Biz üye Huse laboratuarının tavsiye ve yardım için teşekkür ederim. ABD Ulusal Sağlık (M.H. için R01-AI087644) ve P30-CA008748 Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi için Enstitüleri tarafından desteklenen.

1. uyarıcı cam yüzeylerin hazırlanması
<ol><li>Kat 8-şey odalı coverglass biotinylated Poli-L-lizin (Bio-PLL) ile 1:500 distile, deiyonize su (GKD2O) seyreltilmiş. (RT) oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>H2ile O. yıkama</li>
	<li>Kuru RT. 2 h için</li>
	<li>Blok biyo-PLL yüzeyler RT., 30 dk için engelleme arabellek (HEPES arabelleğe alınmış serum [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], %2 BSA) ile kaplı<ol>
<li>Poli-L-lizin hydrobromide 10 mM NaPO4, pH 8,5 1 ml 5 mg geçiyoruz.</li>
		<li>125 μmol (0.55 mg) NHS-biotin (DMSO 100 mg/mL stokta) ekleyin ve reaksiyon pH kontrol edin. PH 8,5 altında ise 4 N NaOH pH 8,5 ve 9.5 arasında yükseltmek için 2 μL ekleyin.</li>
		<li>30 dk için girdap.</li>
		<li>20 mM Tris pH 8.0 çözünmüş 100 mM glisin 50 μL ile reaksiyon gidermek.</li>
		<li>Tam güç 10 min için spin ve süpernatant aktarmak için yeni bir tüp. Not: Bio-PLL kalitesi genellikle seri iki kat dilutions bir 96-Peki ELISA plaka üzerine malzemenin kaplama ve streptavidin kuluçka alkalen fosfataz ile birleştiğinde sonra biotin içerik miktarının önceki hazırlıklar için karşılaştırılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Engelleme arabellek kaldırın. Kuyu kuru izin vermez. Streptavidin (100 µg/mL engelleme arabelleği) ekleyin. 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
	<li>HBS içinde yıkayın. Doldurun ve HBS kuyulardan kaldırma odası slayt wells 4 - 5 kez, tersine çevirin. Kuyu kuru izin vermez.</li>
	<li>Biotinylated pMHC ligandlar ve adezyon molekülleri için yüzey ekleyin. Not: MCC ve OVA Orto-nitrobenzyl ekleyerek photocaged koruma grupları (Örneğin, nitrophenylethyl (NPE) veya nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) anahtar lysines ε-amino grubuna bağlı olabilir (mm, K7 OVA içinde K12). Photocaged mm ve OVA ticari satıcılardan temin edilebilir. Sulu tampon rekonstitüsyon sonra bacterially ifade-Ek ve kurulan yaklaşımlar11,12kullanarak H2-Kb refolded.</li>
	<li>Photoactivatable mm ya da OVA peptid doğrulama<ol>
<li>NVOC korumalı peptidler el bir UV lamba ile UV irradiating tarafından decage ( Tablo malzemelerigörmek) RT., 20 dk</li>
		<li>1 h için nabız 1.0 x 105 ZPT nonstimulatory peptid (negatif kontrol, örneğin Hb), 1 µM ile unirradiated photoactivatable peptid, radyoaktif photoactivatable peptid ve agonist peptid (pozitif kontrolü, örneğin, mm) 37 ° C'de bir gecede</li>
		<li>5 C. ifade T hücreleri uyarmak için C7/2B4/ve TCR, CH12 veya CH27 B hücre kullanın. OT1 T hücreleri uyarmak için RMA-s veya EL4 Timoma hücreleri kullanmak.</li>
		<li>T hücrelerinde eşit sayıda pulsed ZPT karıştırın 96-şey yuvarlak alt plaka 200 son ses seviyesinde µL. 12-24 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Supernatants her kuyudan kurtarmak ve IL-2 tarafından ELISA streptavidin horseradish peroksidaz Renkölçer algılama ile analiz. Not: Tüm peptidler tarafından electrospray kütle spektrometresi MHC kompleksi refolding önce caging durumunu teyit şiddetle tavsiye edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Katlama ve arıtma MHC ışığa maruz kalma en aza indirmek için gerçekleştirin. Örneğin, alüminyum folyo reaksiyonlar katlama sarın ve UV lambalı jel filtrasyon Kromatografi taşımak. Not: Bu photoactivatable mm-ben-Ek bulundu oldu ve OVA - H2-Kb neden UV bağımsız T hücre aktivasyonu, büyük olasılıkla eksik fonksiyonel caging nedeniyle yüksek yoğunluklu. Bu nedenle, photoactivatable pMHC nonstimulatory pMHC (hemoglobin64-76 peptid (Hb) içerene.g. -Ek ) bir 10-30 x fazlalığı immobilizasyon adımı sırasında seyreltilmiş. Bu sinyal gürültü oranı sonraki görüntüleme deneme artırır.</li>
