Wir danken Alice Gaughan und Jiao-Jing Wang, dessen hervorragende technische Unterstützung, geistigen Input und moralische Unterstützung waren maßgeblich an der Bewegung dieser Studien vor. Diese Studien wurden von der NIH AI036532 zur GAH unterstützt.

Ein. Lethal Bestrahlung <ol><li> Platzieren bis 10 Empfängermäuse in einen Käfig Mikroisolator kompatibel mit dem Bestrahler verwendet werden. </li><li> Strahlen in 2 gleich große Dosen Summierung Gesamtdosis (Gesamtdosis = 9 cGy für BALB.B Empfänger). Zweiten Bestrahlung sollte 3 h nach der ersten. Die Injektion sollte zwischen 4-6 Stunden nach der letzten Bestrahlung auftreten. Bestrahlen Mäuse in beiden Cs 137 Quelle oder RS2, 000, Strahler. </li><li> Im Anschluss an die zweite Strahlungsdosis, speichern Mäuse in Mikroisolator Käfig mit angesäuertem Wasser bis zum Zeitpunkt der Transplantation. </li></ol> 2. Splenozyten Vorbereitung <ol><li> Einschläfern einem Spender Maus nach den Richtlinien des Instituts. Jeder Spender in der Regel ergibt 75x10 6 - 125x10 6 Splenozyten. Mit CD8 Aufreinigungskits, jede Maus in der Regel ergibt 6x10 6 - 12x10 6 CD8 T-Zellen. </li><li> Entfernen der Milz, indem man zuerst eine vertikale 2 cm lange Inzision 2 cm rechts von der Mittellinie direktunter dem Brustkorb. Schnitt durch das Fell, Haut und viszeralen Membran. </li><li> Entfernen der Milz und erstellen Einzelzellsuspension indem Milz in 40 ul Sieb in eine Petrischale mit 1640 RPMI mit 5% FBS. Verwenden Sie einen Spritzenkolben auseinander zu brechen, die Milz, bis die gesamte Milz durch Sieb verabschiedet worden. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden WT und L2G85.B6 Spender. Sammeln Sie alle WT einzelnen Zellsuspensionen in 1-50 ml konischen Röhrchen, und sammeln Sie alle L2G85.B6 einzelnen Zellsuspensionen in einem separaten 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 1.200 Upm für 10 min bei 4 ° C. Resuspendieren Pellets in 1640 RPMI mit 5% FBS und Graf Zellen. </li></ol> 3. Bone Marrow Vorbereitung <ol><li> Entfernen Sie die Haut von einem Hinterbein eines Spenders Maus. </li><li> Vorsichtig weggeschnitten so viel Muskelgewebe wie möglich von Femur und Tibia / Fibula. </li><li> Entfernen Hinterbein indem Femur derzeit Hüftgelenk. Schneiden Sie Hinterpfote knapp unter Tibia / Fibula Kreuzung. Alle Knochenschnitte sollte durch robuste Schere werden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig restlichen Muskelgewebe. Abgeschnitten Wadenbein-relativ wenig Knochenmark in Fibula gefunden und die Mühe nicht wert. </li><li> Zeigen Hinterbein in kaltem 1640 RPMI 5% FBS und wiederholen Sie den Vorgang mit dem zweiten Hinterbein. 40x10 6 Knochenmarkszellen - Jede Maus sollte zwischen 20x10 6 ergeben. </li></ol> 4. Bone Marrow Removal <ol><li> Entfernen ein Hinterbein von Medien und in großen Petrischale mit einer kleinen Menge kaltem Medium (~ 1 ml). </li><li> Schneiden Sie das Kniegelenk. Verwendung einer Spritze (Volumen&gt; 5 ml), Insert subkutanen Nadel in Tibia und niederdrücken Spritze bis das gesamte Material von roten Inneren Tibia entfernt wird. Wiederholen Sie den Vorgang mit Femur. Verbleibende Knochen frei von Knochenmark. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem zweiten Hinterbein. </li><li> Erstellen einzigen Zellsuspension durch Pipettieren Medien mit Knochenmark in großen Petrischale und Nutzung Spritzenkolben und 40 ulMaschensieb. Pipette einzigen Zellsuspension in 50 ml konischen Röhrchen und auf Eis. </li></ol> 5. CD3 Depletion Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten, CD3 +-Zellen aus dem Knochenmark abzureichern. Unser Labor verwendet ein Set von Miltenyi Biotec (CD3-Biotin - 130-093-021) hergestellt. Abzureichern CD3 +-Zellen aus dem Knochenmark nach Herstellers bestimmt. Der Puffer für Miltenyi Kits wird fortan als MACS-Puffer (2 mM EDTA, 0,5% BSA in PBS, pH 7,2) werden. <ol><li> Waschen der Zellen durch Zentrifugation Splenozyten und Knochenmarkszellen bei 1200 UpM für 10 min bei 4 ° C und Zählung Zellen. </li><li> Entfernen Sie alle Überstand. Resuspendieren Knochenmarkzellen in 100 ul pro 10 Millionen Knochenmarkszellen in MACS-Puffer. </li><li> Fahren Sie mit CD3 Depletion mit fertigt &#39;Protokoll. </li><li> Waschen CD3 verarmte Knochenmarkzellen 3 mal in sterilem PBS. Graf CD3 abgereichert Knochenmarkzellen und resuspendieren in einem geeigneten Volumen auf 10 7 Zellen zu injizieren. </li></ol> Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten, um CD8 + T-Zellen von Mäusen L2G85.B6 reinigen. Auch gibt es mehrere Möglichkeiten, um CD8 + T-Zellen aus Splenocyten WT Spendern führen. Unser Labor verwendet Kits von Miltenyi Biotec (CD8 Depletion - 130-049-401, CD8 Reinigung - 130-095-236). <ol><li> Resuspendieren des WT Pellet in 90 ul MACS Puffer pro 10 7 Zellen. Fahren Sie mit CD8 T-Zell-Depletion nach Hersteller &#39;Protokoll (CD8 Depletion - 130-049-401). </li><li> Resuspendieren L2G85.B6 Pellet in 40 ul MACS Puffer pro 10 7 Zellen. Fahren Sie mit CD8 T-Zell-Reinigung nach Hersteller &#39;Protokoll (CD8 Reinigung - 130-095-236). </li><li> Zählen Sie jeden Zellpopulation und waschen jeder Population 3 mal mit sterilem PBS. Resuspendieren jeder Population in ausreichender Menge, um 18x10 6 WT (CD8 abgereichertes) Splenozyten und 2x10 6 L2G85.B6 gereinigt CD8 T Zellen zu injizieren. </li></ol>7. Injection Vorbereitung <ol><li> Kombinieren Sie 10 7 CD3 erschöpft Knochenmarkszellen, 18x10 6 WT (CD8 abgereichertes) Splenozyten und 2x10 6 L2G85.B6 gereinigt CD8 T-Zellen in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen mit sterilem PBS und resuspendieren in 300 ul. </li><li> Inject Zellpräparation in die Schwanzvene von Empfängermäuse. Injektionen sollte mit 28 Gauge-Nadeln werden. </li><li> Shop Mäuse in Mikroisolator Käfig mit angesäuerten Wasser. Ergebnis Mäuse täglich mit Scoring GVHD Scoring-System von Cooke et al 1 entwickelt. </li></ol> 8. Bioluminescent Imaging <ol><li> Sechs Tage nach der Transplantation, injizieren Empfängermäuse mit 4 mg D-Luciferin. Lassen Sie 5 min zur Luciferin mit Luciferase reagieren. </li><li> Anesthetize Maus in Isofluran Kammer des Biolumineszenz-Imager und Bild Empfänger für 5 min mit kleinen Binning. Dadurch wird eine hohe Auflösung beim Sammeln so viele Veranstaltungen wie möglich. </li><li> Analysieren von Daten mit WohnzimmerImage-Software. Der Maßstab der Pseudo-Farbbildes verändert werden, um die besten Ergebnisse zu ergeben. Allerdings ist es unabdingbar, dass die gleiche Größenordnung in Experimenten verwendet werden. </li><li> Interessierenden Regionen können mit Lebend Image Software und Licht Emittanz kann durch Berechnen des Flusses (Photonen / sec) von jedem interessierenden Bereich emittiert quantifiziert werden kann. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Etwa 7-10 Tage nach der Transplantation beginnen Mäusen klinischen Anzeichen von GVHD. Mäuse erscheinen scruffy wegen des Mangels an Pflege. Die Empfänger werden auch damit beginnen, Gewicht zwischen 7-10 Tage nach der Transplantation zu verlieren. Aktivität und Haltung Empfängermäuse bleibt relativ normal, bis ca. Tag 12-14 nach der Transplantation. Kumulierte GVHD Partituren wird stetig durch den ersten 2-3 Wochen nach der Transplantation (Abbildung 1A) erhöhen. Krankheitsverlauf ist sehr variabel zwischen Mäusen, aber Empfänger sollten gleichmäßig erliegen um 30-40 d GVHDays nach der Transplantation (Abbildung 1B). Abbildung 2 zeigt Empfängermäuse, die 6 Tage nach der Transplantation abgebildet wurden. Pseudo-farbigen Skala zeigt variierende Licht Emittanz während des Körpers mit der höchsten Lichtstärke in der Milz und dem Darm emittiert. CD8 T-Zell-Anreicherung im Darm ist konsistent mit früheren Feststellungen 6. Empfängermäuse kann wieder in Mikroisolator Käfig platziert werden, um zu einem späteren Zeitpunkt abgebildet werden euthanasiert oder zur ex vivo Bildgebung. <table border="1"><tbody><tr><td> Kriterien </td><td> Grade 0 </td><td> Grade 1 </td><td> Grade 2 </td></tr><tr><td> Gewichtsverlust (wkly.) </td><td> &lt;10% </td><td> &gt; 10% - &lt;25% </td><td> &gt; 25% </td></tr><tr><td> Haltung </td><td> Normal </td><td> Gebeugt nur in Ruhe </td><td> Mehrere gebeugt; beeinträchtigt movement </td></tr><tr><td> Aktivität </td><td> Normal </td><td> Leichte bis Abnahme der Aktivität moderieren </td><td> Stationäre es sei denn, stimuliert </td></tr><tr><td> Fur texture </td><td> Normal </td><td> Leichte bis mäßige zerzauste </td><td> Schwere Kräuseln / schlechte Pflege </td></tr><tr><td> Hautstruktur </td><td> Normal </td><td> Skalierung der Pfoten / tail </td><td> Offensichtliche Bereichen entblößt Haut </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Cooke et al entwickelte diese Scoring-System in 1996 1. Mäuse sollten täglich auf jedes der Kriterien auf der linken gewertet. Jede Maus wird eine Punktzahl von 0-2 für jedes Kriterium gegeben und die Gesamtpunktzahl ist die Summe aller einzelnen Noten. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig1.jpg" /> Abbildung 1. Letal bestrahlten BALB.B wurden mit 10 7 Knochen transplantiertKnochenmarkzellen allein oder mit 18x10 6 CD8 T-Zell-Depletion WT Splenozyten und 2x10 6 gereinigt L2G85.B6 CD8 T-Zellen. A) Clinical Score-Daten von Empfängern von Knochenmark allein oder mit CD8 T-Zell-Depletion WT Splenozyten und gereinigt L2G85.B6 CD8 T-Zellen. B) Survival Daten von Empfängern von Knochenmark allein oder mit CD8 T-Zell-Depletion WT Splenozyten und gereinigt L2G85.B6 CD8 T-Zellen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3697/3697fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig2.jpg" /> Abbildung 2. Letal bestrahlten BALB.B Mäuse wurden mit 10 7 Knochenmarkzellen allein oder mit 18x10 6 CD8 T-Zell-Depletion WT Splenozyten und 2x10 6 gereinigt L2G85.B6 CD8 T-Zellen transplantiert. Empfänger wurden mit 4 mg D-Luciferin über intraperitoneale Injektion injiziert und wurden unter Verwendung Xenogen IVIS 5 min bei kleinen Binning. PsEudo-farbigen Bilder werden gezeigt, wo Purpur stellt geringer Intensität und Rot steht für hohe Intensität Regionen von Interesse rund um die gesamte Maus und Gesamtfluss (Photonen / sec) gezogen wurden quantifiziert. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig3.jpg" /> Abbildung 3. Letal bestrahlten BALB.B Mäuse wurden mit 10 7 Knochenmarkzellen allein oder mit 18x10 6 CD8 T-Zell-Depletion WT Splenozyten und 2x10 6 gereinigt L2G85.B6 CD8 T-Zellen transplantiert. Empfänger wurden mit 4 mg D-Luciferin über intraperitoneale Injektion injiziert und wurden unter Verwendung Xenogen IVIS 5 min bei kleinen Binning. Pseudo-farbigen Bilder werden gezeigt, wo Purpur stellt geringer Intensität und Rot steht für hohe Intensität. Die Empfänger wurden auf A) Tag 4, B) Tag 6 und C) Tag 8 nach der Übertragung abgebildet.

