Wir danken Mitglieder des Huse Lab um Rat und Hilfe. Unterstützt durch die US National Institutes of Health (R01-AI087644, m.h.) und P30-CA008748, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

1. Vorbereitung der stimulierende Glasflächen
<ol><li>Mantel acht Brunnen gekammert Deckglas mit biotinylierte Poly-L-Lysin (Bio-PLL) verdünnt 1: 500 in destilliertem, entionisiertem Wasser (DdH2O). Inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Waschen Sie mit H2O.</li>
	<li>Dry für 2 h bei RT.</li>
	<li>Block Bio-PLL beschichtete Oberflächen mit blockierenden Puffer (HEPES gepufferten Kochsalzlösung [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], mit 2 % BSA) für 30 min bei RT<ol>
<li>Lösen Sie 5 mg Poly-L-Lysin Hydrobromide in 1 mL 10 mM NaPO4, pH 8,5.</li>
		<li>Fügen Sie 125 μmol (0,55 mg) von NHS-Biotin hinzu (aus einer 100 mg/mL Brühe in DMSO) und überprüfen Sie den pH-Wert der Reaktion. Liegt der pH-Wert unter 8,5, fügen Sie 2 μL 4 N NaOH, um zwischen pH 8,5 und 9,5 zu erhöhen.</li>
		<li>Vortex für 30 Minuten.</li>
		<li>Die Reaktion mit 50 μL der 100 mM Glycin in 20 mM Tris pH 8.0 aufgelöst zu stillen.</li>
		<li>Bei voller Leistung für 10 min drehen und den überstand auf einen neuen Schlauch übertragen. Hinweis: Bio-PLL-Qualität ist in der Regel im Vergleich zu bisherigen Vorbereitungen durch Beschichtung zweifache Verdünnungsreihen des Materials auf einer 96-Well-ELISA-Platte und Quantifizierung von Biotin Inhalt nach Inkubation mit alkalischer Phosphatase Streptavidin gekoppelt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blockierende Puffer zu entfernen. Lassen Sie sich nicht Brunnen trocken. Fügen Sie Streptavidin (100 µg/mL in blocking-Puffer). 1 h bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie in HBS. Füllen Sie und invertieren Sie Kammer Folie Brunnen 4-5mal, HBS aus dem Brunnen zu entfernen. Lassen Sie sich nicht Brunnen trocken.</li>
	<li>Fügen Sie die biotinylierte pMHC Liganden und Adhäsionsmoleküle an die Oberfläche. Bemerkung: MCC und Eizellen kann Photocaged durch Zugabe von ortho-Nitrobenzyl Basis Schutzgruppen (z. B. Nitrophenylethyl (NPE) oder Nitroveratryloxycarbonyl (SVOC)) an die ε-Aminogruppe des wichtigsten Lysines (K12 im MCC, K7 in OVA). Photocaged MCC und OVA erhalten Sie von kommerziellen Anbietern. Nach der Rekonstitution in wässrigen Puffer sind sie in bakteriell ausgedrückt-Ek und H2-Kb mit etablierten Ansätzen11,12refolded.</li>
	<li>Validierung von Photoactivatable MCC oder Eizellen Peptid<ol>
<li>Decage Peptide SVOC-geschützt durch UV Bestrahlung mit einer UV-Lampe handheld (siehe Tabelle der Materialien) für 20 min bei RT</li>
		<li>Pulse 1.0 x 105 APCs mit 1 µM nonstimulatory Peptid (negative Kontrolle, z.B. Hb), unbestrahlten Photoactivatable Peptid, bestrahlten Photoactivatable Peptid und Agonist Peptid (Positivkontrolle, z.B., MCC) für 1 h bis über Nacht bei 37 ° C.</li>
		<li>Förderung der T-Zellen, die mit dem Ausdruck der 5 C. C7/2B4/und TCR, Verwendung CH12 oder CH27 B-Zellen. Um OT1 T-Zellen zu stimulieren, verwenden Sie RMA-s oder EL4 Thymom Zellen.</li>
		<li>Mischen Sie die gepulste APCs mit einer gleichen Anzahl von T-Zellen in 96-Well Runde Bodenplatten zu einem Endvolumen von 200 µL. Inkubation bei 37 ° C für 12-24 h.</li>
		<li>Die Überstände von jedes gut erholen und IL-2 von ELISA mit Streptavidin-Meerrettich Peroxidase farbmetrischen Erkennung zu analysieren. Hinweis: Bestätigung des festsetzende Status alle Peptide durch Electrospray Massenspektrometrie vor umfaltung in MHC-komplexe, wird dringend empfohlen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die Faltung und Reinigung der MHC Lichteinwirkung zu minimieren. Zum Beispiel Falten Reaktionen in Alufolie wickeln und Gel Filtration Chromatographie mit der UV-Lampe aus durchführen. Hinweis: Es hat sich herausgestellt, dass Photoactivatable MCC-I-Ek und OVA - H2-Kb induzieren UV-unabhängige T-Zell-Aktivierung in hoher Dichte, möglicherweise aufgrund von unvollständigen funktionellen Käfighaltung. Daher wird die Photoactivatable pMHC in einer 10-30 X Überschreitung des nonstimulatory pMHC (z. B. -Ek , enthalten das Hämoglobin64-76 Peptid (Hb)) während der Ruhigstellung Schritt verdünnt. Dies verbessert das Signal Rauschabstand des nachfolgenden bildgebenden Experiments.</li>