	<li>Photoactivate CD4 için+ T hücreleri, topluca biotinylated Hb-ben-Ek (3 µg/mL), biotinylated photoactivatable mm-ben-Ek (0.1 µg/mL) ve biotinylated antikor sınıf karşı karışımı kullanın ben MHC H2-Kk (0,5 µg / mL). anti-H2-Kk antikor 5 C. teşvik eder. H2-Kkcam yüzey harekete geçirmek gören olmadan yaymak için hızlı C7/2B4/ve T hücreleri.</li>
	<li>CD8 için+ T hücreleri, kullanın biotinylated KAVYDFATL peptid taşıyan H2-Db karışımı (1 µg/mL), biotinylated photoactivatable OVA-H2-Kb (0.1 µg/mL) ve ekstrasellüler etki alanı adezyon molekülün ICAM-1 (2 µg/mL böcek hücre kültür13tarafından üretilen). ICAM-1 T hücre yüzeyinde integrin LFA1 meşgul olarak yakın kişi oluşumu teşvik eder.</li>
	<li>Tüm protein karışımları kuluçka 1s RT at veya en az 2 h 4 ° C'de ardından engelleme arabellekte uygulamak Not: Önceden belirlenen6~ 8000 µm2 başına olmak bu tür yüzeylerde Moleküler yoğunluğu oldu. Th yüzeyinde, yoğunluğu biotinylated proteinin ~ 267 molekülleri µm2decaging önce başına photoactivatable pMHC ~1/30 gösteren göz önüne alındığında olacaktır.</li>
	<li>Adım olduğu gibi 1,6 yıkama ve HBS içinde kullanıma hazır kadar bırakın.</li>
	<li>200.000 CD4 eklemek+ veya CD8+ T hücreleri uygun TCR her kuyuya ifade ve hücreleri 15dk için 37 ° C'de bağlı kalmak izin. Hücreleri bağlı ve yüzeyde yaymak, onlar photoactivation ve görüntüleme için hazırız. Not: Floresan problar Imaging ile efektör T hücrelerinin Retroviral iletim ayrıntı elswhere6,7' açıklanmıştır. Kalsiyum sinyal aynı zamanda kalsiyum hassas boya Fluo-46ile yüklenen untransduced T hücreleri kullanarak ele. Ayrıca photoactivatable pMHC decaging neden olmaktadır UV aralığındaki uyarma gerektirdiğinden ratiometric boya Fura-2 tavsiye edilmez.</li>
</ol>2. resim alma
<ol><li>Resim alma için bir UV uyumlu 150 X objektif lens ile outfitted ters bir TIRF mikroskobu kullanın. UV ışınlatayım 100 bir W civa lamba (HBO) bağlı bir dijital diyafram sistemi kullanarak kullanıcı tanımlı bölgeler. UV ışığı bu lamba 400 nm uzun pası ayna kullanarak örnek üzerine doğrudan.</li>
	<li>Görüntü analiz yazılımı yerelleştirilmiş photoactivation ve hızlandırılmış satın alma için kullanın. Çoğu deneylerde probları 488 kullanarak her iki yeşil ve kırmızı kanalı izlemek nm ve 561 nm uyarma lazerler, anılan sıraya göre. Lazer ışığı da iletir (decaging etkinleştirmek için) UV aralığında bir dual-bant dikroik ayna kullanarak örnek üzerine yönlendirilir. Lütfen Malzeme tablo ve şekil 6 mikroskop yapılandırma hakkında daha fazla bilgi için bkz:.</li>
	<li>T hücreleri içeren odası slayt takma sonra ayarları gerektiği gibi TIRF veya epifluorescence aydınlatma elde etmek için ayarlayın. Live modda floresan probe(s) ilgi ifade eden hücrelerin bir alan seçin. Mikron çaplı bölgeler photoactivation altında yazılım denetimini kullanarak tek tek hücreler için kurmak.</li>
	<li>Hızlandırılmış edinme başlar. Genellikle, 80 timepoints, 5 zaman aralığı ile iktisap her zaman noktası arasındaki s. Bu sıralı 488 için gereğinden fazla zaman bırakır nm ve çift renk deneyler durumunda 563 nm Etkilenmeler.</li>
	<li>10 timepoints sonra dijital diyafram açarak seçili bölgeler için 1-1.5 s çekim photoactivate.</li>
	<li>Zaman atlamalı tamamlandıktan sonra hücre yeni bir alan seçin ve işlemi yineleyin.</li>
</ol>3. veri analizi
Not: İmmobilize ligandlar yerelleştirilmiş photoactivation yanıt ve hücre iskeleti remodeling etkinlikler sinyal, kantitatif analiz için kullanılabilecek iyi tanımlanmış, sabit bir uyarıcı bölge oluşturur. İletişim kuralları genellikle içerir floresan yoğunluğu radyasyonlu bölgedeki miktarının veya Radyoaktif bölge konumsal bir bitiş noktası olarak mesafe ölçümleri için kullanarak analiz (e.g. centrosome için kutuplaşma değerlendirmek için Radyoaktif bölge). Her iki analiz protokolleri aşağıda açıklanmıştır. Çeşitli etkileşimli resim analiz programları yoğunluğu ve sonra ek işleme ve analiz için çıktı olabilir mesafe ölçümleri yapmak için kullanılabilir.
<ol><li>
Floresan yoğunluğu
	<ol>
