Die Autoren bedanken sich bei allen Mitgliedern der Reynolds Labor an Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft, und das Chen Dong Labor an der University of Texas MD Anderson Cancer Center für die Optimierung dieses Protokolls zu danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss zu JMR von der National Institutes of Health (K22AI104941) unterstützt.

Alle experimentellen Verfahren werden durchgeführt unter Verwendung von Protokollen vom Büro des Environmental Health and Safety an der Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft genehmigt. C57BL / 6-Mäuse (von NCI gekauft) für dieses Protokoll wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen untergebracht sind, und alle Tierversuche wurden unter Verwendung von Protokollen, die von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigten an der Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft. 1. Vorbereitung der Instrumente, Zubehör und Reagenzien <ol><li> Mantel mit 48 Vertiefungen oder 24-Well-Platten mit anti-CD3 und anti-CD28 (Tabelle 1) in sterilem PBS, abdecken und wickeln Sie sie in Parafilm, um Verdunstung und Kontamination zu vermeiden, und dann inkubiert O / N bei 4 o C Vortag T Zellisolierung. Alternativ Mantel Brunnen 1 h bei 37 ° C. Führen Th0, Th1, Th2 und iTreg Bedingungen durch die Beschichtung sowohl anti-CD3 und anti-CD28 bei 1 ug / ml in 0,5 bis 1 ml bistal Volumen (48-Well-Platte). Für Th17 wir typischerweise Mantel anti-CD3 bei 2 ug / ml und Anti-CD28, auf 1 ug / ml. HINWEIS: Wir haben festgestellt, daß eine niedrigere Anti-CD3-Konzentration ist optimal für Th1, Th2 und iTreg Generation während eine höhere anti-CD3-Konzentration ist optimal für Th17 Generation. So sollte anti-CD3 und anti-CD28-Konzentrationen titriert und für einzelne Laboratorien (Tabelle 2) optimiert werden. </li><li> Sterilisieren Sie eine Reihe von Dissektionswerkzeuge (Schere und Pinzette) von Autoklaven oder Desinfektionslösung. Ein Rohr oder kleinen Becherglas mit 70% Ethanol wird für die schnelle Sterilisation von Instrumenten zwischen Dissektionen benötigt. Schließlich wird eine Sprayflasche, die 70% Ethanol zum Sterilisieren der Oberfläche der Maus vor Dissektion erforderlich. </li><li> Bereiten Sie eine Dissektion Oberfläche, indem ein flaches Stück Styropor oder Pinnwand mit Aluminiumfolie. Zergliedern Stifte oder Nadeln verwendet werden, um das Tier zu fixieren. </li><li> Bereiten die Gerichte oder Platten für die Sammlung von tiHEMEN. Wenn die Bündelung Geweben, separate 60mm Gerichte 3 ml mit steriler PBS + 1% FBS (PBS +) für Milz und Lymphknotengewebe ausreichend ist. Wenn halten Gewebe von einzelnen Mäusen zu trennen, bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 1 ml PBS + in die gewünschte Anzahl von Brunnen. </li><li> Bereiten vollständigen RPMI-Medium für die Zellkultur und Vorwärmen vor der Anwendung (Tabelle 1). HINWEIS: Es wird routinemäßig RPMI aber auch andere Medien wie IMDM und DMEM ebenso effektiv oder überlegen je Labor und Experiment. </li><li> Cut 2x2 cm große Quadrate von Nylon Netz mit einem 120 &amp; mgr; m Porengröße und Autoklaven zu sterilisieren (Tabelle 1). </li><li> Optional: Wenn mit dem Hochgeschwindigkeits-Magnetzellsortiersystem wie autoMACS für CD4 + Zellanreicherung, vorge fließend warmem und Spülen Puffer in einem 37 ° C Wasserbad, um Schäden an der Maschine zu vermeiden. </li><li> HINWEIS: Die Anreicherung wird empfohlen, die Sortierausbeute erhöhen und Sortierzeit. </li><li> AlleHerstellungsschritte, mit Ausnahme für die Präparation sollte in einem sterilen Gewebekulturhaube durchgeführt werden. </li></ol> 2. Isolierung von Lymphknoten und Milz von Mäusen <ol><li> Euthanize die erforderliche Anzahl von Tieren mit einem institutionell anerkannte Technik. Verwenden weibliche C57BL / 6 Mäuse im Alter von 5-10 WKS aufgrund ihrer hohen Prozentsatz von naiven T-Zellen und den Körperfettanteil im Vergleich zu Männern oder älteren Mäusen. Hinweis: Zellen von männlichen Mäusen werden in ähnlicher Weise in vitro durchzuführen, und die Protokollschritte bleiben dieselben. Weibliche Mäuse, 5-10 Wochen alt, werden in der Regel ergeben 3-6 x 10 6 naiven CD4 + T-Zellen pro Maus. Jedoch kann unter Verwendung verschiedener Mäusestämme Ausbeute und Leistung beeinflussen. Beispielsweise können Zellen aus C57BL / 6-Mäuse sind besser zur Erzeugung von Th1-Zellen, während Zellen von Mäusen Balb.c besser zur Erzeugung von Th2-Zellen. </li><li> Verbreiten Sie die Gliedmaßen des Tieres und hänge sie an Ort und Stelle, wie in Abbildung 1 dargestellt. Schneiden Sie die Haut langitudinally von den Anus bis zum Kinn, während man aufpassen, nicht zu tieferen Gewebepunktion. </li><li> Verbreiten Sie öffnen Sie die Haut mit einer Pinzette und stecken Sie die Haut an Ort und Stelle, um einen einfachen Zugang zu den Lymphknoten zu ermöglichen, wie in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Ernten Sie die zugänglichen Lymphknoten aus den in Abbildung 1 gezeigten Stellen. Wir packen die Lymphknoten mit einer Pinzette, während Trenngewebe mit einer anderen Pinzette wird für die einfache Entfernung ermöglichen. Legen Sie das Gewebe in der Auffangschale. </li><li> Ernten der Milz aus der in Figur 1 gezeigten Position. In diesem Fall wird vorsichtig Schneid ins Peritoneum benötigt, um Zugang zu der Milz erhalten. Legen Sie das Gewebe in einer Sammlung Gericht. