Ringraziamo i membri del laboratorio Huse per consulenza e assistenza. Supportato da l'US National Institutes of Health (R01-AI087644 di M.H.) e P30-CA008748 al Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

1. preparazione delle superfici di vetro stimolatore
<ol><li>Coprioggetto cappotto otto pozzetti camerata con biotinilati poli-L-lisina (Bio-PLL) diluito 1: 500 in acqua distillata e deionizzata (ddH2O). Incubare per 30 min a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Lavare con H2O.</li>
	<li>A secco per 2 h a RT.</li>
	<li>Blocco di Bio-PLL rivestito superfici con tampone bloccante (tamponata HEPES salino [10 mM HEPES a pH 7.4, 150 mM NaCl], con 2% BSA) per 30 minuti a TA.<ol>
<li>Sciogliere 5 mg di poli-L-lisina hydrobromide in 1 mL di 10 mM NaPO4, pH 8.5.</li>
		<li>Aggiungere 125 μmol (0,55 mg) di NHS-biotina (da uno stock di 100 mg/mL in DMSO) e controllare il pH della reazione. Se il pH è inferiore a 8,5, aggiungere 2 μL di 4 N NaOH per elevarlo a tra pH 8.5 e 9.5.</li>
		<li>Vortexare per 30 min.</li>
		<li>Placare la reazione con 50 µ l di 100 mM glicina disciolta in 20 millimetri Tris pH 8.0.</li>
		<li>Gira alla massima potenza per 10 min e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Nota: Qualità Bio-PLL è in genere rispetto al precedente preparazioni del rivestimento diluizioni seriali del materiale su una piastra a 96 pozzetti ELISA e quantificare il contenuto in biotina dopo incubazione con fosfatasi alcalina accoppiato streptavidina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il tampone di bloccaggio. Non lasciare asciugare pozzetti. Aggiungere streptavidina (100 µ g/mL in tampone bloccante). Incubare per 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Lavare HBS. Riempire e invertire pozzi diapositiva camera 4 - 5 volte, rimozione di HBS dai pozzi. Non lasciare asciugare pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere il biotinilati pMHC ligandi e molecole di adesione alla superficie. Nota: MCC e ovuli possono essere photocaged con l'aggiunta di ortho-nitrobenzyl basato su gruppi di protezione (ad es., nitrophenylethyl (NPE) o nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) per il gruppo ε-amminico di Lisine chiave (K12 in MCC, K7 in ovuli). Photocaged MCC e ovuli possono essere ottenuti da produttori commerciali. Dopo la ricostituzione in tampone acquoso, essi sono ripiegati in batterico espressa-Ek e H2-Kb utilizzando gli approcci stabiliti11,12.</li>
	<li>Convalida del peptide MCC o ovuli fuse<ol>
<li>Decage peptidi NVOC protetto UV irradiando con una lampada UV portatile (Vedi Tabella materiali) per 20 minuti a TA.</li>
		<li>Torio impulso 1.0 x 105 APC con 1 µM del peptide nonstimulatory (controllo negativo, ad esempio Hb), fuse peptide, peptide irradiati fuse e peptide agonista (controllo positivo, per esempio, MCC) per 1 h a durante la notte a 37 ° C.</li>
		<li>Per stimolare le cellule T che esprimono il 5C. C7/2B4/AND TCR, utilizzare celle CH12 o CH27 B. Per stimolare le cellule T OT1, utilizzare EL4 thymoma cellule o RMA-s.</li>
		<li>Mescolare le APCs pulsato con un numero uguale di cellule T nel 96 pozzetti tondo piastre inferiori ad un volume finale di 200 µ l. Incubare a 37 ° C per 12-24 h.</li>
		<li>Recuperare i surnatanti da ciascun pozzetto e analizzare il-2 da ELISA con rilevazione colorimetrica di streptavidina-rafano perossidasi. Nota: Conferma dello status ingabbiamento di tutti i peptidi mediante spettrometria di massa electrospray prima del ripiegamento in complessi MHC, è fortemente raccomandato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire la piegatura e la purificazione di MHC in modo da minimizzare l'esposizione alla luce. Ad esempio, avvolgere pieghevole reazioni nella carta stagnola e svolgere cromatografia di gel filtrazione con la lampada UV. Nota: È stato trovato quel fuse MCC-I-Ek e OVA - H2-Kb indurre attivazione indipendente delle cellule di T UV ad alta densità, probabilmente a causa di ingabbiamento funzionale incompleta. Quindi, il pMHC di fuse è diluito in un eccesso di x di 10-30 di nonstimulatory pMHC (per esempio -Ek contenente il peptide di64-76 di emoglobina (Hb)) durante la fase di immobilizzazione. Questo migliora il rapporto segnale-rumore del successivo esperimento di formazione immagine.</li>
	<li>A photoactivate CD4+ T cellule, collettivamente utilizzare una miscela di biotinylated Hb-I-Ek (3 µ g/mL), biotinylated fuse MCC-I-Ek (0.1 µ g/mL) e anticorpi biotinilati contro la classe I di MHC H2-Kk (0,5 µ g / mL). incoraggia l'anticorpo anti-H2-Kk 5 C. C7/2B4/AND T cellule, che esprimono H2-Kk, di diffondere sulla superficie di vetro senza in fase di attivazione.</li>
	<li>Per CD8+ T cellule, utilizzare una miscela di biotinylated H2-Db recanti il peptide KAVYDFATL (1 µ g/mL), fuse biotinilati OVA-H2-Kb (0,1 µ g/mL) e il dominio extracellulare della molecola di adesione ICAM-1 (2 µ g/mL prodotto da cellule di insetto cultura13). L'ICAM-1 incoraggia stretto contatto formazione coinvolgendo l'integrina LFA1 sulla superficie delle cellule T.</li>
