Agradecemos a membros do laboratório Huse para aconselhamento e assistência. Suportados pelos institutos nacionais de saúde (R01-AI087644 para MH) e P30-CA008748 ao Memorial Sloan-Kettering Cancer Center dos Estados Unidos.

1. preparação de superfícies de vidro estimulatórios
<ol><li>Casaco oito poços septada lamela com biotinilado poli-L-lisina (Bio-PLL) diluído em água destilada, deionizada (ddH2O) 1: 500. Incube durante 30 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Lavar com H2O.</li>
	<li>Seco por 2h em RT.</li>
	<li>Bloco Bio-PLL revestido de superfícies com tampão de bloqueio (HEPES salino [10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl], com 2% de BSA) durante 30 min à RT<ol>
<li>Dissolva 5 mg de poli-L-lysine hydrobromide em 1 mL de 10mm NaPO4, pH 8,5.</li>
		<li>Adicionar 125 μmol (0,55 mg) de NHS-biotina (a partir de um estoque de 100 mg/mL em DMSO) e verificar o pH da reação. Se o pH estiver abaixo de 8,5, adicione 2 μL de 4 N NaOH para elevá-lo a entre pH 8,5 e 9,5.</li>
		<li>Vórtice por 30 min.</li>
		<li>Saciar a reação com 50 μL de 100mm glicina dissolvida em 20 mM Tris de pH 8.0.</li>
		<li>Rotação em potência máxima por 10 minutos e transferir o sobrenadante para um tubo novo. Nota: Qualidade de Bio-PLL é tipicamente em comparação com anteriores preparações por revestimento dois diluíções do material em uma placa de ELISA de 96 poços e quantificar o conteúdo de biotina, após incubação com fosfatase alcalina acoplado streptavidin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire o tampão de bloqueio. Não permita que poços secar. Adicione streptavidin (100 µ g/mL de tampão de bloqueio). Incubar durante 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar em HBS. Preencher e inverter poços de slide de câmara 4 - 5 vezes, removendo HBS dos poços. Não permita que poços secar.</li>
	<li>Adicione o biotinilado pMHC ligantes e moléculas de adesão à superfície. Nota: MCC e óvulos podem ser photocaged pela adição de orto-nitrobenzil com base proteger grupos (por exemplo, nitrophenylethyl (NPE) ou nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) para o grupo ε-amino da chaves lisinas (K12 em MCC, K7 em óvulos). Photocaged MCC e óvulos podem ser obtidos de fornecedores comerciais. Após a reconstituição em tampão aquosa, eles são novamente em modo expressa-eu... Ek e H2-Kb utilizando abordagens estabelecida11,12.</li>
	<li>Validação de peptídeo MCC ou óvulos de photoactivatable<ol>
<li>Decage peptídeos NVOC protegido por irradiação de UV com uma lâmpada UV portátil (ver Tabela de materiais) por 20 min no RT</li>
		<li>Pulso de 1,0 x 105 APCs com 1 µM de peptídeo nonstimulatory (controlo negativo, por exemplo, Hb), não irradiados photoactivatable peptídeo, irradiados photoactivatable peptídeo e peptídeo agonista (controle positivo, por exemplo, MCC) por 1h para durante a noite a 37 ° C.</li>
		<li>Para estimular células T expressam a C. 5 C7/2B4/e TCR, usar células CH12 ou CH27 B. Para estimular as células T OT1, use RMA-s ou células de timoma EL4.</li>
		<li>Misture as APCs pulsados com igual número de células T em 96 poços redondo fundo placas em um volume final de 200 µ l. Incubar a 37 ° C, durante 12-24 h.</li>
		<li>Recuperar os sobrenadantes de cada poço e analisar IL-2 por ELISA com Detecção colorimétrica de peroxidase de rábano-estreptavidina. Nota: A confirmação do status de todos os peptídeos por espectrometria de massa electrospray antes de dobrar em complexos MHC, enjaulamento é altamente recomendável.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute o dobramento e purificação de MHC, a fim de minimizar a exposição à luz. Por exemplo, envolver reações de dobradura em papel de alumínio e realizar a cromatografia de gel filtração com a lâmpada UV. Nota: Tem sido encontrado que photoactivatable MCC-l-Ok e óvulos - H2-Kb induzem a ativação de célula independente de T UV em alta densidade, em decorrência de enjaulamento funcional incompleta. Portanto, o pMHC photoactivatable é diluída em um excesso de x de 10-30 de nonstimulatory pMHC (por exemplo, eu-Ek contendo o peptídeo de64-76 de hemoglobina (Hb)) durante a etapa de imobilização. Isso melhora a relação sinal / ruído do experimento de imagens subsequente.</li>
