This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.

1. Silizium-Wafer-Form Fabrication HINWEIS: Die Photomaske mit AutoCAD-Software und hergestellt von einem kommerziellen Unternehmen entwickelt wird. Dieser Entwurf enthält drei Schichten von verschiedenen Mustern ( <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">Zusatzdatei 1</a> ). Die Höhen der ersten, zweiten und dritten Schichten sind etwa 4 um, 10 um und 50 um betragen. Die Siliziumwafer Form wurde von der Photomaske unter Verwendung von Softlithographie 9, 10 geschaffen. <ol><li> Bake einen Siliziumwafer bei 200 ° C für 10 min des Wasserdampf zu verdampfen. Schleuderbeschichtungs negativer Photoresist SU-8 auf den Siliziumwafer. HINWEIS: Schleuderbeschichtung SU-8 3005 bei 5000 rpm für 30 s, die erste Schicht zu erzeugen, SU-8 2010, um 3.000 Umdrehungen pro Minute für 30 s, die zweite Schicht und SU-8 3025 bei 2000 Umdrehungen pro Minute zu erzeugen, für 30 s die erzeugen dritte Schicht. </li><li> Soft-Backen des beschichteten Wafers vor ter Musterübertragung. Richten und den Wafer in „direkten Kontakt“ -Modus mit einer Mask Aligner aus. HINWEIS: Soft-bake des Wafer für 2 min bei 95 ° C für die erste Schicht, 3 min bei 95 ° C für die zweite Schicht, und 15 min bei 95 ° C für die dritte Schicht. Verwenden , um die Belichtungsdosis bei 100 mJ / cm 2 für die erste Schicht, 130 mJ / cm 2 für die zweite Schicht, und 200 mJ / cm 2 für die dritte Schicht. </li><li> Nach der Belichtung Nacherwärmung des Wafers und entwickelt es SU-8-Entwickler verwendet. Trocknen der Wafer ein N 2 -Pistole und hart bake der Wafer bei 200 ° C für 30 min verwendet wird . HINWEIS: Der Siliziumwafer Form ist an einem 15 cm-Durchmesser-Petrischale aus Kunststoff Scotch Klebeband, mit dem Muster Seite nach oben weist. Normalerweise stellen wir mehrere identische Chipstrukturen auf der gleichen Form, die mehrere Mikrofluidik-Chips ermöglicht, zur gleichen Zeit hergestellt werden. Jede Form kann wiederverwendet werden viele Male Mikrofluidik-Chips herzustellen. </li></ol> 2. MikrofluidikChip-Herstellung <ol><li> Ein sauberes Wiegeschiffchen auf einer Waage und tariert. Gießen Sie 50 g PDMS Base in das Boot wiegen. </li><li> 5 g des PDMS Härtungsmittels zu dem Wiege Boot (w / w-Verhältnis von 1:10 bis das PDMS Base). Hinweis: Dieses Volumen wird basierend auf einem 15 cm-Durchmesser-Petrischale mit der Form. Justieren der Menge an Reagenz, wenn eine Petrischale mit einer anderen Größe verwendet wird. </li><li> Rühre das PDMS Base und des Härtungsmittels mit einer Einwegpipette. Beginnen vom Rand des Wägeschiffchen und langsam nach innen bewegen. Rühren Sie gründlich mehrere Minuten, bis kleine Blasen in der Mischung zu bilden; Durchmischung ist für PDMS Polymerisation von wesentlicher Bedeutung. </li><li> Die Mischung langsam in die Petrischale; Die Mischung muss die Siliziumwafer Form vollständig bedecken. </li><li> Platzieren Sie die Petrischale in einem Vakuum für 10 min alle Luftblasen aus der PDMS-Gemisch zu entfernen. Wenn Blasen auf der Oberfläche des Gemisches bleiben, verwenden Sie eine Pipette sie