<ol>
	<li>Cooke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Berger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+subsets+involved+in+lethal+graft-versus-host+disease+directed+to+immunodominant+minor+histocompatibility+antigens.">T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens.</a> Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).</li><li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+CD8++cells+for+prevention+of+graft-versus-host+disease+after+bone+marrowtransplantation.+A+randomized+controlled+trial.">Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial.</a> Transplantation. 57, 82-87 (1994).</li><li>Korngold, R., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+markers+of+T+cells+causing+lethal+graft-vs-host+disease+to+class+I+vs+class+II+H-2+differences.">Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences.</a> Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).</li><li>Cao, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+using+labeled+donor+tissues+reveals+patterns+of+engraftment,+rejection,+and+survival+in+transplantation.">Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation.</a> Transplantation. 80, 134-139 (2005).</li><li>Asady, R. E. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-{beta}-dependent+CD103+expression+by+CD8(+)+T+cells+promotes+selective+destruction+of+the+host+intestinal+epithelium+during+graft-versus-host+disease.">TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease.</a> J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).</li><li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+leukocyte+integrins.">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).</li><li>Karecla, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+E-cadherin+on+epithelial+cells+by+the+mucosal+T+cell+integrin+alpha+M290+beta+7+(alpha+E+beta+7).">Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7).</a> Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).</li><li>Cepek, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+between+epithelial+cells+and+T+lymphocytes+mediated+by+E-cadherin+and+the+alpha+E+beta+7+integrin.">Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin.</a> Nature. 372, 190-193 (1994).</li><li>Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+functional+characterization+of+a+dominant+minor+H+antigen,+H60.">The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60.</a> J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Protokoll zur Induktion bei Mäusen hier vorgestellten GVHD stellt eine klinisch relevante Modell der murinen GvHD. Zitat von Berger et al. Im Jahr 1994, ist die C57Bl / 6 in BALB.B Stammkombination MHC abgestimmt, mit GVHD Sterblichkeit durch CD4 abhängig, CD8 T-Effektoren 2, sehr ähnlich zu den häufigsten klinischen Szenario 3 vermittelt. Es ist bekannt, dass die Transplantation CD8 T-Zellen allein verursacht keine GVHD in diesem Modell, jedoch ist Krankheitsprogression deutlich schlechter, wenn beide CD4 und CD8-T-Zellen vorhanden sind, wie an CD4-T-Zellen alleine. Darüber hinaus gab es umfangreiche Arbeit, die die immundominante Hierarchie der Immunantwort auf kleinere histocompatibility Disparitäten bei diesem Modell 10. Es bleibt jedoch gewisse Unklarheit über die Rollen für T-Zell-Untergruppen in verschiedenen Phasen des GVHD 4. Unveröffentlichte Studien aus unserem Labor legen nahe, dass CD4 T-Zellen eine entscheidende Rolle spielen in der frühen GVHDEreignisse, während CD8-T-Zellen zu späteren Zeitpunkten dominieren. Die Fähigkeit zur T-Zell-Anreicherung Muster in vivo zu verfolgen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das das Potential, Hypothesen über CD4 und CD8 T-Zell-Beiträge während GVHD zu testen hat. Mäuse transgen für Glühwürmchen-Luciferase wurden zunächst im Labor von Dr. Robert Negrin 5 entwickelt. Wegen ihrer konstitutiven Luciferaseexpression können Zellen aus diesen Mäusen in vivo Spenders unter Verwendung eines nicht-invasiven Bildgebungsverfahren 5 verfolgt werden. Ein weiterer Vorteil dieses Modells ist, dass einzelne Mäuse über die Zeit überwacht werden können. Doch trotz Wiederholung Bildgebung Empfängermäuse, bleibt experimentellen Variabilität zwischen Empfängern. Wie in Abbildung 2 dargestellt, ist der Bereich des gesamten Körpers Flux 2,4 Millionen und die die Maus mit dem niedrigsten Flußmittel hat weniger als 60% des gesamten Körpergewichts Fluß als die Maus mit dem größten Fluss. Da ein einzelnes Transgen Luciferase ist ausreichend für Tcell Detektion kann die Luciferase positive Belastung leicht gezüchtet werden, um doppelt transgenen Mäusen zu schaffen. Untersuchungen in unserem Labor haben eine Rolle für das Integrin CD103 zur Förderung GVHD 6 gezeigt. CD103 ist ein Integrin auf CD8-T-Zellen 7 und der Ligand E-Cadherin, die selektiv auf den Epithelzellen exprimiert wird 8,9 ausgedrückt. Erstellen eines CD103-/ - Maus, die in der Lage zum Ausdruck zu bringen Luciferase für Experimente erlauben, weitere Hypothesen über die Rolle von CD103 in GVHD zu testen. Diese experimentelle Technik zur Beurteilung Ansammlung Muster zwischen Organe beschränkt. Alternative Techniken müssen genutzt werden, um zelluläre Menschenhandel Muster innerhalb einzelner Organe aufzuklären. Kupplung eine klinisch relevante GVHD Modell mit Biolumineszenz-Bildgebung hilft Aufschluss über die Kinetik der T-Zell-Handel und relativen Beiträge der CD4-und CD8-T-Zellen nach Knochenmarktransplantation.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 12633-012 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Calf Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 10439016 </td><td></td></tr><tr><td> 40 uM Zellsieb </td><td> BD Biosciences </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> CD3e-Biotin </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-093-021 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Biotin Microbeads </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-091-147 </td><td></td></tr><tr><td> CD8a Microbeads </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-049-401 </td><td> Verwendet werden, um CD8 T-Zellen aus der Milz führen. </td></tr><tr><td> CD8a Reinigung Antikörper Cocktail </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-095-236 </td><td> Gebrauchte zu reinigenCD8 T-Zellen aus der Milz. </td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 122796 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of graft-versus-host disease and in vivo t cell monitoring using an mhc-matched murine model