	<li>Para Fotoativar CD4+ T células, coletivamente, usar uma mistura de biotinilado Hb-l-Ok (3 µ g/mL), biotinilado photoactivatable MCC-l-Ok (0,1 µ g/mL) e anticorpo biotinilado contra a classe eu MHC H2-Kk (0,5 µ g / mL). O anticorpo anti-H2-Kk incentiva 5 C. Células C7/2B4/e T, que expressam o H2-Kk, para espalhar sobre a superfície de vidro sem sofrer ativação.</li>
	<li>Para CD8+ T células, usar uma mistura de biotinilado H2-Db o peptídeo KAVYDFATL do rolamento (1 µ g/mL), photoactivatable biotinilado óvulos-H2-Kb (0,1 µ g/mL) e o domínio extracelular da molécula de adesão ICAM-1 (2 µ g/mL produzido por cultura de células de inseto13). O ICAM-1 incentiva formação próxima contato acoplando a integrina LFA1 na superfície das células T.</li>
	<li>Aplicar todas as misturas de proteínas em tampão de bloqueio, seguido de incubação por 1h no RT ou pelo menos 2 h a 4 ° C. Nota: A densidade molecular em superfícies desse tipo para ser ~ 8000 por µm2 tem sido previamente determinado6. Dado que photoactivatable pMHC representa ~1/30th da proteína biotinilado na superfície, sua densidade será ~ 267 moléculas por µm2, antes da decaging.</li>
	<li>Lave como na etapa 1.6 e deixar na HBS até estar pronto para usar.</li>
	<li>Adicionar 200.000 CD4+ ou CD8+ T células expressando o TCR apropriado em cada poço e permitir que as células a aderir a 37 ° C por 15 min. Uma vez que as células têm anexados e espalhar sobre a superfície, eles estão prontos para fotoativação e de imagem. Nota: Retroviral transdução de células efetoras T com fluorescentes sondas de imagem é descrita em detalhe elswhere6,7. Sinalização de cálcio pode também ser estudada usando pilhas de T untransduced carregadas com o corante de cálcio sensíveis Fluo-4,6. O corante ratiometric Fura-2 não é recomendado porque requer excitação na faixa de UV, que também induz decaging de pMHC a photoactivatable.</li>
</ol>2. aquisição de imagem
<ol><li>Use um microscópio invertido de TIRF equipado com uma lente objetiva de UV compatível 150 X para aquisição de imagens. UV irradiar regiões definidas pelo usuário, usando um sistema de diafragma digital ligado a uma lâmpada de mercúrio 100 W (HBO). Luz desta lâmpada para a amostra, usando um espelho de passe longo 400 nm direta UV.</li>
	<li>Use o software de análise de imagem para photoactivation localizada e aquisição de lapso de tempo. Na maioria dos experimentos, monitorar sondas em ambos os canais vermelhos e verdes usando 488 nm e 561 lasers de excitação de nm, respectivamente. Luz laser é dirigido para a amostra utilizando um espelho dicroico dual-bandpass que também transmite na faixa de UV (para habilitar decaging). Consulte a Tabela de materiais e a Figura 6 para obter informações adicionais sobre configuração de microscópio.</li>
	<li>Depois de montar o slide de câmara que contém as células T, ajuste as configurações para obter iluminação TIRF ou epifluorescência, conforme necessário. No modo de viver, selecione um campo de células que expressam a fluorescente ição de interesse. Estabelece regiões mícron-escala para photoactivation abaixo usando o software de controle de células individuais.</li>
	<li>Começa a aquisição de lapso de tempo. Normalmente, 80 momentos são adquiridos, com um intervalo de 5 s entre cada ponto de tempo. Isso deixa o tempo mais que suficiente para sequencial 488 nm e 563 exposições nm, no caso de experimentos de cor dupla.</li>
	<li>Após 10 momentos, Fotoativar as regiões selecionadas pela abertura do diafragma digital do obturador para 1-1.5 s.</li>
	<li>Após o lapso de tempo completo, selecione um novo campo de células e repita o processo.</li>
</ol>3. análise de dados