auszublasen. </li><li> Inkubieren des SiliziumsWafer-Form mit PDMS in einem Ofen bei 75 ° C für ca. 2 h. </li><li> abschälen sanft die Schicht aus polymerisiertem PDMS aus der Siliziumwafer Form, eine Beschädigung der Konstruktion der Waferform zu vermeiden. Alternativ dazu schneiden die PDMS direkt aus dem Siliziumwafer Form mit einer mindestens 5 mm-Rand um das Muster einer einzigen Kante industriellen Rasierklinge; leicht schälen die PDMS-Schicht von der Waferform. </li><li> Platzieren Sie die PDMS-Schicht auf der Bank mit der Musterseite nach oben weist. Sorgfältig schnitt den einzelnen Chip mit einer einzigen Kante industrieller Rasierklinge aus, eine ausreichende Marge von der Kante eines jeden einzelnen Chips Haltekonstruktion Schäden zu vermeiden. </li><li> Mit dem Muster Seite nach oben, mit einem Stanzstift (0,75 mm ID) Löcher stanzen gerade nach unten durch die Einlass- und Auslass-Kreise auf jeder Seite der Kanäle. HINWEIS: Diese Löcher den Weg für den Fluss des Mediums erstellen. Daher ist es entscheidend, durch die Kreise zu gehen und den ganzen Weg durch die PDMS-Schicht stanzen. Stellen Sie sicher, dassdie PDMS Spalten aus dem Loch entfernen. </li><li> Prüfen jedes gestanzte Loch durch den Stempel Pen-Nadel wieder Einsetzen in das Loch. Achten Sie darauf, die Nadel von der anderen Seite herauskommen kann, was darauf hinweist, dass es keine Blockade. Klebeband am Musteroberfläche, dann vorsichtig abzuschälen das Band Staubpartikel zu reinigen. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens dreimal. Lassen Sie ein sauberes Stück Klebeband auf dem PDMS Sterilisation zu pflegen. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der gegenüberliegenden Seite des PDMS und lassen auf als auch das letzte Stück Klebeband. </li><li> Vorbereiten einer 24 mm x 30 mm Deckglas mit einer Dicke von 0,13-0,17 mm. Spray 70% igem Ethanol auf dem Glas und trocken mit Staubentferner die Oberfläche zu sterilisieren; Zusätzlich kann das Glas mit autoklaviertem Wasser gewaschen und mit Staubentferner gewaschen werden. </li><li> Überträgt das Abdeckglas und PDMS auf eine Kunststoffplatte. Entfernen Sie das Klebeband von dem PDMS und legen Sie das Muster nach oben. Vermeiden Sie jeden Kontakt mit der Musteroberfläche während der Übertragung. </li><li&gt; Platzieren Sie die Kunststoffplatte in der Plasmamaschine. Anwenden Sauerstoffplasmabehandlung zu dem PDMS, und das Deckglases, die Oberflächen hydrophil mit den folgenden Betriebsparametern zu machen: Belichtung, 75 s; Gasstabilisierung, 20 cc / min; Druck, 200; und Leistung, 100 W. </li><li> Legen Sie das PDMS auf das Deckglas, sowohl hydrophile Oberflächen (die Oberflächen, die während der Plasmabehandlung konfrontiert up) verbindet. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen zwischen dem PDMS und dem Deckglas. </li><li> Inkubieren des PDMS-Chip in einem Ofen bei 75 ° C für mindestens 2 h. HINWEIS: Mangelhafte Mikrofluidik während des Experiments Flüssigkeitsleckage auf das Mikroskop führen kann. Daher ist es wichtig, durch leichte die Bindung zwischen dem PDMS und dem Deckglas zu überprüfen, die PDMS von den Kanten mit einer Pinzette angehoben wird. Anheben sanft die PDMS sollte es aus dem Deckglas nicht trennen, eine erfolgreiche Bindung anzeigt. </li></ol> 3. Vorbereitung für das Experiment <ol><li&gt; Rohrvorbereitung. <ol><li> Unterzutauchen die Eingangs- und Ausgangsrohre in 70% Ethanollösung separat 1 Tag vor dem PDMS-Chip Zubereitung. </li><li> Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit autoklaviertem Wasser, um die Rohre zu waschen. Wäscht jedes Rohr durch an der Spritze das Rohr verstopfen und das Rohr mit Wasser zu spülen. </li><li> Wiederholen des Waschschritt mindestens 3 mal Ethanol Rückstand zu reinigen. </li></ol></li><li> Untersuchen Sie die PDMS-Kanäle unter einem optischen Mikroskop mit einem 10X-Objektiv, um sicherzustellen, ist die Struktur konsistent und intakt. Stabilisierung des PDMS-Chips auf dem Mikroskopplattform unter Verwendung eines Scotch-Band. HINWEIS: Stellen Sie mehrere Chips auf einmal in Schritt 2, um sicherzustellen, dass es Backup-Chips, vor allem, wenn das Gerät zum ersten Mal machen. </li><li> Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit autoklaviertem Wasser. Sichern der Spritze an eine Spritzenpumpe und legen die entsprechenden Eingangs- und Ausgangsröhren. Stellen Sie die Waschgeschwindigkeit auf 750 &amp; mgr; l / h, den Chip für etwa 10 Minuten zu spülen. Die Luftblasen in den Zweigkanälensollte in dieser Zeit weggespült werden; wenn verbleibenden Blasen sind, stellen Sie manuell die Geschwindigkeit der Blasen zu beseitigen. </li><li> Hefe-Probenvorbereitung. <ol><li> 1 ml der vorbereiteten Hefeprobe (OD 600 0,6-0,8) in zwei 1,5 ml - Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiert für 5 min bei 3.000 x g. </li><li> Entfernen Sie die Mehrheit des Überstandes aus jedem Röhrchen und den Rest kombinieren, um eine 0,5 ml Probe zu bilden. </li></ol></li><li> Pause, um die Spritzenpumpe und entfernen die Eingangsrohre von dem PDMS-Chip. </li><li> Manuell Umkehren der Spritzenpumpe eine kleine Luftblase (1 bis 2 cm in der Länge) in jedes Eingangsrohr zu saugen. Bewegen auf in der Hefe Probe zu saugen; die Luftblase wird die Probe Grenze zeigen, und zeigt, wie viel Probe gezogen wurde. HINWEIS: Vermeiden Sie die Probe in die Spritze zu saugen. </li><li> Setzen Sie das Eingangsrohr zurück in den PDMS-Chip und starten die Pumpe die Zellen mit einer Geschwindigkeit von 750 &amp; mgr; l / h zu laden. </li><li> Lassen Sie die Spritzenpumpe über 10 min dern und untersucht die Zellenbelastung Progression unter dem Mikroskop; ein erfolgreicher Laden wird Trap-Zellen, die unter mehr als 60% der Säule suspendieren. </li><li> Wechseln Sie zu Ernährung Lösung und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 400 &amp; mgr; l / h für die Zellkultur. </li><li> Wählen Beobachtungspositionen für das Mikroskop. HINWEIS: Für Lebensdauer Messungen wurden Bilder einmal mit einem 40x-Objektiv alle 15 min durch ein optisches Mikroskop aufgenommen. Für die fluoreszierende Reporter Analyse wurden Bilder, die einmal mit einem 60X Öl Ziel alle 15 min durch ein Fluoreszenzmikroskop entnommen. </li></ol>