	<li>Zu Photoactivate CD4+ T Zellen, gemeinsam verwenden eine Mischung aus biotinylierte Hb-I-Ek (3 µg/mL), biotinylierte Photoactivatable MCC-I-E-k (0,1 µg/mL) und biotinylierte Antikörper gegen die Klasse ich MHC H2-Kk (0,5 µg / mL). der Antikörper Anti-H2-Kk fördert 5 C. C7/2B4/und T-Zellen, die H2-Kk, um auf die Glasoberfläche zu verbreiten, ohne Aktivierung zum Ausdruck bringen.</li>
	<li>Für CD8+ T Zellen, verwenden Sie eine Mischung aus biotinylierte H2-Db trägt das Peptid KAVYDFATL (1 µg/mL), biotinylierte Photoactivatable OVA-H2-Kb (0,1 µg/mL), und der extrazellulären Domäne des das Adhäsionsmolekül ICAM-1 (2 µg/mL produziert von Insekten Zelle Kultur13). Die ICAM-1 fördert enge Kontakt Bildung durch die Gewinnung der Integrin LFA1 auf der T-Zell-Oberfläche.</li>
	<li>Gelten Sie alle Protein-Mischungen in blockierende Puffer, gefolgt von Inkubation für 1 h bei RT oder mindestens 2 h bei 4 ° C. Hinweis: Die molekulare Dichte auf Oberflächen dieser Art zu ~ 8000 pro µm2 wurde zuvor ermittelte6. Da die Photoactivatable pMHC ~1/30 darstellt werdenth biotinylierte Protein auf der Oberfläche, seine Dichte ~ 267 Moleküle pro µm2, vor decaging.</li>
	<li>Waschen Sie wie in Schritt 1.6 und in HBS erst unmittelbar vor Gebrauch.</li>
	<li>Fügen Sie 200.000 CD4+ oder CD8+ T Zellen, mit dem Ausdruck der entsprechenden TCR in jede Vertiefung und lassen Zellen bei 37 ° C für 15 min einhalten. Sobald Zellen befestigt und auf der Fläche verteilt haben, sind sie bereit für photoaktivierungen und Imaging. Hinweis: Retrovirale Transduktion von T-Effektorzellen mit fluoreszierenden bildgebende Sonden wird im Detail Elswhere6,7beschrieben. Kalzium-Signalisierung kann auch mit untransduced T-Zellen geladen mit dem Kalzium sensibler Farbstoff Fluo-46untersucht werden. Der ratiometrischen Farbstoff Fura-2 ist nicht empfehlenswert, weil es Erregung im UV-Bereich erfordert, die auch induziert decaging von Photoactivatable pMHC.</li>
</ol>2. die Bildaufnahme
<ol><li>Verwenden Sie einem inversen TIRF-Mikroskop mit einem UV kompatibel 150 X Objektiv für die Bildaufnahme ausgestattet. UV bestrahlen benutzerdefinierte Regionen mit einer digitalen Membran-System angeschlossen, um ein 100 W-Quecksilber-Lampe (HBO). Direkte UV-Licht von dieser Lampe auf die Probe mit einem 400 nm langen Pass Spiegel.</li>
	<li>Verwenden Sie Bildanalyse-Software für lokalisierte photoaktivierungen und Zeitraffer Erwerb. In den meisten Experimenten überwachen Sonden in den grünen und roten Kanälen mit 488 nm und 561 nm Anregung Laser, beziehungsweise. Laserlicht ist gerichtet auf die Probe mit einem Dual-Bandpass dichroitischen Spiegel, der auch im UV-Bereich (um decaging ermöglichen) überträgt. Weitere Informationen auf mikroskopkonfiguration finden Sie in der Tabelle der Werkstoffe und Abbildung 6 .</li>
	<li>Passen Sie nach der Montage der Kammer-Folie mit der T-Zellen Einstellungen an, um TIRF oder Epifluoreszenz-Beleuchtung, wie nötig zu erhalten. Wählen Sie im live-Modus einen Bereich von Zellen, die die fluoreszierenden Wortanzahl von Interesse zum Ausdruck bringen. Mikron-Skala Regionen für photoaktivierungen unter Einzelzellen mit Softwaresteuerung zu etablieren.</li>