Nota: Photoactivation localizada de ligantes imobilizados cria um bem definido, estacionário estimulatórios que pode ser usado para análise quantitativa de sinalização respostas e eventos de remodelação do citoesqueleto. Análise de protocolos normalmente envolvem ou quantificar a intensidade de fluorescência na região irradiada ou usando a região irradiada como um ponto de extremidade posicional para medições de distância (por exemplo. para avaliar a polarização da centrossoma para o região irradiada). Ambos os protocolos de análise são descritos abaixo. Vários programas de análise de imagem interativo podem ser usados para fazer a intensidade e medições de distância, que podem então ser saída para processamento adicional e análise.
<ol><li>
Intensidade de fluorescência
	<ol>
<li>Determine a intensidade de fluorescência (FI) de uma região de fundo fora da célula (FIb). Isto será usado para a correção de fundo.<ol>
<li>Desenhe uma região quadrada micro-empresas fora da célula e fazer uma máscara. Para determinar a intensidade da fluorescência, clique no Analyze | Mascarar as estatísticas. Selecione Significa intensidade de fluorescência e os valores de exportação. Nota: Detalhes processuais (por exemplo, 3.1.1.1) referem-se ao software Slidebook (ver Tabela de materiais). Implementação do presente protocolo usando outros pacotes de software (ex., FIJI) será ligeiramente diferente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determine o FI dentro da região de fotoativados por cada ponto de tempo.<ol>
<li>Selecione máscara para destacar a região que foi fotoativados. Para determinar a intensidade da fluorescência, clique no Analyze | Mascarar as estatísticas. Selecione Significa intensidade de fluorescência e os valores de exportação.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Subtrai o fundo FI a partir dos valores medidos de FI dentro da região. Então, normalizar as medições FI corrigidas dividindo pela média, fundo corrigida FI dos primeiros 9 quadros antes de fotoativação. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). Nota: Gráfico ΔF/F como uma função do tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Distância
	<ol>
<li>Obter o x e y coordenadas do centro da região fotoativados.<ol>
<li>Para determinar o x e y coordenadas do centro da região fotoativados, selecione máscara para destacar a região que foi fotoativados. Uma vez que a região de fotoativação é realçada, selecione Analyze | Mascarar as estatísticas | Centro de área e exportar os valores.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determinar o x e y coordenadas para a sonda fluorescente de interesse para cada ponto de tempo. Isto geralmente é conseguido através de partícula manual ou automatizada de rastreamento.<ol>
<li>Para determinar o x e y coordenadas da sonda fluorescente de interesse, selecione Manual de controle de partículas e clique sobre a sonda fluorescente de interesse ao longo do tempo. Uma vez que todos os pontos de tempo foram controlados, selecione Analyze | Mascarar as estatísticas | Centro de área e exportar os valores.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcular a distância entre a proteína fluorescente de interesse e o centro da região fotoativados por cada ponto de tempo usando a equação: distância = √ ((x2x -1)2+ (y2y -1)2), em que X2e y 2 são as coordenadas da proteína fluorescente de interesse e x1 e y1 são as coordenadas do centro da região fotoativados.</li>
		<li>Gráfico da distância em função do tempo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse.">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).</li><li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Synapse+Formation:+Cell+Polarity+During+T+Cell-APC+Interaction.">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading:+A+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT.">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li><li>Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Function+of+the+Immunological+Synapse+from+Studies+with+Supported+Planar+Bilayers.">Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers.</a> Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).</li><li>Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. 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J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+diacylglycerol+drives+the+polarization+of+the+microtubule-organizing+center+in+T+cells.">Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells.</a> Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).</li><li>Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+variable+hinge+region+of+novel+PKCs+determines+localization+to+distinct+regions+of+the+immunological+synapse.">The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse.</a> PLoS One. 9, 1-8 (2014).</li><li>Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+T+cell+receptor+binding+to+peptide-MHC:+evidence+for+a+general+mechanism+of+molecular+scanning.">Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).</li><li>Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-A2-peptide+complexes:+refolding+and+crystallization+of+molecules+expressed+in+Escherichia+coli+and+complexed+with+single+antigenic+peptides.">HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 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Cell Biol. 192, 675-690 (2011).</li><li>Nguyen Duc, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Generalizable+Platform+for+the+Photoactivation+of+Cell+Surface+Receptors.">A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors.</a> ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).</li><li>Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling.">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration.">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+improved+light-induced+dimer+(iLID)+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins.">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).</li><li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+cell+function+using+engineered+photoreceptors.">Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors.</a> Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).</li><li>Grusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+precise+activation+of+engineered+receptor+tyrosine+kinases+by+light.">Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light.</a> EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage.">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Nos últimos anos, a luz tem emergido como uma excelente ferramenta para activação spatiotemporally controlada dos processos celulares. Várias metodologias têm sido desenvolvidos, cada um com as desvantagens e vantagens associadas. O sistema descrito aqui, que se baseia o decaging de ligantes extracelulares, imobilizados, é ideal para a análise das respostas de sinalização rápidas, subcellular, polarizadas. Esta abordagem tem sido aplicada para examinar a formação é em células T conforme descrito acima. Adicionalmente, enjaulados ligantes para outros receptores tem sido projetados, permitindo-nos aplicar a mesma estratégia para avaliar a sinalização inibitória em células de morte natural e translocação nuclear do fator de transcrição NF-κB em resposta ao pedágio como receptor sinalização de14,15.
Neste protocolo, estimulatórios ligantes são imobilizadas para garantir que eles permaneçam como fonte estacionária, polarizada de estimulação para a duração da experiência de imagem. Esta abordagem é bem adequada para estudos de polarização de célula. Convém, no entanto, que a abordagem de fotoativação TCR é facilmente adaptada para ativação temporalmente controlada de células T na bilayers do lipid suportados. Obviamente, uma pessoa não pode realizar estimulação sustentada, polarizada neste contexto. No entanto, isto pode ser desnecessário, dado os objectivos experimentais.
O sistema também é bastante flexível com relação a fonte de luz UV para decaging. Atualmente, uma lâmpada de 100 W Hg é usado para a iluminação focada, no entanto, um laser de nitrogénio pulsado (pulso largura 4 ns, mJ de energia de 120 de pulso), foi utilizado anteriormente6. Às vezes, uma lâmpada UV portátil (365 nm, 4 W) foi posicionado sobre a amostra de imagens para decage maiores regiões de ligante de photostimulatable. As características específicas do sistema de decaging em cada caso dependerá os requisitos técnicos do experimento em questão.