<li>Hücre (FIb) dışında bir arka plan bölgesinin floresan yoğunluğu (FI) belirlemek. Bu arka plan düzeltme için kullanılacaktır.<ol>
<li>Bir mikron büyüklüğünde kare bölgesi dışında hücre ve bir maske yapmak. Floresan yoğunluğu belirlemek için analiz tıklatın | Maske istatistikleri. Demek floresan yoğunluğu seçin ve değerleri vermek. Not: Yordam ayrıntıları (örneğin 3.1.1.1) Slidebook yazılımlar için de kullanılır (bkz. Tablo malzeme). Diğer yazılım paketlerini kullanarak bu protokolünü (örn., FIJI) biraz farklı olacaktır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Her zaman için photoactivated bölgedeki FI belirlemek.<ol>
<li>Maske yapıldı. photoactivated bölge vurgulamak için seçin. Floresan yoğunluğu belirlemek için analiz tıklatın | Maske istatistikleri. Demek floresan yoğunluğu seçin ve değerleri vermek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bölgede ölçüm FI değerleri FI kökenli çıkarma. O zaman, düzeltilmiş FI ölçümler ortalama tarafından bölerek normalize, arka plan FI photoactivation önce ilk 9 kare düzeltildi. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). Not: ΔF/F bir fonksiyonu olarak grafiğini çizin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesafe
	<ol>
<li>X ve y koordinatları photoactivated Bölge Merkezi.<ol>
<li>X ve y koordinatları photoactivated bölgesinin merkezinin photoactivated yapıldı bölge vurgulamak için maske seçin. Photoactivation bölgesinin vurgulandığında, analiz seçin | Maske istatistikleri | Alan Merkezi ve değerleri vermek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>X ve y koordinatları için her zaman için ilgi soruşturma floresan. Bu genellikle el ile veya otomatikleştirilmiş parçacık izleme elde edilir.<ol>
<li>X ve y belirlemek için faiz, floresan probe koordinatlarını Manuel parçacık izleme seçin ve faiz floresan sondası zamanla'yı tıklatın. Bir kez tüm zaman Puan izleniyor, analiz seçmek | Maske istatistikleri | Alan Merkezi ve değerleri vermek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Floresan protein ilgi ve her zaman noktası denklemi kullanarak photoactivated Bölge Merkezi arasındaki uzaklığı hesaplamak: mesafe √ = ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), hangi x2 ve y2 vardır1 faiz ve x ve y1 floresan protein koordinatlarını photoactivated Bölge Merkezi koordinatlar.</li>
		<li>Grafik zamanın bir fonksiyonu olarak mesafe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse.">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).</li><li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Synapse+Formation:+Cell+Polarity+During+T+Cell-APC+Interaction.">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading:+A+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT.">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li><li>Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Function+of+the+Immunological+Synapse+from+Studies+with+Supported+Planar+Bilayers.">Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers.</a> Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).</li><li>Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+kinase+&#945;+establishes+T+cell+polarity+by+shaping+diacylglycerol+accumulation+at+the+immunological+synapse.">Diacylglycerol kinase &#945; establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 7, ra82 (2014).</li><li>Huse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Dynamics+of+T+Cell+Receptor+Signaling+with+a+Photoactivatable+Agonist.">Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist.</a> Immunity. 27, 76-88 (2007).</li><li>Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+diacylglycerol+drives+the+polarization+of+the+microtubule-organizing+center+in+T+cells.">Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells.</a> Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).</li><li>Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+variable+hinge+region+of+novel+PKCs+determines+localization+to+distinct+regions+of+the+immunological+synapse.">The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse.</a> PLoS One. 9, 1-8 (2014).</li><li>Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+promotes+centrosome+polarization+in+T+cells+via+reciprocal+localization+of+dynein+and+myosin+II.">Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).</li><li>Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cascade+of+protein+kinase+C+isozymes+promotes+cytoskeletal+polarization+in+T+cells.">A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells.</a> Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).</li><li>Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+T+cell+receptor+binding+to+peptide-MHC:+evidence+for+a+general+mechanism+of+molecular+scanning.">Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).</li><li>Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-A2-peptide+complexes:+refolding+and+crystallization+of+molecules+expressed+in+Escherichia+coli+and+complexed+with+single+antigenic+peptides.">HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).</li><li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells.">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).</li><li>Nguyen Duc, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Generalizable+Platform+for+the+Photoactivation+of+Cell+Surface+Receptors.">A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors.</a> ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).</li><li>Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling.">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration.">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+improved+light-induced+dimer+(iLID)+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins.">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).</li><li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+cell+function+using+engineered+photoreceptors.">Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors.</a> Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).</li><li>Grusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+precise+activation+of+engineered+receptor+tyrosine+kinases+by+light.">Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light.</a> EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage.">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Son yıllarda, ışık spatiotemporally kontrollü harekete geçirmek-in hücresel süreçler için mükemmel bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, her ilişkili avantajları ve dezavantajları. İmmobilize, hücre dışı ligandlar decaging üzerinde dayanır, burada açıklanan sistem hızlı, hücre altı, polarize sinyal yanıt analiz için idealdir. Bu yaklaşım yukarıda açıklandığı gibi T hücrelerinin oluşumunda IS incelemek için uygulanmıştır. Ayrıca, diğer reseptörleri için Kafesli ligandlar, inhibitör doğal ölüm hücreleri ve yanıt transkripsiyon faktörü NF-κB nükleer translocation reseptör gibi ücretli için sinyal değerlendirmek için aynı stratejiyi uygulamak olanaklı si mühendislik 14,15işaret.
Bu protokol için uyarıcı ligandlar stimülasyon görüntüleme deney süresince sabit, polarize kaynağı olarak kalmasını sağlamak için immobilize. Bu yaklaşım hücre polarizasyon çalışmalar için uygundur. Ancak, TCR photoactivation yaklaşım üzerinde desteklenen lipid bilayers geçici kontrollü T hücre aktivasyonu için kolayca adapte olduğunu belirtmek gerekir. Belli ki, bir sürekli, polarize stimülasyon bu bağlamda elde edemez. Bu gereksiz, olabilir ancak, deneysel hedefleri verilen.
Sistem aynı zamanda oldukça esnek decaging için UV ışık kaynağı ile ilgili. Şu anda, ancak bir darbe azot lazer (darbe genişliği 4 ns, darbe enerji 120 mJ), daha önce kullanılan6100 W Hg lamba odaklı aydınlatma için kullanılır. Bazen, bir el UV lambası (365 nm, 4 W) içinde görüntüleme örnek photostimulatable ligand büyük bölgelerinde decage için konumlandırılmış. Decaging sisteminin belirli özelliklerini her durumda söz konusu deneme teknik gereksinimlerine bağlıdır.