<ol>
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Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+of+the+yeast+G1/S+switch.">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Das PDMS-Gerät muss frisch hergestellt werden. Andernfalls werden die Luftblasen, die durch Rohre in die Vorrichtung eingefügt schwer zu entfernen. Schritt 3.4 ist wichtig, um die Zellbeladungseffizienz zu verbessern, indem die Zellen konzentriert. Um den Durchsatz des Experimentes zu erhöhen, 4 bis 6-Module auf dem gleichen Chip verbunden PDMS unabhängig arbeitende Pumpen typischerweise verwendet werden, durchzuführen 4 bis 6 verschiedene Experimente (verschiedene Stämme oder Medienzusammensetzungen) gleichzeitig. Im Vergleich zu der herkömmlichen Hefe replikativen Alterungstest (die Mikrodissektion verwendet), die mikrofluidische hier vorgestellte Verfahren ist weniger arbeitsintensiv und zeitraubend. Darüber hinaus ermöglicht die Mikrofluidik-Vorrichtung für die detaillierte Quantifizierung der verschiedenen zellulären oder molekularer Parameter, einschließlich der Zellgröße, Zellzyklus-Dynamik, die Zellmorphologie und verschiedenen molekularen Marker. Dieses Mikrofluidik-Verfahren erreicht Langzeit Zelle mit dem hochauflösenden Mikroskopie Nachführung durch HaltMutterzellen unter PDMS Mikro-Pads als Tochterzellen werden automatisch gespült. Dieses Gerät verwendet weiche PDMS Mikro-Pads zu stoppen Mutterzellen 4 mit der Grundstruktur ähnlich, wie Huberts et al. in seinem Werk 7 beschrieben. Es gibt eine Reihe von Unterschieden in dem Gerätedesign und experimentelle Protokollen. Der breitere PDMS - Pad in diesem Gerät kann einige newborn Tochterzellen aufgefangen und analysiert (Figuren 2 und 3, Film 1) werden. Um solche Zellen zu identifizieren, wir kommentierten geknospt die Tochterzellen aus bereits gefangen Mutterzellen, die Tochterzellen zu ignorieren, die ohne Knospung weggespült. Im Durchschnitt, wir haben etwa 2 frische Mutterzellen pro PDMS-Pad. Das Verhältnis dieser frischen Mutterzellen zu den Zellen unbekannter Geschichte war etwa 1: 2, von denen etwa ein Drittel wurden in der Einrichtung für die gesamte Lebensdauer gehalten. Diese Zellen ermöglichen eine genauere Lebensdauer Messung eind macht es möglich, Korrelationen zwischen Mutter und Tochterzellen zu analysieren. In dieser Vorrichtung wird ein tieferer Hauptkanal an zwei flacheren Seitenkanälen verbunden, in dem die Beobachtungen gemacht werden; dieser Entwurf hilft, die Möglichkeit der Seitenkanäle zu reduzieren, indem große Luftblasen blockiert. Für mikrofluidischen Chip-Produktion verwendet dieses Protokoll auch ein einfaches Verfahren die PDMS und Deckglas zu binden, nur Plasma-Exposition mit und Backen im Ofen, die die Erfolgsquote erhöht. Bei diesem Protokoll ist die mikrofluidische Vorrichtung zu robust Falle mindestens eine Zelle (3-5 Zellen im Mittel) pro Lage PDMS - Pad zu Beginn des Experiments für den Wildtyp - haploide Hefestämme (dh BY4741 oder BY4742). Etwa 30% der Zellen in ihrer ganzen Lebensdauer beibehalten werden. Es ist erwähnenswert, dass die Leistung des PDMS Geräts auf dem Spaltmaß hängt zwischen den pensile Säulen und dem Glas und der Größe der Hefezellen. Für haploide Hefestämme Wildtyp, diegeeignete Größe für den Spalt ist 3,5-4,5 um auf. Außerhalb dieses Bereichs stark die Ladeeffizienz und Zellrückhalterate Rückgang. So wird neue Vorrichtungen für Hefestämme mit vielen größeren oder kleineren Zellgrößen 7 muss in Schritt 1 hergestellt durch Modifizierung der Höhe der ersten Schicht hergestellt werden. Zusammengefasst ist das Gerät und das Protokoll in diesem Artikel beschrieben wird, nicht nur für Hefe-Aging-Studien geeignet ist aber auch für andere Experimente, die die Verfolgung von Mutterzellen und die Überwachung von molekularen Markern für viele Generationen oder die ganze Lebensdauer erfordern.