Ao implementar este sistema, é importante confirmar que as respostas observadas são específicas para o evento de fotoativação e não o resultado da ativação de receptores espúrias ou Fotodano induzido por UV. Para excluir esses artefatos, dois controles de especificidade podem ser executadas. Primeiro, a intensidade de fluorescência em células que não são diretamente irradiado durante experimentos photoactivation pode ser monitorada. Se a superfície estiver devidamente enjaulado, apreciável respostas nestas células não devem ser observadas (por exemplo, a Figura 5). Em segundo lugar, experiências em que T células são irradiados em superfícies faltando photoactivatable ligantes UV podem ser executadas. Este controle é fundamental para a identificação de efeitos de UV-induzido que são independentes de ligante de photoactivatable (por exemplo, consulte Referência 6). Durante a otimização do sistema, também é extremamente útil ter à mão uma robusto de imagem resposta celular (por exemplo, Grb2-GFP recrutamento) que seja rápida e localizada. Avaliar as correlações entre eventos de sinalização e photoactivation é muito mais simples se esses eventos são spatiotemporally proximais à estimulação do receptor.
Embora a abordagem photoactivation oferece requintado spatiotemporal controle sobre receptores de sinalização, falta-lhe a capacidade de adaptação oferecida pela optogenetic transfectable sistemas16,17,18,19 ,20,21,22. Certas proteínas optogenetic também são photoreversible, fornecendo controle condicional que não está disponível com a abordagem de fotoativação descrita aqui. Em sistemas de optogenetic, no entanto, restringindo a difusão das proteínas fotoativados é tecnicamente desafiador. Isso complica a análise de sinalização polarizada, particularmente em um contexto subcellular.
Note também que a entidade envolvente deste sistema photoactivation é uma superfície de vidro, que não pode recapitular todos os aspectos de uma interação célula-célula boa-fé. Para contornar esse problema, mantendo o controle spatiotemporal de iniciação de sinal, os investigadores usaram um sistema óptico de armadilha para trazer um APC em contato com uma célula T, permitindo o aparecimento de rearranjos do citoesqueleto e maturação é para ser visualizado em tempo real23. Embora este sistema permite a iniciação precisa e a visualização da dinâmica do citoesqueleto usando um APC real, é relativamente baixa taxa de transferência e não é compatível com iluminação TIRF, que afeta negativamente a qualidade da imagem.
Em conclusão, o método descrito neste protocolo fornece controle spatiotemporal de induzida pelo TCR sinalização dentro da célula T, em última análise, permitindo a elucidação das alterações bioquímicas rápido após a ativação do TCR. Este sistema nos fornece um meio para compreender melhor como os eventos de sinalização seguindo a ativação de TCR promovem a polarização de célula T, é formação e, finalmente, a entrega das respostas efetoras.

Linfócitos T (células T) desempenham um papel central na imunidade celular, reconhecendo peptídeos antigênicos exibidos no contexto da superfície de células MHC. Reconhecimento do antígeno, que é mediado pelo TCR, dirige a diferenciação de células T de ingênuo e promove a entrega de respostas citolíticas e comunicativas por populações efetoras. Noivado de TCR também induz mudanças dramáticas na arquitetura celular. Em poucos minutos, as células T cisma no lado da célula apresentadora de antígeno (APC), formando uma interface polarizada conhecida como sinapse imunológica (IS)1,2. A IS potencializa respostas de células T efetoras, permitindo o lançamento direcional de citocinas ou, no caso dos linfócitos T citotóxicos (CTLs), proteínas líticas que destruir o APC.
Noivado de TCR por pMHC induz a rápida fosforilação de várias moléculas de adaptador a jusante, incluindo o vinculador para as células de ativação de T (LAT), que, finalmente, promove a remodelação robusto do citoesqueleto sináptica2. Actina filamentosa cortical (F-Actina) conduz a célula T, espalhando sobre a superfície da APC e então resolve em uma estrutura anular caracterizada pelo acúmulo de F-Actina na periferia IS e depleção do centro. Formação de anel F-Actina é rigidamente acoplada a reorientação do centro organizador de microtúbulos (MTOC, também chamado a centrossoma em células T) para uma posição abaixo do centro da interface. Ambos os eventos ocorrem em poucos minutos de reconhecimento inicial do antígeno e estabelecer o contexto arquitetônico em que eventos de ativação subsequente e efetoras respostas ocorrem.