Graft-versus-host disease (GVHD) der limitierende Barriere für den breiten Einsatz von Knochenmarktransplantation als kurative Therapie für eine Vielzahl von hämatologischen Mängel. GVHD wird durch reife alloreaktiven T-Zellen im Knochenmark Transplantat, das in den Empfänger infundiert werden verursacht und verursachen Schäden an Host Organe. Jedoch in Mäusen, muß T-Zellen des Knochenmarks Inoculum zugegeben werden, um GVHD bewirken. Obwohl umfangreiche Arbeit getan ist, um T-Zell-Reaktionen nach der Transplantation charakterisieren, ist biolumineszierenden Bildgebungstechnologie eine nicht-invasive Methode zur T-Zell-Trafficking Mustern in vivo zu überwachen. Nach tödlichen Bestrahlung werden Empfängermäuse mit Knochenmarkzellen und Splenozyten von Spender-Mäusen transplantiert. T-Zell-Teilmengen aus L2G85.B6 (transgene Mäuse konstitutiv exprimieren Luciferase) in dem Transplantat enthalten. Mit nur Transplantation bestimmte T-Zell-Untergruppen, ist man in der Lage, spezifische T-Zell-Untergruppen in vivo zu verfolgen,und basierend auf ihren Standort, entwickeln Hypothesen über die Rolle von spezifischen T-Zell-Untergruppen bei der Förderung GVHD zu verschiedenen Zeitpunkten. In vorgegebenen Intervallen nach der Transplantation sind Empfängermäuse abgebildet mit einem Xenogen IVIS CCD-Kamera. Lichtintensität kann quantifiziert unter Verwendung Lebend Image Software, um eine Pseudo-Farbbildes auf Photonenintensität (rot = hoher Intensität, violett = geringer Intensität) basierend zu generieren. Zwischen 4-7 Tage nach der Transplantation beginnen Empfängermäuse klinischen Anzeichen von GVHD zu zeigen. Cooke et al. 1 entwickelt ein Scoring-System bis zur Krankheitsprogression auf der Empfängermäuse Fell Textur, die Integrität der Haut, Aktivität, Gewichtsverlust, und die Haltung der Basis zu quantifizieren. Mäuse werden täglich bewertet und eingeschläfert, wenn sie moribund werden. Empfängermäuse Regel geworden moribund 20-30 Tage nach der Transplantation. Murine Modelle sind wertvolle Werkzeuge für das Studium der Immunologie der GVHD. Selektiv Transplantation insbesondere T-Zell-Untergruppen alTiefs für sorgfältige Identifikation der Rollen jede Teilmenge spielt. Nicht-invasiv Tracking T-Zell-Antworten in vivo fügt eine weitere Schicht von Wert murine GVHD Modelle.