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang, wenn mehr Gewebe geerntet werden. Ansonsten mit den nächsten Schritten fortfahren. An dieser Stelle führen Sie alle weiteren Schritte auf Eis, bis die Beschichtung der T-Zellen nach dem Sortieren. </li></ol> 3. Gewebeverarbeitung und CD4 + Enrichment<ol><li> Verarbeiten Sie die Lymphknoten und Milz in verschiedenen Gerichten, die Ausbeute als Lymphknotenzellpräparate nicht Erythrozytenlyse erfordern, die zu leichten Leukozyten Tod erhöhen. Daher sind die folgenden Schritte beschreiben ein Verfahren zur Verarbeitung von Milz und Lymphknoten-Populationen getrennt durch Kombination vor der Markierung für die Sortierung folgt. </li><li> Entfernen Sie das Gewebe (Milz oder Lymphknoten gebündelt) von der Auffangschale und in einen neuen 60-mm-Schale mit 3 ml PBS +. Legen Sie ein Quadrat von sterilen Nylon Netz über das Gewebe mit sterilisierten Pinzette. </li><li> Mit der Daumenseite eines Spritzenkolbens (3-10 ml) und sanft zerschlagen das Gewebe gegen die mesh. Nahezu das gesamte Gewebe sollte in Suspension gehen. Sie können auch den Gewebe zwischen zwei autoklaviertem mattierte Folien und geschliffen in Suspension. </li><li> Pipettieren Sie die Aussetzung nach oben und unten ein paar Mal zum Aufbrechen der verbleibende lösliche Klumpen. Legen Sie ein neues quadratisches Stück Nylon-Mesh über die Öffnung ein15 ml konischen Röhrchen und Filtern der Suspension durch, um den verbleibenden Schmutz zu entfernen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2-4 für zusätzliche Lymphknoten und Milz-Gewebe. </li><li> Nachdem die Suspension in eine 15ml Tube gefiltert füllen den Rest des Schlauchs mit PBS + und schwenken. Zentrifugiere die Zellen bei 475 g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Für die Milzzellen, saugen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und Zellpellet in 1 ml eiskaltem 1X ACK-Lösung pro Milz für 1 Minute, um Erythrozyten zu lysieren. Dann gibt man 10 ml PBS + auf der Oberseite des ACK, das Röhrchen und zentrifugieren 475 xg für 5 min bei 4 ° C </li><li> Für Lymphknotenzellen, saugen Sie den Überstand und resuspendieren in 2 ml PBS +. Falls gewünscht können diese mit den Milzzellen nach ihrem ACK Lyse und Waschschritt kombiniert werden. </li><li> Saugt den Überstand nach Zentrifugation der Splenozyten und resuspendieren in weiteren 10 ml PBS +. An dieser Stelle kann der Lymphknoten Suspension einauf der Oberseite der Milz Suspension dded wenn zur Sortierung Gewebe Bündelung erforderlich. Zentrifugieren Sie das Röhrchen wieder bei 475 xg für 5 min bei 4 ° C </li><li> Das Zellpellet kann jetzt CD4 Anreicherung hergestellt werden. Wenn dieser Schritt nicht ausgeführt wird, zu den Sortiervorbereitungsschritte ablaufen. </li><li> Für CD4 Bereicherung mit dem Hochgeschwindigkeits-Magnetzellsortiersystem, resuspendieren Zellpellet mit CD4-Perlen. Typischerweise 15 &amp; mgr; l Perlen in 85 ul PBS + verdünnt wird verwendet, um das Gewebe zwischen 1 Maus kennzeichnen. Rampe auf das Volumen der Perlen-Mischung nach Bedarf, das Pellet, und Inkubieren für 15-30 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS +, vorbei an der Suspension durch Nylon in eine neue 15-ml-Tube, um Schmutz und Zentrifuge wieder bei 475 xg für 5 min bei 4 ° C zu entfernen </li><li> Das Pellet in 100 ul PBS + pro Maus und fahren Sie mit positiven Selektion auf der Hochgeschwindigkeits-Magnetzellsortiersystem. Wenn Sie eine manuelle Trennsystem, follow die Anweisungen des Herstellers für die Anreicherung. Alternativ Resuspendieren der Proben in FACS-Puffer: PBS mit 1 mM EDTA (pH = 8) und 1% BSA, sterilfiltriert. </li><li> Entfernen Sie die positive Fraktion und waschen Sie einmal mit 10 ml PBS +. Das angereicherte CD4 + Bruchteil ist nun bereit für die Sortierung gekennzeichnet werden. </li></ol> 4. Sortier Naive CD4 + T-Zellen <ol><li> Beschriften Sie die Zellpellets mit PBS + mit fluoreszierenden Antikörpern gegen CD62L, CD44, CD25 und CD4 gerichtet. Bei Verwendung der in Tabelle 1 aufgeführten Antikörper werden Verdünnungen für jeden zur Verfügung gestellt. Zur