Para estudar a formação de IS, vários laboratórios desenvolveram abordagens em que o APC é substituído por uma superfície de vidro que contém ligantes TCR imobilizados ou suporta uma bicapa lipídica que em si contém o ligantes3,4. Células T formam IS-como contatos nestas superfícies que pode ser fotografada por microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) ou microscopia confocal, permitindo estudos de alta resolução do início da ativação de células T e formação de IS.
Embora essas abordagens têm permitido para excelente visualização do IS totalmente montado, grande parte da sinalização da seguinte ligadura TCR:pMHC ocorre em segundos, complicando os esforços para determinar a sequência de eventos após a ativação de TCR com precisão . Para contornar esse problema, uma abordagem de fotoativação foi desenvolvida, em que photoactivatable pMHC é usado para obter um controlo spatiotemporal de TCR ativação5,6,7. Neste sistema, as células T estão conectadas em superfícies de vidro contendo photoactivatable pMHC que é não-estimulatório de TCR até irradiadas com luz ultravioleta (UV). Irradiação UV de uma região de mícron de tamanho da superfície abaixo da célula T remove o photocage criando uma zona estimulatório que pode ser reconhecida pela célula T. Sinalização de eventos subsequentes e remodelação do citoesqueleto são então monitorados usando repórteres fluorescentes geneticamente codificados. Duas versões de photoactivatable de peptídeos antigênicos, traça citocromo c88-103 (MCC) e no257-264 ovalbumina (OVA), que são apresentados no contexto da classe II MHC-eu... Ek e classe de MHC H2-Kb, respectivamente, foram desenvolvido (Figura 1). Isto permite a análise de ambos CD4+ T células específicas para MCC-l-Ok (expressando o 5 C. C7, 2B4, ou e TCRs) e CD8+ T células específicas para óvulos-H2-Kb (expressando o TCR OT1).
Na última década, a abordagem de fotoativação e imagem latente de TCR tem sido utilizada para estabelecer a cinética precisa de TCR primeiros passos de sinalização e também para identificar as vias moleculares que regem a remodelação do citoesqueleto polarizada5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. por exemplo, o ensaio foi fundamental na determinação que centrossoma reorientação em direção a APC é mediada por um gradiente localizado do lipídios segundo mensageiro diacilglicerol centrado no IS. Prevê-se que esta metodologia continuará a ser valioso para aplicações que exigem análise de imagens de alta resolução da função da célula T.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1152">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155361</td>
			<td style="width:443px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">20217</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td>Will be used to biotinylate proteins</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated Hb I-EK&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-MCC I-EK&#160;</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated &#945;H2-Kk antibody</td>
			<td style="width:211px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-OVA H2-Kb</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated KAVY H2-Db&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated ICAM1&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Hand held UV lamp</td>
			<td style="width:211px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">UVGL-25</td>
			<td>Lamp is held &#60; 1 cm from the sample.&#160; 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Olympus IX-81 OMAC TIRF system.</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Additional information about the imaging system can be found in Figure 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Mosaic digital diaphragm</td>
			<td style="width:211px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:379px;">Slidebook software</td>
			<td style="width:211px;">Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial and temporal control of t cell activation using a photoactivatable agonist

Linfócitos T envolver-se na rápida, polarizado sinalização, ocorrendo dentro de minutos após a ativação do TCR. Isto induz a formação de sinapse imunológica, uma junção de célula-célula estereotipadas que regula a ativação de células T e metas direcionalmente respostas efetoras. Para estudar estes processos efetivamente, é necessária uma abordagem de imagem que é adaptada para a captura de respostas rápidas, polarizadas. Este protocolo descreve um sistema, que é baseado em um photoactivatable do peptide-major formando um complexo (pMHC) que é não-estimulatórios até que ele é exposto à luz ultravioleta. Decaging alvo estes reagentes durante experimentos de tele-microscopia permite controle spatiotemporal preciso da ativação do TCR e monitoramento de alta resolução de respostas celulares subsequentes por reflexão interna total (TIRF) de imagem. Essa abordagem também é compatível com estratégias de perturbação genética e farmacológicas. Isso permite que o conjunto das vias moleculares bem definidos que link TCR sinalização para a formação das estruturas do citoesqueleto polarizadas que fundamentam a sinapse imunológica.