Bäckerhefe ist ein leistungsfähiger Modellorganismus in der Altersforschung. Jedoch beruht eine herkömmliche Assay Lebensdauer in Hefe auf Mikrodissektion, was nicht nur arbeitsintensiv , sondern auch geringen Durchsatz gleich 1, 2. Darüber hinaus ist die traditionelle microdissection Ansatz bieten nicht eine detaillierte Ansicht der verschiedenen zellulären und molekularen Merkmalen in den einzelnen Mutterzellen, während sie altern. Die Entwicklung von Mikrofluidik - Vorrichtungen ist ein automatisiertes Verfahren zur Messung der Lebensdauer Hefe sowie zu folgen molekularen Marker und verschiedene zelluläre Phänotypen in der gesamten Lebensdauer der Mutterzellen 3, 4, 5, 6, 7, 8 freigegeben. Nach Hefezellen in eine Mikrofluidik-Vorrichtung geladen werden, können sie unter einem Mikroskop automatische zeit Runden unter Verwendung nachgeführte Bildgebung. Mit Hilfe von Bildverarbeitungswerkzeugen können verschiedene zelluläre und molekulare Phänotypen 3 extrahiert werden, 6, 8, einschließlich der Lebensdauer, Größe, Fluoreszenz - Reporter, Zellmorphologie, Zellzyklus - Dynamik usw., von denen viele schwer oder unmöglich zu erhalten ist unter Verwendung von die traditionellen Mikrodissektionsverfahren. Mikrofluidik - Vorrichtungen haben Prominenz in Hefe - Aging Forschung seit ihrer erfolgreichen Entwicklung gewonnen vor einigen Jahren 3, 4, 6, 7. Mehrere Gruppen haben auf Variationen der früheren Entwürfen 5 und viele Hefe - Labors haben mikrofluidischen Vorrichtungen anschließend veröffentlicht für ihre Studie beschäftigt. In einer Zellkultur exponentielles Wachstum erfährt, die Zahl der im Alter von Mutterzellen, die für die Beobachtung verfügbar sind, ist miniscule. Daher ist das allgemeine Konstruktionsprinzip der Mikrofluidik-Vorrichtung für Lebensdauer-Messungen Mutterzellen zu binden und Tochterzellen zu entfernen. Eine solche Konstruktionen machen Gebrauch von der Tatsache, dass Hefe Teilung asymmetrische Zelle unterzogen wird. Die Strukturen in dem Gerät Fall größere Mutterzellen und ermöglichen kleinere Tochterzellen weggespült werden. Der Mikrofluidik - Chip in diesem Artikel beschrieben ist, verwendet ein weiches Polydimethylsiloxan (PDMS) pad (vertikale pensile Spalten) abzufangen Mutterzellen (Abbildung 1). Geräte ähnlicher Bauart wurden bereits 3, 4, berichtet 6, 7. Dieses Protokoll verwendet ein einfacheres Verfahren mikrofluidischen Vorrichtungen herzustellen und eine einfache zellLadeVerfahren, die für die Zeitraffer-Imaging Experimente optimiert ist. Einer der wichtigsten Parameter in der Mikrofluidik-Vorrichtung ist die Breite der zu stoppen Mutterzellen verwendet PDMS-Pads. unsere device verwendet breitere Pads, die mehr Mutterzellen unter jedem Pad halten können, darunter ein großer Anteil der frischen Mutterzellen, die während ihrer gesamten Lebensdauer verfolgt werden können. Neben Lebensdauer Messungen ist dieses Protokoll für einzelne Zelle Zeitraffer-Imaging Experimente nützlich, wenn die Zellen während der gesamten Lebensdauer für viele Generationen oder wenn eine Beobachtung verfolgt werden müssen, ist notwendig.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3&#39;&#39; &#60;111&#62; silicon wafer</td>
			<td>Addison Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2000 and 3000 Series</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>ellsworth</td>
			<td>2065622</td>
			<td>Include Sylgard&#174; silicone elastomer base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-core&#8482; punch(I.D. 0.75 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&#174; cover glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>102440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M&#160; Scotch Tape</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>S-10223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURE ETHANOL, KOPTEC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHOOSH-DUSTER&#8482;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16650-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL BD Syringe (Luer-Lock&#8482;Tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company.</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028)</td>
			<td>COMPONENT SUPPLY COMPANY</td>
			<td>SWTT-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Assortment</td>
			<td>COMPONENT SUPPLY COMPANY</td>
			<td>NEKIT-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2238300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Oven</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>13246516GAQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Longerpump</td>
			<td>TS-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