Färbung wird ein Volumen von 100 ul der Antikörpercocktail pro Geweben von einer Maus. </li><li> Das Pellet in Antikörper-Cocktail und Inkubation für 15 bis 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Die Zellen werden mit 10 ml PBS + und Zentrifuge 475 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Übergeben Sie die Mischung über eine andere Nylonfilter oder Zellsieb Kappe neubewegen alle übrig gebliebenen Trümmer. Pipettieren markierten Zellen in eine Röhre, die für den Zellsortierer kompatibel ist. Halten Sie Zellen auf Eis und von der Licht bis die Art geschützt. </li><li> Bereiten Sammelröhrchen durch Pipettieren 1-2ml kompletten RPMI Medium oder FBS in den Boden der Röhrchen zum Sammeln kompatibel auf einem Zellsortierer. </li><li> Sortieren Sie die naiven CD4 + T-Zellen als CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - Population (Abbildung 2). Waschen der gesammelten Zellen mit vollständigem RPMI-Medium und Zentrifugieren wie oben beschrieben. </li><li> Das Pellet in komplettem RPMI, zählen die naive Zellen, und stellen Sie die Konzentration auf 1 x 10 6 Zellen / ml. </li></ol> 5. Einrichten des In-vitro-Differenzierung <ol><li> Absaugen Vertiefungen der anti-CD3 und anti-CD28-beschichteten Platten und Waschen jeder Vertiefung mit 1 ml sterilem PBS (ohne FBS). Für Platten mit 48 Vertiefungen, die Platte 0,5 x 10 6 Zellen / Vertiefung in 0,5 ml RPMI. Für Platten mit 24 Vertiefungen, die Kultur 1 x 10 6 Zellen / Vertiefung in 1,0 ml RPMI. </li><li> Wenn die Prüfung des Einflusses eines Faktors, wie ein Arzneimittel hinzuzufügen der Substanz in die entsprechenden Vertiefungen entweder vor, während oder nach dem Differenzierungsprozeß je nach Experiment. Weiter, ergänzen die Kulturmedien mit entsprechend Zytokinen und blockierende Antikörper. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml hIL-2 und 5.000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml hIL-2, 2000 ng / ml löslich 37.51, und 5.000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml hIL-2, 5000 ng / ml XMG1.2 und 5.000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5,000 ng / ml XMG1.2 und 5.000 ng / ml 11B11. HINWEIS: Die oben dargestellten Bedingungen als optimal für die Maximierung der Produktion von Zytokinen, wie am Ende des Differenzierungs Experiment (Repräsentative Ergebnisse Abschnitt) gemessen werden. Allerdings sollte jede Bedingung für einzelne Laboratorien (Tabelle 2 optimiert werden </strong&gt;). Weiterhin ist der Zusatz von löslichem Anti-CD28 neben der Platte gebundenen Anti-CD28 wurde gefunden, dass Th2-Cytokin-Produktion in unserem Labor erweitern, hat keine Auswirkung auf andere T-Zellen-Untergruppen, aber: </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 4-5 vor der Analyse der Genexpression und Cytokinproduktion d. Alternativ zu entfernen, die Zellen aus den TCR Reize nach 2 d, 1 x 10 6 Zellen / ml mit frischem Medium angepasst, und die Platte in neue Vertiefungen (nicht beschichtet), um die Proliferation und die endgültige Ausbeute verbessern. In diesem Fall, werden frische polarisierenden Cytokine und Antikörper nicht benötigt aber 10 U / ml IL-2 soll auf die neuen Medien für Th0, Th1, Th2 und iTreg Kulturen hinzugefügt. </li></ol> 6. Analyse der Differenzierung <ol><li> Für Cytokin-Analyse durch Durchflusszytometrie restimulieren jede Vertiefung mit 10 ng / ml PMA und 1.000 ng / ml Ionomycin oder 1 &amp; mgr; g / ml anti-CD3 für 4-6 Stunden in Gegenwart eines Golgi-Inhibitor, wie Brefeldin A (Tabelle1). Führen intrazellulärem Zytokinfärbung je nach Experiment (Figur 3). Hinweis: Beize nicht linienspezifischen Zytokine oder Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise IL-4 (nicht gezeigt) und IFN &amp; gamma; (3) für Th17 Kulturen, für jede Bedingung als Negativkontrolle und als Indikator für die Differenzierung Effizienz. Ferner kann Flecken Foxp3 für Th17 Kulturen als Kehr Entwicklung Treg unter Zusatz von TGFß auftreten. </li><li> Zur Proteinquantifizierung, sammeln die Überstände aus jeder Vertiefung und Assay von zytokinspezifischen ELISA (Figur 3). Wenn es Bedenken, dass der Faktor getestet wurde Proliferation beeinflußt, verglichen mit Kontrollproben, können die Zellen gewaschen, gezählt, normalisiert und dann mit 1 &amp; mgr; g / ml Anti-CD3 für 24 h vor dem Sammeln Stände für ELISA-Assays restimuliert. Wenn Untersuchung IL-4 von Th2 Bedingungen, Waschen und Restimulation notwendig ist, um IL-4 zu entfernen, die l sein kanneftover von der ersten Differenzierung Kultur. </li><li> Für die Genexpressionsanalyse von Echtzeit-PCR, Ernte-Zellen nach der Inkubation, Waschen, zu normalisieren und wieder anzuregen für 2-6 h mit 1 ug / ml des anti-CD3 vor der Ernte mRNA (Abbildung 3). </li></ol>