A abordagem de fotoativação e de imagem permite a observação e facile quantificação das respostas de sinalização rápidas, polarizadas. Para ilustrar suas capacidades, reproduzidas aqui, é um experimento examinando a spatiotemporal correlação entre acumulação de DAG TCR-induzida e de reorientação centrossoma. 5 C. Explosões de célula C7 T retrovirally foram transfectadas com dois repórteres fluorescentes: um biossensor DAG que contém os domínios de C1 em tandem da proteína quinase C-θ ligado ao GFP (C1-GFP) e RFP-tubulina para monitorar a centrossoma. As células T foram então anexadas ao septadas lamela contendo photoactivatable MCC-eu-Ek. C1-GFP foi fotografada usando microscopia TIRF e RFP-tubulina no modo de epifluorescência. Como mostrado na Figura 2, photoactivation localizada da superfície abaixo da célula T induz o acúmulo de DAG na zona irradiada. Isto é seguido dentro de segundos a reorientação da centrossoma para a mesma região.
Acumulação de C1-GFP pode ser quantificada calculando a intensidade de fluorescência normalizado, após a correção de fundo, no centro da região fotoativados ao longo do tempo (Figura 3). Reorientação do centrossoma em resposta a fotoativação pode ser quantificada calculando a distância entre o centro da região fotoativo e a centrossoma em função do tempo (Figura 4).
Esse método pode ser usado para examinar uma ampla gama de respostas sinalização rápidas, polarizadas, basicamente qualquer coisa que pode ser monitorado usando uma sonda fluorescente. Por exemplo, photoactivation TCR é utilizado para monitorar o início da formação microcluster sinalização usando Grb2 fluorescente etiquetadas (Grb2-GFP) (Figura 5). Semelhante à acumulação de DAG e respostas de reorientação do centrossoma, Grb2-GFP polarização ocorre logo após a fotoativação (Figura 5) e pode ser quantificada através da abordagem de intensidade de fluorescência normalizados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig1.jpg"> Figura 1: Sistema de fotoativação usando photocaged peptídeo MCC. (A) Photocaged estratégia de peptídeo MCC. Um grupo NPE é anexado para o resíduo de lisina do peptide MCC. Irradiação UV resulta na remoção de NPE, restaurando o MCC para sua forma nativa. (B) quando NPE está vinculado a MCC, a C. 5 TCR C7 não pode vincular a MCC. Remoção de NPE resulta em reconhecimento o 5 C. TCR C7 para o nativo do peptide MCC. (C) a estratégia de photocaged foi adaptada para trabalhar com as células T CD8 +, no qual photocaged peptídeo de óvulos é usado para ativar o TCR OT-1 após irradiação UV.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig2.jpg"> Figura 2: Montagem do tempo-lapso de DAG acumulação e centrossoma reorientação photoactivation de TCR em C. 5 a seguir Células T de C7. 5 C. Célula C7, expressando um biossensor de DAG, contendo em tandem C1-domínios da PKC - fundido a GFP (C1-GFP) e Tag-RFP tubulina (RFP-banheira), um repórter fluorescente para a centrossoma. As montagens de ilustram a resposta polarizada de 5 C. Células T C7 ao longo do tempo. O texto e o oval amarela indicam o tempo e o local de fotoativação. Ao longo do tempo, C1-GFP acumula-se na região fotoativados, seguida por reorientação centrossoma fotoativados atacaram a região. Barra de escala: 10 µm.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig3.jpg"> Figura 3: Quantificação de acumulação de DAG na região fotoativo Acumulação de DAG, C1-GFP, na região de fotoativados (à esquerda) pode ser quantificada calculando a intensidade de fluorescência normalizado, após a correção de fundo, na região de fotoativados (círculo amarelo com sombreamento azul) ao longo do tempo. Dados são normalizados em relação os nove quadros obtidos antes de fotoativação. Enriquecimento de C1-GFP na região fotoativados pode ser calculado pela divisão da intensidade média de fluorescência na região irradiada pela intensidade média de fluorescência da célula inteira, após a correcção de fundo. A equação: ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)), na qual FI é a intensidade da fluorescência média, pode ser usado para calcular a intensidade de fluorescência normalizados. A intensidade de fluorescência normalizado na região fotoativados pode então ser graficamente em função do tempo (à direita). Linha roxa indica o tempo de fotoativação. Barra de escala: 10 µm.