Bu sistemi uygularken, gözlenen yanıt belirli photoactivation olay ve sahte reseptörü harekete geçirmek ya da UV kaynaklı duyarlilik değil sonucu olduğunu doğrulamak önemlidir. Bu eserler ekarte etmek için iki özgüllük denetim gerçekleştirilebilir. İlk olarak, doğrudan photoactivation deneyler sırasında ışınlanmış değil hücreleri floresan yoğunluğu izlenebilir. Yüzeyi düzgün Kafesli, kayda değer ise yanıt bu hücrelerde (örneğin, resim 5C) dikkat edilmelidir değil. İkinci olarak, hangi T hücreleri photoactivatable ligandlar eksik yüzeylerde UV ışınlanmış deneyler yapılabilir. Bu denetim photoactivatable ligand bağımsız UV kaynaklı etkileri tanımlamak için önemlidir (örneğin, referans 6 bakınız). Sistem en iyileştirme sırasında da el altında hızlı ve yerelleştirilmiş sağlam hücresel görüntüleme (Örneğin, Grb2-GFP işe alım) etkileniriz son derece yararlı olur. Eğer bu olaylar reseptör uyarmaya spatiotemporally proksimal sinyal olaylar ve photoactivation arasındaki ilişkiler değerlendirilmesi çok daha basittir.
Photoactivation yaklaşım sinyal reseptör üzerinde nefis kronolojik zamanmekansal kontrol içerse bu transfectable optogenetic sistemleri16,17,18tarafından,19 tanınan adaptasyon yoksun ,20,21,22. Bazı optogenetic da photoreversible, burada açıklanan photoactivation yaklaşımı ile kullanılamaz koşullu denetimi sağlayan proteinlerdir. Optogenetic sistemleri, ancak, teknik olarak photoactivated proteinlerin Difüzyon sınırlama zordur. Bu hücre altı bir bağlamda özellikle polarize sinyal analizi karıştırıyor.
Bir de bu photoactivation sistemin ilgi çekici varlık iyi niyetli hücre-hücre etkileşim tüm yönleriyle özetlemek olamaz bir cam yüzey olduğunu dikkat etmelisiniz. Sinyal inisiyasyon kronolojik zamanmekansal denetimi koruyarak bu sorunu aşmak için müfettişler bir optik tuzak sistemi olmak başlangıcı hücre iskeleti düzenlemeler ve IS olgunlaşma için izin veren bir APC T hücre temas getirmek için kullanılan gerçek zamanlı23' te görüntülenir. Bu sistem hassas başlatma ve hücre iskeleti dynamics gerçek bir APC kullanarak görselleştirme sağlasa da, bu nispeten düşük işlem hacmi ve görüntü kalitesini olumsuz yönde etkileyen TIRF aydınlatma ile uyumlu değil.
Sonuç olarak, bu protokol için açıklanan yöntemi TCR kaynaklı sonuçta TCR harekete geçirmek takip hızlı biyokimyasal değişiklikler aydınlatma için izin T hücre içinde sinyal kronolojik zamanmekansal denetim sağlar. Bu sistem bize daha iyi anlamak nasıl T hücre polarizasyon, IS oluşumu ve sonuçta efektör yanıt teslimini TCR etkinleştirme aşağıdaki sinyal etkinlik tanıtımı için bir yol sağlar.

T lenfositler (T hücreleri) hücresel bağışıklık hücre yüzeyine MHC bağlamında görüntülenen antijenik peptidler tanıyarak merkezi bir rol oynamaktadır. TCR tarafından aracılık ettiği, Antijen tanıma saf T hücre farklılaşma sürücüler ve cytolytic ve iletişimsel tepkileri efektör nüfus tarafından teslim teşvik etmektedir. TCR nişan da hücresel mimarisi dramatik değişiklikler neden olmaktadır. Birkaç dakika içinde T hücreleri taktımı immünolojik synapse (IS)1,2olarak bilinen bir polarize arayüz şekillendirme (APC), antijen sunan hücrenin kenarını üzerine. Is yönlü yayın sitokinler veya sitotoksik T lenfositler (CTL), APC yok litik proteinler durumunda etkinleştirerek T hücre efektör yanıt-e doğru potentiates.
TCR nişan pMHC tarafından bağlayıcı sonuçta sağlam sinaptik sitoiskeleti2/ remodeling teşvik T harekete geçirmek için hücreleri (LAT), dahil olmak üzere birden çok akış aşağı adaptör moleküllerin hızlı fosforilasyon neden olmaktadır. Kortikal ipliksi aktin (F-aktin) T hücre APC yüzeye yayılan sürücüler ve IS çevre ve tükenmesi Merkezi'nden F-aktin birikimi ile karakterize bir annüler yapıda giderir. F-aktin halka oluşumu sıkı hale gelmesini Mikrotubul organizasyon Merkezi (MTOC, T hücreleri centrosome olarak da bilinir) için hemen altında arayüzü merkezi bir konuma eşleşen. Her iki olay ilk Antijen tanıma dakika içinde oluşur ve hangi sonraki etkinleştirme olayları ve efektör yanıt ortaya mimari içerik oluşturun.