	<li>Beginnen Sie Time-Lapse Erwerb. In der Regel 80 Zeitpunkten erworben werden, mit einem Intervall von 5 s zwischen jeden Zeitpunkt. Somit bleibt mehr als genug Zeit für sequentielle 488 nm und 563 nm Expositionen bei dual Farbe Experimente.</li>
	<li>Nach 10 Zeitpunkte, Photoactivate die ausgewählten Regionen durch Öffnen der digitalen Membran für 1-1.5 s Verschlusszeit.</li>
	<li>Nachdem die Zeitspanne abgeschlossen ist, wählen Sie ein neues Feld der Zellen, und wiederholen Sie den Vorgang.</li>
</ol>(3) Datenanalyse
Hinweis: Lokalisierte photoaktivierungen immobilisierten Liganden erstellt eine wohldefinierte, stationäre stimulierende Region, die für Quantitative Analyse der Signalisierung Antworten und Zytoskeletts umgestaltet Veranstaltungen verwendet werden kann. Analyse Protokolle in der Regel beinhalten, Quantifizierung der Fluoreszenzintensität innerhalb der bestrahlten Region oder über der bestrahlten Region als positionelle Endpunkt für Distanzmessungen (zB. für die Beurteilung der Polarisation des Centrosome, die bestrahlten Region). Beide Analyseprotokolle sind nachfolgend beschrieben. Verschiedene interaktive Analyse Bildprogramme können verwendet werden, um Intensität und Abstandsmessungen, dann Ausgang zur weiteren Verarbeitung und Analyse werden kann.
<ol><li>
Fluoreszenzintensität
	<ol>
<li>Bestimmen der Fluoreszenzintensität (FI) einer Hintergrund-Region außerhalb der Zelle (FIb). Dies wird für die Hintergrundkorrektur verwendet werden.<ol>
<li>Zeichnen Sie einen Mikrometer großen quadratischen Bereich außerhalb der Zelle und machen Sie eine Maske zu. Um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, klicken Sie auf analysieren | Maske Statistik. Wählen Sie Meine Fluoreszenzintensität und exportieren Sie die Werte. Hinweis: Modalitäten (z.B. 3.1.1.1) beziehen sich auf Slidebook Software (siehe Tabelle der Materialien). Durchführung dieses Protokolls mit anderen Software-Paketen (zB., Fidschi) etwas anders.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Die FI in der photoaktiviert Region für jeden Zeitpunkt zu bestimmen.<ol>
<li>Wählen Sie die Maske um den Bereich zu markieren, der photoaktiviert war. Um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, klicken Sie auf analysieren | Maske Statistik. Wählen Sie Meine Fluoreszenzintensität und exportieren Sie die Werte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Subtrahieren Sie den Hintergrund FI aus den Messwerten der FI in der Region. Dann die korrigierte FI Messungen geteilt durch die durchschnittliche normalisieren, Hintergrund korrigiert FI die ersten 9 Frames vor photoaktivierungen. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). Hinweis: Graph ΔF/F als Funktion der Zeit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Entfernung
	<ol>
<li>Rufen Sie die x und y Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region.<ol>
<li>Zu bestimmen, die x und y Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region, wählen Sie Maske um den Bereich zu markieren, die photoaktiviert war. Sobald die Region des photoaktivierungen markiert ist, wählen Sie analysieren | Statistiken zu maskieren | Der Mittelbereich und exportieren Sie die Werte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bestimmen die x- und y-Koordinaten für die fluoreszierenden Sonde von Interesse für jeden Zeitpunkt. Dies geschieht in der Regel durch manuelle oder automatisierte Teilchen verfolgen.<ol>
<li>Zu bestimmen, die x und y Koordinaten der fluoreszierenden Sonde von Interesse, wählen Sie Manuell Particle Tracking und klicken Sie auf die fluoreszierende Sonde von Interesse im Laufe der Zeit. Sobald alle Zeitpunkte verfolgt haben, wählen Sie analysieren | Statistiken zu maskieren | Der Mittelbereich und exportieren Sie die Werte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Berechnen Sie den Abstand zwischen den fluoreszierenden Proteins des Interesses und der Mitte der photoaktiviert Region für jeden Zeitpunkt unter Verwendung der Gleichung: Abstand = √ ((x2- X1)2+ (y2-y1)2), die x2 und y sind2 die Koordinaten des fluoreszierenden Proteins von Interesse und X1 und y1 die Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region.</li>