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig4.jpg"> Figura 4: Quantificação de reorientação centrossoma. Determine as coordenadas da centrossoma (RFP-banheira) ao longo do tempo controlando manualmente o caminho de centrossoma em direção a região fotoativados (seta branca) em cada ponto de tempo (à esquerda). Determine as coordenadas do centro da região fotoativados (círculo amarelo). A distância entre o centro da região fotoativo e a centrossoma pode ser calculada em cada ponto de tempo usando a equação para a distância = √ ((x2x -1)2+ (y2y -1)2), em que x2 e y 2 são o x e y coordenadas para o centro da área da centrossoma e x1 e y1 são x e y coordenadas do centro da região fotoativados. A distância da centrossoma do centro da região fotoativados cada época ponto então pode ser graficamente em função do tempo (à direita). Linha roxa indica o tempo de fotoativação. Barra de escala: 10 µm.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig5.jpg"> Figura 5: Formação de microcluster Grb2-GFP. (A) representante 5 C. Célula C7 expressando fluorescente etiquetado Grb2 (Grb2-GFP). As montagens de ilustram a resposta polarizada extras Grb2-GFP. O texto e o oval amarela indicam o tempo e o local de fotoativação. Ao longo do tempo, Grb2-GFP acumula-se na região fotoativados. (B) a quantificação da intensidade de fluorescência Grb2-GFP na região fotoativados ao longo do tempo. N = 15 células. (C) a quantificação da intensidade de fluorescência Grb2-GFP em uma região de controle fora da zona de fotoativados. N = 15 células.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig6.jpg"> Figura 6: Configuração de microscópio para fotoativação e TIRF imagem. 488 nm e 561 nm de lasers é usados para TIRF e imagem latente de epifluorescência de sondas de verdes e vermelhas, respectivamente. Luz para photoactivation UV é tirado de uma lâmpada de mercúrio (Hg) conectada a um sistema de diafragma digital capaz de iluminantes regiões pequenas, definido pelo usuário. Luz da lâmpada Hg/diafragma é refletida para a amostra por um espelho longpass posicionado abaixo do espelho dicroico que reflete os lasers de imagem. O espelho dicroico deve ser projetado para passar UV luz. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56655/56655fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Controle espacial e Temporal da ativação de células T usando um agonista Photoactivatable

Este protocolo descreve um método baseado em imagem para ativar os linfócitos T usando photoactivatable peptídeo-MHC, permitindo um controle preciso da ativação de células T spatiotemporal.

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.2K visualizações.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Este protocolo descreve um método baseado em imagem para ativar os linfócitos T usando photoactivatable peptídeo-MHC, permitindo um controle preciso da ativação de células T spatiotemporal.

Vídeo: Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Imunologia e Infecção

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Antígeno Artificial célula apresentadora de ativação mediada (AAPC) e expansão de células T Natural Killer

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Estática Adesão Ensaio para o Estudo da integrina Ativação em Linfócitos T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

Imagem altamente multiplexada e de super resolução de células T usando madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Avaliação das respostas de células T Zika vírus específicos em órgãos Immunoprivileged de infectados Ifnar1- / - ratos

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...