Is oluşumu çalışmaya, çeşitli labs APC immobilize TCR ligandlar içerir veya kendi ligandlar3,4içerir bir lipid bilayer destekler bir cam yüzey tarafından değiştirilir yaklaşımlar geliştirdi. T hücreleri tarafından toplam iç yansıma Floresans mikroskobu (TIRF) ya da yüksek çözünürlüklü çalışmalar erken T hücre aktivasyonu ve IS oluşumu etkinleştirme confocal mikroskobu görüntüsü bu yüzeylerde IS benzeri kişiler oluşturur.
Bu yaklaşımlar tam olarak birleştirilmiş IS mükemmel görselleştirme için izin vermiş olsa da, sinyal aşağıdaki TCR:pMHC ligasyonu çoğunu TCR harekete geçirmek doğru bir şekilde takip olayların sırasını belirlemek için çabalarını zorlaştıran saniye içinde oluşur . Bu sorunu aşmak için bir photoactivation yaklaşım, photoactivatable pMHC TCR harekete geçirmek5,6,7kronolojik zamanmekansal kontrolünü elde etmek için kullanılan geliştirilmiştir. Bu sistemde, T hücreleri içeren ultraviyole (UV) ışık ile ışınlanmış kadar TCR için uyarıcı sigara photoactivatable pMHC cam yüzeyler eklenir. T hücre yüzeyin mikron büyüklüğünde bölgenin UV ışınlama T hücre tarafından kabul edilebilir bir uyarıcı bölgesi oluşturmak photocage kaldırır. Sonraki sinyal olaylar ve hücre iskeleti remodeling sonra genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere kullanarak izlenir. Antijenik peptidler, sınıf II MHC-Ek ve sınıf bağlamında ben MHC H2-Kb, anılan sıraya göre sunulur, güve sitokrom c88-103 (mm) ve ovalbumin257-264 (OVA), iki photoactivatable sürümü olmuştur (şekil 1) geliştirdi. Bu her iki CD4 analizini sağlar+ T hücreleri belirli mm-ben-Ek (5 C. ifade etmek için C7, 2B4, ya da ve TCRs) ve CD8+ T hücreleri belirli OVA-H2-Kb (OT1 TCR ifade).
Son on yıl içinde TCR photoactivation ve düşsel yaklaşımı erken TCR adımları sinyal kesin Kinetik kurmak ve polarize hücre iskeleti remodeling5, yöneten moleküler yolları tanımlamak için kullanılmıştır 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Örneğin, tahlil bu centrosome belirlemede etkili oldu APC doğru hale gelmesini lipid ikinci haberci diacylglycerol IS at merkezli yerelleştirilmiş bir degrade tarafından aracılık. Bu metodoloji yüksek çözünürlüklü görüntü analizi T hücre işlevinin talep uygulamaları için değerli olmaya devam edecektir tahmin edilmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1152">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155361</td>
			<td style="width:443px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">20217</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td>Will be used to biotinylate proteins</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated Hb I-EK&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-MCC I-EK&#160;</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated &#945;H2-Kk antibody</td>
			<td style="width:211px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-OVA H2-Kb</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated KAVY H2-Db&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated ICAM1&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Hand held UV lamp</td>
			<td style="width:211px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">UVGL-25</td>
			<td>Lamp is held &#60; 1 cm from the sample.&#160; 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Olympus IX-81 OMAC TIRF system.</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Additional information about the imaging system can be found in Figure 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Mosaic digital diaphragm</td>
			<td style="width:211px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:379px;">Slidebook software</td>
			<td style="width:211px;">Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial and temporal control of t cell activation using a photoactivatable agonist

T lenfositler TCR etkinleştirme aşağıdaki birkaç dakika içinde meydana gelen hızlı, polarize işaret içinde meşgul. Bu oluşumu immünolojik sinaps, T hücre aktivasyonu düzenleyen ve directionally efektör yanıt hedefleyen bir sterotiplenmiş hücre-hücre kavşak neden olmaktadır. Bu süreçlerin etkin bir şekilde çalışmak için hızlı, polarize yanıt-e doğru esir alma için uyarlanmış bir düşsel yaklaşımı gereklidir. Bu iletişim kuralı ultraviyole ışığa maruz kadar yani uyarıcı olmayan bir photoactivatable peptid-Binbaşı MHC kompleksi (pMHC) dayalı böyle bir sistem açıklar. Hedeflenen Bu reaktif videomicroscopy deneyler sırasında decaging TCR etkinleştirme kesin kronolojik zamanmekansal kontrol ve yüksek çözünürlüklü Imaging sonraki hücresel yanıtları toplam iç yansıma (TIRF) tarafından izleme sağlar. Bu yaklaşım da genetik ve farmakolojik pertürbasyon stratejileri ile uyumludur. Bu TCR sinyal immünolojik synapse altında yatan polarize hücre iskeleti yapıların oluşumu için bağlantı iyi tanımlanmış moleküler yolları Meclisi sağlar.