		<li>Diagramm der Abstand als Funktion der Zeit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse.">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).</li><li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Synapse+Formation:+Cell+Polarity+During+T+Cell-APC+Interaction.">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In den letzten Jahren hat Licht als ein ausgezeichnetes Werkzeug für raumzeitlich kontrollierte Aktivierung von zellulären Prozessen entstanden. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, jede mit damit verbundenen vor- und Nachteile. Das System hier beschrieben wird, die auf die decaging von immobilisierten, extrazellulären Liganden, eignet sich besonders für die Analyse von rapid, subzelluläre, polarisierte Signalisierung Antworten. Dieser Ansatz wurde angewandt, um IS Bildung in T-Zellen wie oben beschrieben zu untersuchen. Darüber hinaus wurden eingesperrte Liganden für andere Rezeptoren entwickelt, so dass wir die gleiche Strategie zur Beurteilung hemmenden Signalisierung in natürlichen töten Zellen und nukleare Translokation des Transkriptionsfaktors NF-κB Reaktion wie Rezeptor Maut gelten, 14,15-Signalisierung.
In diesem Protokoll sind stimulierende Liganden immobilisiert, um sicherzustellen, dass sie als stationäre, polarisierte Quelle der Anregung für die Dauer des imaging-Experiments bleiben. Dieser Ansatz eignet sich gut für Studien der Zelle Polarisation. Anzumerken ist jedoch, dass der TCR photoaktivierungen Ansatz für zeitlich gesteuerten T-Zell-Aktivierung auf unterstützten Lipid Bilayer leicht angepasst. Natürlich kann eine nachhaltige, polarisierte Stimulation in diesem Zusammenhang nicht erreichen. Dies ist unnötig, möglicherweise jedoch in Anbetracht der experimentellen Ziele.
Das System ist auch sehr flexibel in Bezug auf die UV-Lichtquelle für decaging. Derzeit ist eine 100 W Hg-Lampe für gezielte Beleuchtung verwendet, jedoch ein gepulste Stickstoff-Laser (Puls Breite 4 ns, Puls Energie 120 mJ), war zuvor verwendeten6. Manchmal handheld UV-Licht (365 nm, 4 W) wurde über die bildgebenden Probe um größere Regionen Photostimulatable Liganden decage positioniert. Die Besonderheiten des decaging Systems hängt jeweils von den technischen Anforderungen des Experiments in Frage.
Wenn Sie dieses System zu implementieren, ist es wichtig zu bestätigen, dass die beobachteten Reaktionen spezifisch für das photoaktivierungen-Ereignis und nicht das Ergebnis der falschen Rezeptor-Aktivierung oder UV-induzierten lichtbedingten sind. Um diese Artefakte auszuschließen, können zwei Spezifität Kontrollen durchgeführt werden. Erstens kann Fluoreszenzintensität im Zellen, die nicht direkt bei photoaktivierungen Experimenten bestrahlt werden überwacht werden. Wenn die Oberfläche richtig eingesperrt, nennenswerter Antworten in diesen Zellen nicht (z. B. Abbildung 5) hinzuweisen. Zweitens können Experimente, in denen, die t Zellen sind UV-Bestrahlung auf Oberflächen fehlt Photoactivatable Liganden, durchgeführt werden. Dieses Steuerelement ist entscheidend für die Ermittlung der UV-induzierten Effekte, die unabhängig von Photoactivatable Liganden (z. B. siehe Referenz 6). Während der Systemoptimierung ist es auch äußerst hilfreich, um eine robuste zelluläre Bildgebung Reaktion (z. B. Grb2-GFP Rekrutierung) zur hand zu haben, die schnell und lokalisiert ist. Beurteilung der Zusammenhänge zwischen Signal- und photoaktivierungen ist viel einfacher, wenn diese Ereignisse raumzeitlich proximal zu Stimulation der Rezeptoren sind.