Nach den Experimenten können die Lebensdauer der Zellen und viele zelluläre und molekulare Phänotypen aus den aufgezeichneten Zeitraffer-Bilder extrahiert werden. Da es eine Reihe von verschiedenen Funktionen, die von jeder Zelle entnommen werden kann, ist der erste Schritt der Analyse der Zellen und Ereignisse mit Anmerkungen zu versehen, einschließlich der Positionen und Grenzen der Zellen und dem Timing der verschiedenen Ereignisse, die verfolgt werden, wie beispiels wie die angehenden Ereignisse. Diese Annotationen werden es einfacher, auf den gleichen Satz von Zellen zurückzukehren und verschiedene Funktionen in der Zukunft zu analysieren. Unter Verwendung der aufgezeichneten Annotationen der Zellen unter Verwendung von Bildanalysesoftware, wie ImageJ 11 und dem zugehörigen Plugins kann eine Liste von Phänotypen dann aus den Bilddaten extrahiert werden. Im Folgenden sind einige Beispiele für mit der Mikrofluidik-Vorrichtung gemessen Phänotypen. Die Lebensdauer Phänotyp der Hefekann durch Zählen die Anzahl von Knospen von jeder eingeschlossenen Mutterzelle und die Schätzung mit der Kaplan-Meier-Schätzer erzeugt, erhalten werden. Die Zellen zunächst in den mikrofluidischen Vorrichtungen gefangen sind von unbekanntem Alter. Um die Vorspannung der Lebensdauer Messungen stammen von diesem unbekannten Alter, frühere Verfahren verwendet , um die durchschnittliche Anzahl von bud Narben auf den eingeschlossenen Zellen zu minimieren , die Lebensdauer 4, 7 zu kalibrieren. Jedoch erfordern bud scar Messungen die zusätzliche Färbung von Zellen und liefern nur eine indirekte Abschätzung der Vorspannung. Unter Verwendung dieses Protokolls einfängt das Gerät häufig frische Tochterzellen, die aus bereits gefangen Zellen geknospt ab. Diese Zellen werden dann wiederum in Mutterzellen. Solche Zellen können unter Verwendung unserer Downstream - Bildanalyse - Software (Movie 1) identifiziert werden. Diese frischen Mutterzellen eine genauere Lebensdauer Messung. Wie in Abbildung 2 gezeigt, waren die Lebensdauer Kurven von frischen Mutterzellen compadiejenigen der Zellen unbekannten Alters rot mit. In diesem Experiment war die durchschnittliche Lebensdauer der frischen Mutterzellen etwas länger (etwa 2 Generationen Unterschied in der medianen Lebensdauer). Zusätzlich zu der Anzahl von Knospen, anderen interessanten Phänotypen, wie beispielsweise das Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Ereignissen Knospung, wie in Figur 3 dargestellt ist , kann aus den Bilddaten 3, 7, 8 , extrahiert werden. Die Zellen in eine Phase von schnellen Austrieb folgenden ein paar langsameren Anfängen buddings. Die angehende verlangsamte dramatisch gegen Ende ihrer Lebensdauer, den ungesunden Zustand dieser im Alter von Zellen anzeigt. Die Zellzyklusdynamik enthält sehr nützliche Informationen über den zellulären Zustand der jungen und alten Zellen und verwendet worden, beispielsweise Telomerase - Mutanten 12 zu charakterisieren. Wichtig ist, dass dieses Gerät seinverwendete zum Messen von Fluoreszenzsignalen während der gesamten Lebensspanne (Abbildung 4), so dass für die Verfolgung von molekularen Markern , die der Fahrer des Alterungsprozesses sein können. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55412/55412fig1.jpg" /> Abbildung 1: Eine schematische Darstellung der Konstruktion der Mikrofluidik - Vorrichtung. Das Gerät besteht aus 6 unabhängigen Funktionsmodulen, die parallel arbeiten können. Jedes Modul besteht aus einem Hauptkanal verbunden ist, um zwei Seitenkanäle vorgenommen. Jeder Seitenkanal hat pensile 113 Spalten. Eine weitere Brücke ist in der Mitte hinzugefügt, um den Hauptkanal mit den beiden Seitenkanälen zu verbinden. Mutter-Zellen werden unter den pensile Säulen, während die kleineren Tochterzellen durch die Strömung weggespült werden gefangen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55412/55412fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55412/55412fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 2: Frische Mutterzellen länger leben als Zellen mit unbekannter Geschichte. Die replikative Lebensdauer von frischen Mutterzellen im Vergleich zu Zellen unbekannter Geschichte in SD-Medien, 30 Grade (Zellen vom Beginn des Experiments gefangen). Im Durchschnitt leben frische Mutterzellen etwa 2 Generationen länger. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55412/55412fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55412/55412fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55412/55412fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die Länge der gealterten Intervallen ändert als Zell Knospung. Angehende Abständen gemessen als Zeitrahmen zwischen buddings wurden farbcodiert, wurden die Zellen durch ihre Replikation Lebensdauer bestellt und frische Mutterzellen waren Septemberarated aus Zellen unbekannten Geschichte. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55412/55412fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55412/55412fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55412/55412fig4.jpg" /> Abbildung 4: Messung der Aktivität von Hitzeschockfaktor 1 (HSF1) einer Mikrofluidik - Vorrichtung verwendet. Die HSF1-Aktivität Reporter werden durch ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) fusionierte mit einem verkrüppelten CYC1 Promotor mit HSE Upstream 13 aufgebaut. Fluoreszenzbilder wurden alle 30 Minuten genommen. GFP Intensität wurde dann quantifiziert eine angepasste MATLAB - Code 14 verwendet wird . Die Datenpunkte für jede einzelne Zelle verbunden sind, und mit einer farbigen Linie angedeutet. In diesem Experiment wurde der Stamm in SD-Medium mit 2% Glucose (wt / vol) bei 30 ° C über Nacht wachsen gelassen; es wurde dann mit dem gleichen Medium für die Wiederherstellung verdünnt. Nachher,SD-Medium mit 0,05% Glucose (G / V) wurde verwendet, um Zellen in dem mikrofluidischen Chip während der Fluoreszenzmessung zu wachsen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55412/55412fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55412/55412fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55412/55412mov1.jpg" /> Film 1: Ein Beispiel für frische Mutterzellen innerhalb der Einrichtung für die gesamte Lebensdauer gefangen zu sein. Der Film zeigt eine frische Mutterzelle von einer gefangenen Zelle geboren. Der rote Pfeil am Anfang des Films markiert die Position der frischen Mutterzelle und ihren ersten Austrieb. Diese Mutterzelle wurde in der Mikrofluidik-Vorrichtung für seine gesamte Lebensdauer gefangen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55412/55412movie1.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55412/55412movie1.mov" target="_blank">dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download</a> bereit <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55412/55412movie1.mov" target="_blank">.)</a>

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Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Herstellung von Mikrofluidik-Chips und der Aufbau von mikrofluidischen Experimenten optimiert, um die Lebensdauer und zellulären Phänotypen einzelner Hefezellen zu messen.

Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.6K Aufrufe.  Peking University.  Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Herstellung von Mikrofluidik-Chips und der Aufbau von mikrofluidischen Experimenten optimiert, um die Lebensdauer und zellulären Phänotypen einzelner Hefezellen zu messen. 

Serie: Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Forschung

Biologie

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Messung der Lebensdauer in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

Groß Gene Knockdown in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwenden dsRNA Fütterung Bibliotheken zu Robust Loss-of-function Phänotypen generieren

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

Räumlich-zeitliche Analyse von zytokinetischen Events in Spalthefe

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...