Photoactivation ve düşsel yaklaşımı gözlem ve hızlı, polarize sinyal yanıtlar facile miktar sağlar. Çoğaltılamaz yeteneklerini göstermek için işte TCR kaynaklı DAG birikimi ve centrosome hale gelmesini arasında kronolojik zamanmekansal korelasyon inceleyerek bir deney. 5C. C7 T hücre patlamaların retrovirally ile 2 floresan gazetecilere transduced: GFP (C1-GFP) ve RFP tübülin centrosome izlemek için tandem C1 etki alanlarından protein kinaz C-θ içeren bir DAG Biyoalgılayıcı bağlantılı. T hücreleri sonra photoactivatable mm-ben-Ekiçeren odacıklı coverglass bağlanmıştır. C1-GFP TIRF mikroskobu ve RFP tübülin epifluorescence modunda kullanarak yansıma. Şekil 2' de gösterildiği gibi T hücre yüzeyin yerelleştirilmiş photoactivation DAG radyasyonlu bölgesinde birikmesi neden olmaktadır. Bu aynı bölgeye centrosome hale gelmesini tarafından saniye içinde takip ediyor.
C1-GFP birikimi zamanla (şekil 3) photoactivated bölgesinin merkezinde arka plan düzeltme sonrasında normalleştirilmiş floresan yoğunluğu hesaplayarak sayılabilir. Centrosome hale gelmesini yanıt olarak photoactivation centrosome ve photoactivated Bölge Merkezi arasındaki mesafe (şekil 4) zamanın bir fonksiyonu olarak hesaplayarak sayılabilir.
Bu yöntem, geniş bir dizi hızlı, polarize sinyal tepkiler, aslında bir şey floresan bir sonda aracılığıyla izlenebilir incelemek için kullanılabilir. Örneğin, TCR photoactivation erken sinyal microcluster oluşumu fluorescently etiketli Grb2 kullanarak izlemek için kullanılmaktadır (Grb2-GFP) (şekil 5). DAG birikimi ve centrosome hale gelmesini yanıt benzer, Grb2-GFP polarizasyon kısa bir süre takip photoactivation (şekil 5) oluşur ve normalleştirilmiş floresan yoğunluğu yaklaşımı kullanarak sayılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig1.jpg"> Resim 1: photocaged mm peptid kullanarak Photoactivation sistemi. (A) Photocaged mm peptid için strateji. NPE grup mm peptid lizin kalıntısı eklenir. UV ışınlama NPE mm onun yerli forma geri yükleme, kaldırma sonuçlanır. (B) mm, 5 C. zaman NPE bağlıdır C7 TCR MM'ye bağlanamıyor. NPE kaldırılması tanınması 5 C. sonuçları Yerel mm peptid TCR C7. (C) photocaged strateji photocaged OVA peptid OT-1 TCR UV ışınlama üzerine etkinleştirmek için kullanılan CD8 + T hücrelerle çalışmak için uyarlanmıştır.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig2.jpg"> Resim 2: Hızlandırılmış montaj DAG birikimi ve centrosome hale gelmesini TCR photoactivation 5 c takip C7 T hücre. 5C. GFP (C1-GFP) ve etiket-RFP tübülin (RFP-küvet), centrosome için floresan muhabir PKC-tandem C1-etki alanları içeren bir DAG Biyoalgılayıcı ifade C7 cep erimiş. 5 C. polarize yanıt montages göstermek C7 T hücreleri zamanla. Sarı oval ve metin photoactivation yeri ve zamanı gösterir. Zamanla centrosome hale gelmesini photoactivated bölge doğru takip photoactivated bölge, C1-GFP biriktirir. Ölçek çubuğu: 10 µm.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig3.jpg"> Şekil 3: Miktar photoactivated bölge, DAG birikimi Photoactivated bölge (solda), DAG, C1-GFP, birikimi zamanla photoactivated bölgesi (sarı daire mavi gölgeli), arka plan düzeltme sonrasında normalleştirilmiş floresan yoğunluğu hesaplayarak sayılabilir. Veri photoactivation daha önce elde edilen dokuz çerçevelerin göreli normalleştirilmiş. C1-GFP zenginleştirme, photoactivated bölge radyasyonlu bölgedeki ortalama Floresans yoğunluğu arka plan düzeltme aşağıdaki hücrenin tamamını ortalama Floresans yoğunluğunu tarafından bölüme göre hesaplanabilir. Denklemi: ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)), hangi FI ortalama Floresans yoğunluğu, normalleştirilmiş floresan yoğunluğu hesaplamak için kullanılabilir. Photoactivated bölge normalleştirilmiş Floresans yoğunlukta o zaman zaman (sağda) bir fonksiyonu grafiği çizilecek. Mor çizgi photoactivation süresini gösterir. Ölçek çubuğu: 10 µm.