Obwohl der photoaktivierungen-Ansatz exquisite räumlich-zeitliche Kontrolle über Rezeptor bietet-Signalisierung, fehlt es die Anpassungsfähigkeit, die gebotene transfectable optogenetische Systeme16,17,18,19 ,20,21,22. Bestimmte optogenetische-Proteine sind auch Photoreversible, die bedingte Kontrolle, die nicht mit der photoaktivierungen der hier beschriebene Ansatz zur Verfügung steht. In optogenetische Systemen ist jedoch einschränkend die Diffusion von photoaktiviert Proteinen technisch anspruchsvoll. Dies erschwert die Analyse der polarisierten Signaltechnik, besonders in einem subzelluläre Kontext.
Man sollte auch beachten, dass die ansprechende Einheit dieses photoaktivierungen Systems einer Glasoberfläche, die alle Aspekte einer gutgläubigen Zell-Zell-Interaktion rekapitulieren kann nicht. Um dieses Problem zu umgehen und gleichzeitig die räumlich-zeitliche Kontrolle der Signal-Initiation, haben Ermittler ein optischen Falle verwendet um eine APC in Kontakt mit einer T-Zelle, so dass für den Beginn des Zytoskeletts Umgestaltungen und IS Reifung zu bringen in Echtzeit23visualisiert. Obwohl dieses System ermöglicht die präzise Einleitung und Visualisierung des Zytoskeletts Dynamics mit einer tatsächlichen APC, es ist relativ geringen Durchsatz und ist nicht kompatibel mit TIRF-Beleuchtung, die Bildqualität beeinträchtigt.
Abschließend bietet die in diesem Protokoll beschriebene Methode räumlich-zeitliche Steuerung der TCR-induzierte Signal innerhalb der T-Zelle, so dass letztlich für die Aufklärung der schnell biochemischen Veränderungen nach TCR Aktivierung. Dieses System bietet uns ein Mittel, um besser zu verstehen, wie die Signalisierung Ereignisse nach Aktivierung der TCR T-Zell-Polarisation, ist Bildung und letztlich die Lieferung der Effektor Antworten zu fördern.

T-Lymphozyten (T-Zellen) spielen eine zentrale Rolle in der zellulären Immunität durch das erkennen Antigene Peptide, die im Rahmen der Zelloberfläche MHC angezeigt. Antigen-Anerkennung, die durch die TCR vermittelt wird, treibt die Differenzierung der naiven T-Zellen und fördert die Lieferung der Zytolyse und kommunikative Reaktionen der Effektor Populationen. TCR Engagement induziert auch dramatische Veränderungen in der zellulären Architektur. Innerhalb von Minuten die T-Zellen gloms auf der Seite der Antigen-präsentierenden Zelle (APC), bilden eine polarisierte Schnittstelle bekannt als der immunologischen Synapse (IS)1,2. Der IS potenziert T-Zell-Effektor-Reaktionen durch die Aktivierung der direktionalen Freisetzung von Zytokinen oder, im Falle von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs), lytische Proteine, die die APC zerstören.
TCR Engagement von pMHC induziert die schnelle Phosphorylierung mehrere nachgeschaltete Adapter Moleküle, einschließlich Linker für die Aktivierung von T-Zellen (LAT), die letztlich fördert robuste Umgestaltung der synaptischen cytoskelett2. Kortikale filamentösen Aktin (F-Aktin) treibt T Zelle auf der APC-Oberfläche verteilt und löst sich dann in eine ringförmige Struktur zeichnet sich durch F-Aktin-Ansammlung an der Peripherie IS und Erschöpfung von der Mitte. F-Aktin Ringbildung ist eng an die Neuausrichtung der Mikrotubuli organisierenden Zentrum (MTOC, auch genannt die Centrosome in T-Zellen) an eine Position unterhalb der Mitte der Schnittstelle gekoppelt. Beide Veranstaltungen auftreten innerhalb von Minuten der erste Antigen-Anerkennung und den architektonischen Kontext, in dem nachfolgenden Aktivierung Veranstaltungen, den und Effektor Reaktionen auftreten, zu etablieren.
Um IS Bildung zu untersuchen, haben verschiedene Labors Ansätze entwickelt, in denen die APC durch eine Glasoberfläche, die ersetzt wird entweder immobilisierte Liganden TCR enthält oder ein Lipid Bilayer unterstützt, dass selbst die Liganden3,4enthält. T-Zellen bilden IS-ähnliche Kontakte auf diesen Flächen, die durch Totalreflexion Fluoreszenzmikroskop (TIRF) oder konfokalen Mikroskopie, hochauflösende Studien der frühen T-Zellaktivierung und IS Bildung abgebildet werden können.
