본 및 따라서 셀 microenvironment의 허용으로 재조합 단백질 엔지니어링 hydrogels는 3D 세포 배양에 대 한 유리한 있습니다. 여기, 우리 재조합 엘라 스 틴 같은 단백질 정화의 과정 및 3 차원 하이드로 겔 셀 캡슐화에의 응용을 설명합니다.

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.2K 조회수.  Stanford University. 그들은 완전 한 tunability 폴리머 백본 및 따라서 셀 microenvironment의 허용으로 재조합 단백질 엔지니어링 hydrogels는 3D 세포 배양에 대 한 유리한 있습니다. 여기, 우리 재조합 엘라 스 틴 같은 단백질 정화의 과정 및 3 차원 하이드로 겔 셀 캡슐화에의 응용을 설명합니다.

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Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

연구

생체공학

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

3 차원 조직 공학 인간의 식도 점막 모델의 제조, 특성 및 사용 가능성

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

생체 외에서 Neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 Glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

글로벌 세포 매트릭스 Metalloproteinase 및 3D Hydrogels 신진 대사 활동 측정

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

라이브 현미경 이미징 에서 3D 하이드로겔의 제어 변형

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

미생물 화학 및 단백질 생산을 위한 광 조절 발효

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

3D 바이오프린팅을 위한 지방유래 줄기세포 구상체의 대규모, 자동화 생산

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have many advantageous properties, including injectability, microscale porosity, and tunability by mixing multiple microgel populations. Methods to fabricate microgels often rely on water-in-oil emulsions (e.g., microfluidics, batch emulsions, electrospraying) or photolithography, which may present high demands in terms of resources and costs, and may not be compatible with many hydrogels. This work details simple yet highly effective methods to fabricate microgels using extrusion fragmentation and to process them into granular hydrogels useful for biomedical applications (e.g., 3D printing inks). First, bulk hydrogels (using photocrosslinkable hyaluronic acid (HA) as an example) are extruded through a series of needles with sequentially smaller diameters to form fragmented microgels. This microgel fabrication technique is rapid, low-cost, and highly scalable. Methods to jam microgels into granular hydrogels by centrifugation and vacuum-driven filtration are described, with optional post-crosslinking for hydrogel stabilization. Lastly, granular hydrogels fabricated from fragmented microgels are demonstrated as extrusion printing inks. While the examples described herein use photocrosslinkable HA for 3D printing, the methods are easily adaptable for a wide variety of hydrogel types and biomedical applications.

This work describes straightforward, adaptable, and low-cost methods to fabricate microgels with extrusion fragmentation, process the microgels into injectable granular hydrogels, and apply the granular hydrogels as extrusion printing inks for biomedical applications.

대량 하이드로젤을 단편화하고 생물 의학 응용 분야를 위한 입상 하이드로젤로 처리

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have ...

Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark of cardiac and musculoskeletal tissues. To study cell response to aligned microenvironments in vitro, several protocols have been developed to generate COL1 matrices with defined fiber alignment, including magnetic, mechanical, cell-based, and microfluidic methods. Of these, microfluidic approaches offer advanced capabilities such as accurate control over fluid flows and the cellular microenvironment. However, the microfluidic approaches to generate aligned COL1 matrices for advanced in vitro culture platforms have been limited to thin "mats" (&lt;40 &#181;m in thickness) of COL1 fibers that extend over distances less than 500 &#181;m and are not conducive to 3D cell culture applications. Here, we present a protocol to fabricate 3D COL1 matrices (130-250 &#181;m in thickness) with millimeter-scale regions of defined fiber alignment in a microfluidic device. This platform provides advanced cell culture capabilities to model structured tissue microenvironments by providing direct access to the micro-engineered matrix for cell culture.

This protocol demonstrates the use of a microfluidic channel with changing geometry along the fluid flow direction to generate extensional strain (stretching) to align fibers in a 3D collagen hydrogel (&lt;250 &#181;m in thickness). The resulting alignment extends across several millimeters and is influenced by the extensional strain rate.

Microengineering 3D 콜라겐 하이드로겔(장거리 섬유 정렬 포함)

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...