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Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine Knochenmark-Transplantation ist eine weit verbreitete Technik, um immunologische Mechanismen für Graft-versus-Host-Krankheit beim Menschen zu studieren. Die Fähigkeit zur T-Zell-Trafficking-Muster zu überwachen<em&gt; In vivo</em&gt; Ermöglicht eine detaillierte Analyse der Entwicklung und Aufrechterhaltung der T-Zell-Reaktionen während der Graft-versus-Host-Krankheit.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

induction-graft-versus-host-disease-vivo-t-cell-monitoring-using-an

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

15.6K Aufrufe.  The Ohio State University Medical Center. Murine Knochenmark-Transplantation ist eine weit verbreitete Technik, um immunologische Mechanismen für Graft-versus-Host-Krankheit beim Menschen zu studieren. Die Fähigkeit zur T-Zell-Trafficking-Muster zu überwachen In vivo Ermöglicht eine detaillierte Analyse der Entwicklung und Aufrechterhaltung der T-Zell-Reaktionen während der Graft-versus-Host-Krankheit.

Serie: Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Femur Fensterkammer Modell für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zelltracking im Knochenmark der Maus

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

Ein Saug Blister-Protokoll, menschliche T-Zelle Recall Antworten In Vivo zu studieren

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Ein Ex-Vivo Huhn Primärkultur Bursitis-Zelle Modell zur Bursitis Infektionskrankheit Virus Pathogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...