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J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells.">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li><li>Avni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T(H)+cell+differentiation+is+accompanied+by+dynamic+changes+in+histone+acetylation+of+cytokine+genes.">T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes.</a> Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), (2007).</li><li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+th17+differentiation+of+naive+CD4+T+lymphocytes.">Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Während die Milz naiven Th-Zellen enthält, ist der Anteil dieser Population in Lymphknoten viel höher. Eine nicht fachgerechte Ermittlung und Beseitigung Lymphknoten in diesem Protokoll wird in einer schlechten Ausbeute von naiven Zellen führen. Dies kann besonders schwierig bei älteren Mäusen oder männlichen Mäusen, die mehr Fettgewebe haben. Wie in Abbildung 1, die richtige Befestigung und Verstiftung der tierischen Gliedmaßen und der Haut gezeigt werden zur leichteren Visualisierung der zugänglichen Außen Lymphknoten zu erlauben. Sobald Lymphknoten und Milz werden bearbeitet, ist der Zellsortierung die bevorzugten Verfahren zur Gewinnung eines hochgereinigten naiven CD4 + T-Zellpopulation. Reinheit ist entscheidend für nTregs oder Effektor-und Speicher-Th-Zellen aus den naiven Zelldifferenzierungsprozesses zu beeinflussen zu vermeiden. Schwierigkeiten bei der Erzielung einer hohen Ausbeute von naiven T-Zellen werden typischerweise durch ineffiziente Gewebesammlung und Verarbeitung bzw. Zellverlust während der Trennschritte verursacht. Zur Erhöhung der Ausbeute Make sure, um die Zellen zu verarbeiten mit kaltem Puffer und Inkubation auf Eis. Außerdem, um einen Verlust an Zellen während der Anreicherung und / oder Sortierung zu verhindern, die Optimierung der Reagenzien und der Trennung Protokolle sollten zuvor. Schließlich wird, wie an verschiedenen Stellen in der Protokollschritte erwähnt, Differenzierungsbedingungen sollten für die einzelnen Laboratorien bevor Großversuche (Tabelle 2) optimiert werden. Populationen - wie in Abbildung 2 gezeigt, kann naiven CD4 + T-Zellen leicht von der nTreg (CD4 + CD25 +) und Effektorzellen (CD4 + CD44 + CD62L) unterschieden werden. Sortieranlage ist einer der sichersten Wege, um Kontamination von Th-Teilmengen zu verhindern, die auch in der Milz und den Lymphknoten vorhanden sind. Treg Kontamination während der Differenzierung in der Unterdrückung der Aktivierung und Zytokin-Produktion führen. Die Kontamination von anderen Th-Untergruppen kann dazu führen,die Produktion von Cytokinen, die hemmend auf die Entwicklung der gewünschten Th Linien sind. Sortieranlage Gebühren können teuer sein und einige finden, dass es leichter ist, für CD4 + T-Zellen durch magnetische Trennung bereichern sich auf Sortierzeit, wie in diesem Protokoll beschrieben zu reduzieren. In Ermangelung eines Sortierers, einige Firmen bieten inzwischen Trennung Kits speziell für die Isolierung von naiven CD4 + T-Zellen entwickelt. Jedoch sollte die Reinheit der Bevölkerung immer nach der Trennung, ähnlich zu sortier Proben festgestellt werden. Die Feststellung einer niedrigen Frequenz von naiven CD4 + T-Zellen (CD62L +) im Vergleich zu dem Speicher / Effektor-Zellen (CD44 -), kann ein Problem mit der Maus, zeigen wie eine Infektion oder einen Tumor. In diesem Fall sollten die Zellen nicht für diese Art von Test verwendet werden. Es gibt durchaus ein paar Möglichkeiten, um die Wirksamkeit der Th Differenzierung zu bestimmen. Proteinanalyse wird traditionell von Zytokin-Färbung durchgeführttion, die eine Vorstellung von dem Prozentsatz von naiven Zellen, die eine bestimmte Abstammungslinie polarisiert wurden geben wird (Abbildung 3). Proteinquantifizierung durch ELISA ist auch ein nützliches Werkzeug zur Bestimmung der Gesamtmenge von Zytokinen in das Medium freigesetzt. Der Nachteil mit ELISA Proteinanalyse ist aber, dass den Vergleich der Ergebnisse zwischen den Versuchsgruppen schwierig sein kann, wenn ein bestimmter Faktor getestet hat einen Einfluss auf die Proliferation und das Überleben. In diesem Fall kann die Gesamtzahl von Zellen, die Zytokine zwischen den Gruppen am Ende des Experiments. Somit Normalisierung der Zellenzahl und Restimulation für eine kurze Zeitdauer (beispielsweise anti-CD3 für 24 h) erforderlich, um geeignete Ergebnisse zu erzielen. Ferner ist IL-4 als ein Polarisationsfaktor zur Erzeugung des Th2 Teilmenge verwendet, so dass diese Zellen müssen gewaschen werden, normiert und restimuliert vor der Durchführung eines ELISA für IL-4. Genexpressionsanalyse von Echtzeit-PCR ist nicht nur foder die Analyse der Cytokin-Gentranskription, sondern auch für linienspezifischen Transkriptionsfaktoren (Abbildung 3). So können je nach dem Experiment gibt es verschiedene Möglichkeiten, um die Wirksamkeit der Th Differenzierungstest.