Obwohl diese Ansätze für ausgezeichnete Visualisierung des fertig montierten IS erlaubt haben, tritt ein Großteil der Signalisierung folgende TCR:pMHC Ligatur innerhalb von Sekunden, erschweren die Bemühungen um die Abfolge der Ereignisse nach TCR Aktivierung genau bestimmen . Um dieses Problem zu umgehen, wurde ein photoaktivierungen Konzept entwickelt, in denen verwendet wird Photoactivatable pMHC, räumlich-zeitliche Kontrolle der TCR Aktivierung5,6,7zu erreichen. In diesem System sind T-Zellen Glasflächen mit Photoactivatable pMHC, die nicht-stimulierende, TCR bis Bestrahlung mit ultraviolettem (UV) Licht ist beigefügt. UV-Bestrahlung ein Mikrometer großen Bereich der Oberfläche unter der T-Zelle entfernt die Photocage schaffen eine anregende Zone, die von der T-Zellen erkannt werden kann. Ereignisse nach dem Bilanzstichtag Signalisierung und Zytoskeletts Umbau werden dann durch genetisch codierte fluoreszierende Reporter überwacht. Zwei Photoactivatable Versionen von Antigenen Peptide, Motte Cytochrom C88-103 (MCC) und Ovalbumin257-264 (OVA), die im Zusammenhang mit der Klasse II MHC-Ek und die Klasse ich MHC H2-Kb, bzw. vorgestellt werden, wurden entwickelt (Abbildung 1). Dies ermöglicht die Analyse der beiden CD4+ T-Zellen spezifisch für MCC-I-E-k (mit dem Ausdruck der 5 C. C7, 2B4, oder AND TCR) und CD8+ T-Zellen spezifisch für OVA-H2-Kb (mit dem Ausdruck der OT1 TCR).
Im letzten Jahrzehnt ist der TCR photoaktivierungen und Imaging-Ansatz, die präzise Kinetik der frühen TCR Signalisierung Schritte zu etablieren und zu identifizieren, die molekulare Wege polarisiert Zellskelett Umbau5, EZB verwendet worden 6 , 7 , 8 , 9 , 10. beispielsweise der Test war maßgeblich bei der Bestimmung, dass Centrosome Neuorientierung in Richtung der APC wird durch eine lokalisierte Steigung von Lipid zweite Bote Diacylglycerol zentriert auf den IS vermittelt. Es wird erwartet, dass diese Methodik wird weiterhin wertvoll für Anwendungen, die hochauflösenden bildgebenden Analyse des T-Zellfunktion zu fordern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1152">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155361</td>
			<td style="width:443px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">20217</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td>Will be used to biotinylate proteins</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated Hb I-EK&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-MCC I-EK&#160;</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated &#945;H2-Kk antibody</td>
			<td style="width:211px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-OVA H2-Kb</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated KAVY H2-Db&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated ICAM1&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Hand held UV lamp</td>
			<td style="width:211px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">UVGL-25</td>
			<td>Lamp is held &#60; 1 cm from the sample.&#160; 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Olympus IX-81 OMAC TIRF system.</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Additional information about the imaging system can be found in Figure 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Mosaic digital diaphragm</td>
			<td style="width:211px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:379px;">Slidebook software</td>
			<td style="width:211px;">Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial and temporal control of t cell activation using a photoactivatable agonist

T-Lymphozyten engagieren sich in schnellen, polarisierte Signale, tritt innerhalb von Minuten nach der Aktivierung des TCR. Dies induziert Bildung der immunologischen Synapse, eine stereotype Zell-Zell-Kreuzung, die T-Zell-Aktivierung reguliert und direktional richtet sich an Effektor Antworten. Um diese Prozesse effektiv zu studieren, ist ein bildgebender Ansatz, der zugeschnitten ist zur Erfassung schneller, polarisierter Antworten notwendig. Dieses Protokoll beschreibt ein solches System, basiert auf einer Photoactivatable Peptid-Major Histocompatibility complex (pMHC), das nicht-stimulierende bis UV-Licht ausgesetzt ist. Gezielte decaging von diesem Reagens während Videomicroscopy Experimente ermöglicht präzise räumlich-zeitliche Steuerung der TCR-Aktivierung und hochauflösende Überwachung der anschließende zelluläre Reaktionen der Totalreflexion (TIRF) imaging. Dieser Ansatz ist auch kompatibel mit genetischen und pharmakologischen Störung Strategien. Dies ermöglicht die Montage von klar definierten Molekulare Signalwege, die TCR-Signalisierung link zur Bildung der polarisierten Zellskelett Strukturen, die die immunologische Synapse zugrunde liegen.