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig4.jpg"> Şekil 4: Centrosome hale gelmesini miktar. Centrosome (RFP-küvet) koordinatlarını zaman içinde el ile (solda) her zaman noktasında photoactivated bölgesi (beyaz ok) doğru centrosome yolu takip ederek belirlemek. Photoactivated bölge (Sarı Daire) Merkezi koordinatları belirleyin. Centrosome ve photoactivated Bölge Merkezi arasındaki mesafe mesafe için denklemi kullanarak her zaman noktasında hesaplanabilir √ = ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), hangi x2 ve y 2 x ve y koordinatları alanının centrosome ve x1 ve y1 için x ve y koordinatları photoactivated Bölge Merkezi. Centrosome her zaman photoactivated bölgesinin Merkezi'nden mesafe noktası o zaman zaman (sağda) bir fonksiyonu grafiği çizilecek. Mor çizgi photoactivation süresini gösterir. Ölçek çubuğu: 10 µm.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig5.jpg"> Şekil 5: Grb2-GFP microcluster oluşumu. (A) temsilcisi 5C. C7 cep Fluorescently ifade etiketli Grb2 (Grb2-GFP). Montages Grb2-GFP fazla mesai polarize tepki göstermektedir. Sarı oval ve metin photoactivation yeri ve zamanı gösterir. Zamanla, photoactivated bölgesi Grb2-GFP biriktirir. (B) photoactivated bölge zaman içinde Grb2-GFP Floresans yoğunlukta miktar. N = 15 hücre. (C) Grb2-GFP floresan yoğunluğu photoactivated bölgesi dışında bir denetim bölgesindeki miktar. N = 15 hücre.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig6.jpg"> Şekil 6: Mikroskop photoactivation ve TIRF görüntüleme için yapılandırma. 488 nm ve 561 nm lazerler kullanılır TIRF ve yeşil ve kırmızı probları, epifluorescence görüntüleme için sırasıyla. UV ışığı photoactivation için aydınlatıcı küçük, kullanıcı tanımlı bölgelerinde yeteneğine sahip bir dijital diyafram sisteme bağlı bir civa (Hg) lamba alınır. Hg lamba/diyafram ışıktan görüntüleme lazerler yansıtır dikroik ayna altında konumlandırılmış bir longpass ayna örnek yansıtır. Dikroik ayna UV ışık geçmek için tasarlanmış olmalıdır. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56655/56655fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist at JoVE.com

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

T hücre aktivasyonu Photoactivatable Agonist kullanarak kayma ve Temporal kontrolünü

Bu iletişim kuralı T lenfosit photoactivatable peptid-MHC, T hücre aktivasyonu hassas kronolojik zamanmekansal kontrol etkinleştirme kullanarak etkinleştirmek için bir görüntüleme tabanlı yöntemi açıklar.

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.2K Görüntüleme.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Bu iletişim kuralı T lenfosit photoactivatable peptid-MHC, T hücre aktivasyonu hassas kronolojik zamanmekansal kontrol etkinleştirme kullanarak etkinleştirmek için bir görüntüleme tabanlı yöntemi açıklar.

Video: Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Yapay Antijen Hücre (AAPC) Aracılı Aktivasyon ve Doğal Öldürücü T hücreleri genişletilmesi Presenting

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

Madstorm kullanarak T hücrelerinin çok yönlü, süper çözünürlüklü görüntüsü

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...