Das Konzept der verschiedenen Linien oder Teilmengen von CD4 + T-Helferzellen (Th) gibt es schon seit der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts 1 gewesen. Anerkennung der verwandten Antigen in Gegenwart von kostimulatorischen Signalen resultiert in mehreren Runden der Zellproliferation und die eventuelle Differenzierung in Th-Zellen. Der Typ der Th-Zell während dieses Prozesses erzeugt wird, ist abhängig von der während der Aktivierung 2 vorhanden Zytokin-Umgebung. Anfänglich wurden naiven Th-Zellen vermutlich in 2 unterschiedliche Linien folgenden T-Zell-Rezeptor (TCR) Aktivierung kostimulatorischen CD28 Ligation und Zytokin-Signalisierung zu polarisieren. Typ-1-Helfer-Zellen (Th1) mit ihren Effektorfunktionen Produktion des IFN Cytokin sowie deren Erfordernis für IL-12-Signalisierung während des Differenzierungsprozesses 3,4 gekennzeichnet. Schließlich wurde entdeckt, dass differenzierte Th1-Zellen eine genetische Profil, das am meisten ausgeprägt auszeichnet b habeny der Ausdruck der T-Box-Familie Transkriptionsfaktor, Tbx21 (T-bet), die als die Hauptregulator des Th1 genetische Programm 5 ist. Darüber hinaus kann IL-12 sowie IFNy T-bet Ausdruck 6,7 fördern. In der Immunantwort sind Th1-Zellen wichtig für die Wirtsabwehr gegen intrazelluläre Pathogene sowie starke Promotoren von Autoimmunentzündung. Demgegenüber Typ 2-Helfer-Zellen (Th2) erfordern IL-4 für ihre Entwicklung und ihre Effektorfunktion Cytokine, einschließlich IL-4, IL-5 und IL-13, sind für den Antrieb B-Zell-Antworten und sind pathogen Allergie 8, 9. Ähnlich wie Th1-Zellen wurden Th2-Zellen gefunden, um ihre eigenen Master Transkriptionsregulator zum Ausdruck, bezeichnet GATA-3 10,11. Interessanterweise ist das Vorhandensein von polarisierenden Cytokine und die Erzeugung eines spezifischen Th Linie antagonistisch auf die Entwicklung anderer 2,12, was darauf hindeutet, daß nur eine bestimmte Teilmenge Th kann während einer Immunwieder dominantAntwort. Da die Identifizierung der Th1 und Th2-Linien hat weitere Arbeit noch einzigartig Gruppen von T-Helfer-Zellen, einschließlich follikulären helper (TFH), IL-9-produzierenden (Th9) und IL-22-produzierenden (Th22) (kürzlich gezeigt in 13 überprüft). Für die Zwecke der in vitro Differenzierungsexperimente wird dieses Protokoll nur an zwei weiteren Th Subsets konzentrieren, genannt regulatorischen T-Zellen (Treg) und IL-17-produzierenden CD4 + T-Zellen (Th17). CD25 + regulatorische T-Zellen können natürlich (nTreg) im Thymus auftreten; naiven Th-Zellen können auch induziert werden (iTreg) Regulierungs in der Peripherie (in 14,15 prüft) zu werden. Beide Arten von Treg exprimieren eine charakteristische Transkriptionsfaktor, bezeichnet als forkhead Feld P3 (Foxp3), die kritisch für ihre Effektorfunktion Unterdrückungsmechanismen, die lösliche entzündungshemmende Mediatorproduktion, IL-2 -Verbrauch und Zell-Kontakt-abhängige Mechanismen 14,15 enthalten ist. Das Fehlen Foxp3-Expression führt zu einer schweren, Multiorgan-Autoimmunerkrankung bezeichnet Immundysregulation, Polyendokrinopathie, Enteropathie, X-chromosomale Syndrom (IPEX), was die wichtige Rolle dieses Th Teilmenge der Lösung Entzündung und Regel periphere Toleranz gegen Selbst-Antigene 16. In vitro, naive CD4 + T-Helfer-Zellen hochreguliert Foxp3 und sich verpflichtet, die Treg-Programm nach der Stimulation mit IL-2 und TGF-β 14,15. Es kann mäßige bis erhebliche Plastizität in CD4 + T-Zelllinien, vor allem, wenn man bedenkt, nur Zytokin-Produktion (in 17,18 prüft). Jedoch für die Zwecke der in vitro Differenzierungsprotokollen, werden wir uns mit jeder Untermenge als einmalige Linie. Vor kurzem wurde eine Teilmenge von Th17 Zellen, die den IL-17-Zytokin produziert als einmalige Linie mit proinflammatorischen Funktionen, die während Autoimmunentzündung 19-21 besonders pathogene identifizierten. Th17-Zellen exprimieren eine einzigartige Transkriptionsfaktor, genannt Retinoid bezogenen Orphan-Rezeptor gamma t (RORγt), die die Th17 genetische Programm 22 koordiniert. TGF &amp; bgr; ist durch die Induktion RORγt wichtig für die Erzeugung von Th17 Linie. Allerdings ist die Wirkung von TGF &amp; beta Signalisierungs Vermutlich nur veran Th17 Verpflichtung auf synergizing mit IL-6 (in 12 überprüft). Weitere Studien haben gezeigt, dass eine Vielzahl von anderen Signalen, die positiv regulieren Th17 Vereinbarung, einschließlich IL-1β, erhöhte Natrium und TLR 23-26. Andere Berichte haben vorgeschlagen, daß die pathogenen Th17 Zellen in vivo sind diejenigen, die tatsächlich zu umgehen TGFß Signalisierung und sich stattdessen auf eine Kombination von IL-1, IL-6 und IL-23 für ihre Differenzierung 27 verlassen. Somit kann Th17 Zellen aus einer Vielzahl von Signalwegen abgeleitet werden; für die Zwecke dieses Protokolls, die gemeinsam verwendete (TGFß und IL-6) Weg für Th17 Linienfestlegungvorgestellt. Die im folgenden für alle Effektor Linien beschriebenen Differenzierungsprotokollen beruht auf fixierten Antikörper als Stimuli für die TCR und CD28 über den gesamten Verlauf des Experiments. Allerdings haben andere gezeigt, dass TCR-Aktivierung mit Antigen-präsentierenden Zellen 28 oder vernetzendem Anti-CD3 und Anti-CD28-Antikörper mit Hamster-Antikörper für 2 Tage 29 sind auch sehr wirksames Mittel zur Induktion der Erzeugung von verschiedenen Th Teilmengen. Die hier vorgestellte Protokoll baut auf die zuvor berichtete Verfahren zur Isolierung von murinen CD4 + T-Zellen von sekundären lymphatischen Organe 30 und erzeugen Th17 Zellen 31. Ein wichtiger Unterschied ist, dass dieses Protokoll beruht auf der Verwendung eines Zellsortierers, naive CD4 + T-Zellen aus lymphoiden Geweben zu isolieren. Viele Firmen bieten inzwischen schnelle Trennung Kits, die für naive CD4 + T-Zellen anreichern können, die vielleicht die Voraussetzungen f umgehen sein könnenoder Sortier je nach Experiment. Die Methoden und Reagenzien in diesem Protokoll vorgestellt werden sind, was wir routinemäßig und zu finden, um die effektivste. Aber bedenken Sie, dass alternative Reagenzien und Methoden für viele der Schritte im folgenden dargestellt existieren und es ist bis zu den einzelnen Labor, um festzustellen, was am besten für ihre Zwecke zu arbeiten.