Der photoaktivierungen und Imaging Ansatz ermöglicht für Beobachtung und einfache Quantifizierung von rapid, polarisierte Signalisierung Antworten. Um seine Fähigkeiten, reproduziert zu illustrieren hier ist ein Experiment, die räumlich-zeitliche Korrelation zwischen TCR-induzierte DAG Akkumulation und Centrosome Neuorientierung zu prüfen. 5 C. C7 T Zelle Blasten waren retrovirally mit zwei Leuchtstoffröhren Reporter ausgestrahlt: ein DAG-Biosensor mit Tandem-C1-Domänen von Proteinkinase C-θ in Verbindung mit GFP (C1-GFP) und RFP-Tubulin, das Centrosome zu überwachen. Die T-Zellen wurden dann gekammerten Deckglas mit Photoactivatable MCC-I-Ekangebracht. C1-GFP wurde abgebildet mit TIRF-Mikroskopie und RFP-Tubulin in Epifluoreszenz-Modus. Wie in Abbildung 2gezeigt, induziert lokalisierte photoaktivierungen der Fläche unter dem T-Zell die Ansammlung von DAG in der verstrahlten Zone. Dies folgt innerhalb von Sekunden die Neuausrichtung der Centrosome in der gleichen Region.
C1-GFP Ansammlung kann quantifiziert werden, durch die Berechnung der normierten Fluoreszenzintensität nach Hintergrundkorrektur, in der Mitte der photoaktiviert Region im Laufe der Zeit (Abbildung 3). Centrosome Neuausrichtung als Reaktion auf photoaktivierungen kann durch die Berechnung der Entfernung zwischen dem Centrosome und dem Zentrum der photoaktiviert Region als Funktion der Zeit (Abbildung 4) quantifiziert werden.
Diese Methode kann verwendet werden, um eine breite Palette von schnellen, polarisierte Signalisierung Antworten im Wesentlichen alles untersuchen, die mit einer fluoreszierenden Sonde überwacht werden können. Z. B. TCR photoaktivierungen wird genutzt, um frühe Signalisierung Microcluster-Anordnung mit Gewebekulturen beschrifteten Grb2 überwachen (Grb2-GLP) (Abbildung 5). Ähnlich wie bei der DAG-Ansammlung und Centrosome Neuausrichtung Antworten, Grb2-GFP Polarisation tritt kurz nach photoaktivierungen (Abbildung 5) und mit dem normalisierten Fluoreszenz-Intensität-Ansatz quantifiziert werden kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig1.jpg"> Abbildung 1: Photoaktivierungen System mit Photocaged MCC Peptid. (A) Photocaged Strategie für MCC-Peptid. Eine Gruppe der NPE ist Lysin Rückstände des MCC Peptids beigefügt. UV-Bestrahlung führt das Entfernen der NPE, Wiederherstellung von MCC in gediegener Form. (B) bei der NPE ist verpflichtet, MCC, die 5 C. C7 TCR kann nicht an MCC gebunden. Entfernung von NPE führt in Anerkennung der 5 C. C7 TCR native MCC-Peptid. (C) die Photocaged-Strategie wurde angepasst, um die Arbeit mit CD8 + T-Zellen, in denen Photocaged OVA Peptid verwendet wird, um die OT-1 TCR auf UV-Bestrahlung zu aktivieren.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig2.jpg"> Abbildung 2: Time-Lapse Montage von DAG Anhäufung und Centrosome Neuausrichtung nach photoaktivierungen des TCR in 5 C. C7 T Zelle. 5 C. C7-Zelle mit dem Ausdruck einer DAG Biosensor, mit Tandem C1-Domänen von PKC-GLP (C1-GFP) und Tag-RFP Tubulin (RFP-Wanne), fluoreszierenden Reporter für die Centrosome verschmolzen. Die Montagen illustrieren die polarisierte Reaktion der 5 C. C7-T-Zellen im Laufe der Zeit. Die gelben Oval und Text angeben, Zeit und Ort des photoaktivierungen. Im Laufe der Zeit sammelt sich C1-GLP in der photoaktiviert-Region, gefolgt von Centrosome Umorientierung auf der photoaktiviert-Region. Maßstab: 10 µm.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig3.jpg"> Abbildung 3: Quantifizierung der DAG Akkumulation in der photoaktiviert-region DAG, C1-GFP, Akkumulation in der photoaktiviert Region (links) kann durch die Berechnung der normierten Fluoreszenzintensität nach Untergrundkorrektur in der photoaktiviert Region (gelber Kreis mit blau schattiert) im Laufe der Zeit quantifiziert werden. Daten sind im Verhältnis zu den neun Frames erhalten kurz vor photoaktivierungen normalisiert. C1-GFP-Anreicherung in der photoaktiviert-Region kann durch die Arbeitsteilung der mittlere Fluoreszenzintensität der bestrahlten Region durch die mittlere Fluoreszenzintensität der gesamten Zelle, nach Untergrundkorrektur berechnet werden. Die Gleichung: ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)), in denen FI ist die mittlere Fluoreszenzintensität, kann verwendet werden, um die normierte Fluoreszenzintensität zu berechnen. Der normalisierte Fluoreszenzintensität an der photoaktiviert-Region kann dann als Funktion der Zeit (rechts) dargestellt werden. Violette Linie zeigt die Zeit des photoaktivierungen. Maßstab: 10 µm.