<table><tbody><tr><td>Complete RPMI:</td><td></td><td></td><td>Warm in a 37 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C water bath before use</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10 % FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1000X 2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>100X Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100X L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>120 micron nylon mesh</td><td>Amazon</td><td>CMN-0120-10YD</td><td>Cut into 2 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; squares and autoclave</td></tr><tr><td>Alternative: 100 micron cell strainers</td><td>Fisher</td><td>08-771-19</td><td>Alternative to cutting nylon mesh</td></tr><tr><td>autoMACS running buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td>Warm in a 37 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C water bath before use</td></tr><tr><td>autoMACS rinsing solution</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-222</td><td>Warm in a 37 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C water bath before use</td></tr><tr><td>CD4 beads</td><td>Miltenyi</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Cytokines:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human (h) IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse (rm) IL-4</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-6</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>406-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-12</td><td>Peprotech</td><td>210-12</td><td></td></tr><tr><td>hTGFb</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2C11 (anti-CD3)</td><td>BioXcell</td><td>BE0001-1</td><td></td></tr><tr><td>37.51 (anti-CD28)</td><td>BioXcell</td><td>BE0015-1</td><td></td></tr><tr><td>11B11 (anti-IL-4)</td><td>BioXcell</td><td>BE0045</td><td></td></tr><tr><td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td><td>BioXcell</td><td>BE0055</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD62L-FITC</td><td>BioLegend</td><td>104406</td><td>Use at 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD25-PE</td><td>BioLegend</td><td>102008</td><td>Use at 1:400</td></tr><tr><td>anti-CD4-PerCP</td><td>BioLegend</td><td>100434</td><td>Use at 1:1000</td></tr><tr><td>anti-CD44-APC</td><td>BioLegend</td><td>103012</td><td>Use at 1:500</td></tr><tr><td>Phorbol&amp;nbsp; 12-myristate 13 acetate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8139</td><td>Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-0634</td><td>Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>eBioscience</td><td>00-4506-51</td><td>Use at 1:1000</td></tr></tbody></table>