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig4.jpg"> Abbildung 4: Quantifizierung der Centrosome Neuorientierung. Bestimmen Sie die Koordinaten des Centrosome (RFP-Wanne) im Laufe der Zeit, indem Sie manuell verfolgen den Centrosome Weg in der photoaktiviert Region (weißer Pfeil) zu jedem Zeitpunkt (links). Bestimmen Sie die Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region (gelber Kreis). Der Abstand zwischen den Centrosome und das Zentrum der photoaktiviert Region kann zu jedem Zeitpunkt unter Verwendung der Gleichung für die Ferne berechnet = √ ((x2- X1)2+ (y2-y1)2), in dem x2 und y 2 sind die x und y-Koordinaten für den Mittelpunkt des Bereichs von der Centrosome und x1 und y1 X und y Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region. Der Abstand von der Centrosome aus der Mitte der photoaktiviert Region zu jeder Zeit Punkt kann dann als Funktion der Zeit (rechts) dargestellt werden. Violette Linie zeigt die Zeit des photoaktivierungen. Maßstab: 10 µm.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig5.jpg"> Abbildung 5: Grb2-GFP Microcluster Bildung. (A) Vertreter 5 C. C7-Zelle mit dem Ausdruck eindringmittel mit der Bezeichnung Grb2 (Grb2-GLP). Die Montagen illustrieren die polarisierte Reaktion des Grb2-GFP Überstunden. Die gelben Oval und Text angeben, Zeit und Ort des photoaktivierungen. Im Laufe der Zeit sammelt sich Grb2-GLP auf der photoaktiviert-Region. (B) Quantifizierung des Grb2-GFP Fluoreszenzintensität an der photoaktiviert-Region im Laufe der Zeit. N = 15 Zellen. (C) Quantifizierung des Grb2-GFP Fluoreszenzintensität in einer Kontrollregion außerhalb der photoaktiviert Zone. N = 15 Zellen.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig6.jpg"> Abbildung 6: Mikroskopkonfiguration für photoaktivierungen und TIRF Imaging. 488 nm und 561 nm Laser dienen für TIRF und Epifluoreszenz Imaging von grünen und roten Sonden, beziehungsweise. UV-Licht zur photoaktivierungen stammt von Quecksilber (Hg) Lampe an eine digitale Membran-System, das leuchtende kleine, frei definierbaren Regionen angeschlossen. Licht von der Hg-Lampe/Membran auf die Probe, indem ein langpass-Spiegel unterhalb der dichroitischen Spiegel, der die bildgebenden Laser reflektiert, wider. Die dichroitische Spiegel muss entworfen werden, UV Licht weiterzugeben. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56655/56655fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Räumliche und zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung mit Hilfe einer Photoactivatable-Agonist

Dieses Protokoll beschreibt eine Imaging-basierte Methode zur Aktivierung der T-Lymphozyten mit Photoactivatable Peptid-MHC, ermöglicht präzise räumlich-zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung.

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.2K Aufrufe.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Dieses Protokoll beschreibt eine Imaging-basierte Methode zur Aktivierung der T-Lymphozyten mit Photoactivatable Peptid-MHC, ermöglicht präzise räumlich-zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung.

Serie: Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Künstliche Antigen-präsentierenden Zelle (AAPC) vermittelte Aktivierung und Expansion der Natural Killer-T-Zellen

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

Hochmultiplexed, Super-Auflösung Bildgebung von T-Zellen mit madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...