mouse na&#239;ve cd4+ t cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Der Zeitpunkt für die Analyse der Differenzierung in Abhängigkeit von der Th Zustand variieren und getestet, wie die Stärke der T-Zell-Rezeptor-Aktivierung. Nach 2-3 Tagen der Differenzierung, können die Zellen durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht, um das Ausmaß der T-Zellproliferation zu bestimmen. Wells umfassenden Proliferation und Verklumpung der Zellen, die wahrscheinlich für die Analyse am Tag 4. Differenzierung Bedingungen sich auf die Zugabe von exogenem IL-2, wie Th1 und Th2 ist, wird wahrscheinlich erschöpft die Medien nach 4 Tagen in Kultur. Cytokin-Produktion zu maximieren, können solche Vertiefungen mit erschöpften Medien mit frischem RPMI mit IL-2 ergänzt oder gezählt und auf 1 × 10 6 Zellen pro Vertiefung in frischem RPMI, IL-2, um die Unterscheidung für einen Tag oder zwei erstrecken Wieder plattiert mit dieser Methode. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52739/52739fig1.jpg" /> Figure 1. Abbildung der Stiftanordnung, um eine Maus für die Isolierung von Milz und Lymphknoten zu beheben. (A) die Glieder auseinander und befestigen Sie sie mit einer sterilen Nadel oder Dissektion Stift. Von dieser Position aus, schneiden Sie das Fell und Haut in Längsrichtung vom Schwanz bis zum Kinn. (B) Nach dem Schneiden, Spreizen Sie die Haut auseinander, um die Lymphknoten wie in der Abbildung dargestellt aus. Die Orte der Lymphknoten, die leicht aus dieser Position zugänglich sind, werden in der Abbildung aufgeführt. Die Milz ist gerade unter dem Brustkorb auf der rechten Seite des Tieres entfernt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52739/52739fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52739/52739fig2.jpg" /> Abbildung 2. Representative Sortierung Strategie zur Isolierung von naiven CD4 + </sup&gt; T-Zellen durch Zellsortierung. Ausgehend von dem oberen linken, Lymphozyten werden zuerst durch Größe gated und dann Singulett Zellen aus Dublett Zellen unterschieden. Gating auf Singuletts zeigt eine Population von CD4 + CD25 + Zellen, die nTregs sind. Gate an der CD4 + CD25 - Population und Art naiv (CD62L + CD44 -) aus dem Effektor / Memory (CD62L - CD44 +) CD4 + -Zellen. Gestrichelten Linien das Tor Ursprung der nächsten Handlung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52739/52739fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52739/52739fig3.jpg" /> Abbildung 3. Beispieldaten nach in vitro Differenzierung Th. (A) Intraczellulären Zytokin-Färbung Daten von Th1, Th2, iTreg (auf CD4 + gated) und Th17 Differenzierung. Typischerweise nichtlinienspezifischen Zytokine, wie IL-4 und IFN &amp; ggr; für Th17 Kulturen sollte angefärbt, um die Qualität der Differenzierung zu bestimmen. (B) ELISA-Daten folgenden 4 d Th Differenzierung, Waschen und 24 h Restimulation von Zellen mit 1 &amp; mgr; g / ml anti-CD3. (C) in Echtzeit PCR-Daten von linienspezifischen Transkriptionsfaktoren folgenden 4d Differenzierung und Restimulierung für 4 h mit 1 &amp; mgr; g / ml anti-CD3. Alle Gen Mengen wurden normalisiert, um die Expression von β-Aktin und mRNA aus undifferenzierten naiven T-Zellen als Grundlage für die Genexpression zu dienen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52739/52739fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Tabelle 1. Siehe Tabelle unten Werkstoffe. <table border=&quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reagens </td><td> Empfohlene Titration Bereich </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Zytokine: </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche (h) IL-2 </td><td> 5 U / ml - 50 U / ml </td></tr><tr><td> rmIL-4 </td><td> 5 ng / ml - 30 ng / ml </td></tr><tr><td> rmIL-6 </td><td> 5 ng / ml - 30 ng / ml </td></tr><tr><td> rmIL-12 </td><td> 10 ng / ml - 30 ng / ml </td></tr><tr><td> hTGFb (Th17) </td><td> 0,1 ng / ml - 5 ng / ml </td></tr><tr><td> hTGFb (iTreg) </td><td> 5 ng / ml - 30 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Antibodies: </td><td></td></tr><tr><td> 2C11 (anti-CD3) </td><td> 500 ng / ml - 5,000 ng / ml </td></tr><tr><td> 37.51 (anti-CD28) </td><td> 250 ng / ml - 2,500 ng / ml </td></tr><tr><td> 11B11 (anti-IL-4) </td><td> 5.000 - 10.000 ng / ml </td></tr><tr><td> XMG1.2 (anti-IFNg) </td><td> 5.000 - 10.000 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Empfohlene Titration Bereich für die Optimierung der Differenzierung Bedingungen.

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Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

mouse-nave-cd4-t-cell-isolation-vitro-differentiation-into-t-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

51.7K Aufrufe.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals. 

Serie: Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Ableitung von T-Zellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Aus embryonalen Stammzellen der Maus

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis allow the spatial localization and visualization of gangliosides involved in CD4+ T cell activation, that complement expression profiling experiments such as flow cytometry, western blotting or real-time PCR. The quantification of ganglioside expression through flow cytometry and their cellular localization through microscopy can be obtained by the use of anti-ganglioside antibodies with high affinity and specificity. Nonetheless, an adequate handling of cells in suspension involves the treatment of culture plates to promote the necessary adherence required for fluorescence or confocal microscopy acquisition. In this work, we describe a protocol for determining GD3 and GD2 ganglioside expression and colocalization with the TCR during na&#239;ve CD4+ T cell activation. Also, real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells are described for the determination of the GD3 and GM2/GD2 synthase genes, demonstrating that gene analysis experiments can be performed with a low number of cells and without the need of additional low input RNA kits.

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

We describe a standard antibody staining protocol for use in microscopy to determine the membrane expression and localization of gangliosides in resting and activated human na&#239;ve CD4+ T cells. Also described are real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells that do not require additional low input RNA kits.

Herstellung von CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen für die Analyse von GD3 und GD2 Gangliosid Membran-Expression durch Mikroskopie

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly secretes GM-CSF without producing interferon (IFN)&#947; or interleukin (IL)-17 and is found to play an essential role in the autoimmune neuroinflammation. A method of isolation of naive CD4+ T cells from a single-cell suspension of splenocytes and THGM cell generation from naive CD4+ T cells would be a useful technique in the study of T cell-mediated immunity and autoimmune diseases. Here we describe a method that differentiates mouse naive CD4+ T cells into THGM cells promoted by IL-7. The outcome of the differentiation was assessed by the analysis of the cytokines expression using different techniques, including intracellular cytokine staining combined with flow cytometry, a quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR), and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Using the THGM differentiation protocol as described here, about 55% of the cells expressed GM-CSF with a minimal expression of IFN&#945; or IL-17. The predominant expression of GM-CSF by THGM cells was further confirmed by the analysis of the expression of GM-CSF, IFN&#945;, and IL-17 at both mRNA and protein levels. Thus, this method can be used to differentiate naive CD4+ T cells to THGM cells in vitro, which will be useful in the study of THGM cell biology.

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells

Here, we present a protocol to differentiate murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T helper (THGM) cells from naive CD4+ T cells, including isolation of naive CD4+ T cells, differentiation of THGM, and analysis of differentiated THGM cells. This method can be applied to studies of the regulation and function of THGM cells.

In-vitro- Differenzierung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) Maus-Herstellung von T-Helferzellen (THGM)

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

<meta charset="utf8"></head><body>Th17-Zelldifferenzierung aus naiven CD4+ T-Zellen mittels Durchflusszytometrie

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Erreichen einer hochreinen In-vitro-Differenzierung von Th17-Zellen durch Modulation der Zytokinkonzentration

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

In vitro Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen in pathogene Th17-Zellen in der Maus

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

Maus Naive CD4

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Ableitung von T-Zellen

Herstellung von CD4

In vitro Differenzierung von humanen CD4 ⁺ FOXP3 ⁺ Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 ⁺ T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

In-vitro- Differenzierung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) Maus-Herstellung von T-Helferzellen (T_HGM)

Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

In vitro Differenzierung von naiven CD4⁺ T-Zellen in pathogene Th17-Zellen in der Maus

In vitro Differenzierung von naiven CD4⁺ T-Zellen in pathogene Th17-Zellen in der Maus