	<li>Applicare tutte le miscele della proteina in tampone bloccante, seguita da incubazione per 1h a RT o almeno 2 ore a 4 ° C. Nota: La densità molecolare su superfici di questo tipo per essere ~ 8000 a µm2 è stata determinata in precedenza6. Dato che fuse pMHC rappresenta ~1/30th della proteina biotinilato sulla superficie, la sua densità sarà ~ 267 molecole al µm2, prima del decaging.</li>
	<li>Lavare come al punto 1.6 e lasciare in HBS fino all'uso.</li>
	<li>Aggiungere 200.000 CD4+ o CD8+ T cellule che esprimono TCR appropriato in ogni pozzetto e permettono alle cellule di aderire a 37 ° C per 15 min. Una volta che le cellule hanno attaccato al e distribuire sulla superficie, sono pronti per fotoattivazione e imaging. Nota: Retroviral trasduzione di cellule T effettrici con imaging sonde fluorescenti è descritto in dettaglio altrove6,7. Segnalazione del calcio possono essere studiate anche utilizzando cellule di T untransduced caricate con il colorante sensibile del calcio Fluo-46. Il colorante raziometrici Fura-2 non è raccomandato perché richiede eccitazione nella gamma UV, che induce anche la decaging della pMHC di fuse.</li>
</ol>2. acquisizione immagini
<ol><li>Usare un microscopio rovesciato di TIRF provvisti di un UV compatibile 150 X obiettivo obiettivo per acquisizione di immagini. UV irradiare regioni definite dall'utente utilizzando un sistema a membrana digitale collegato ad una lampada a mercurio 100 W (HBO). Diretta UV luce da questa lampada sul campione utilizzando un mirror di passaggio lungo 400 nm.</li>
	<li>Utilizzare software di analisi di immagine per fotoattivazione localizzata e l'acquisizione di time-lapse. Nella maggior parte degli esperimenti, monitorare le sonde in entrambi i canali, verde e rossi, utilizzando 488 nm e laser di eccitazione 561 nm, rispettivamente. Luce laser è diretto sul campione utilizzando uno specchio dicroico dual-banda passante che trasmette anche nella gamma UV (per abilitare decaging). Per ulteriori informazioni sulla configurazione del microscopio, vedere la Tabella dei materiali e la Figura 6 .</li>
	<li>Dopo aver montato la diapositiva di camera che contiene le cellule di T, regolare le impostazioni per ottenere illuminazione TIRF o epifluorescenza, come necessario. In modalità live, selezionare un campo di cellule che esprimono il sonde fluorescenti di interesse. Stabilire regioni di micron-scala per fotoattivazione sotto singole celle utilizzando software di controllo.</li>
	<li>Iniziare l'acquisizione di time-lapse. In genere, 80 punti temporali vengono acquisiti, con un intervallo di 5 s tra ogni punto del tempo. Questo lascia più di abbastanza tempo per sequenziale 488 nm e 563 nm esposizioni, nel caso di esperimenti di doppio colore.</li>
	<li>Dopo 10 punti temporali, photoactivate le regioni selezionate aprendo il diaframma digitale dell'otturatore per 1-1,5 s.</li>
	<li>Dopo aver completato il lasso di tempo, selezionare un nuovo campo di cellule e ripetere il processo.</li>
</ol>3. analisi dei dati
Nota: Localizzata fotoattivazione di ligandi immobilizzati crea una regione ben definita, stazionaria stimolatore che può essere utilizzata per l'analisi quantitativa di segnalazione eventi rimodellamento del citoscheletro e risposte. Analisi protocolli tipicamente coinvolgono o quantificare l'intensità di fluorescenza all'interno della regione irradiata o utilizzando la regione irradiata come endpoint posizionale per misurazioni della distanza (ad es. per la valutazione della polarizzazione del centrosoma per la irradiati regione). Entrambi i protocolli di analisi sono descritti di seguito. Vari programmi di analisi di immagine interattiva consente di rendere intensità e misurazioni della distanza, che possono poi essere uscita per ulteriore elaborazione e analisi.
<ol><li>
Intensità di fluorescenza
	<ol>
<li>Determinare l'intensità di fluorescenza (FI) di una regione di sfondo all'esterno della cella (FIb). Verrà utilizzato per la correzione di fondo.<ol>
<li>Disegnare un'area quadrata micron imprese fuori della cellula e fare una maschera. Per determinare l'intensità di fluorescenza, fare clic su Analyze | Mascherare le statistiche. Selezionare Media intensità di fluorescenza ed esportare i valori. Nota: Dettagli procedurali (ad es. 3.1.1.1) fare riferimento al software Slidebook (Vedi Tabella materiali). Attuazione del presente protocollo utilizzando altri pacchetti software (ad es., FIJI) sarà leggermente diverso.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determinare il FI all'interno della regione di fotoattivazione per ciascun punto di tempo.<ol>
<li>Selezionare maschera per evidenziare la regione che era fotoattivazione. Per determinare l'intensità di fluorescenza, fare clic su Analyze | Mascherare le statistiche. Selezionare Media intensità di fluorescenza ed esportare i valori.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sottrarre lo sfondo FI dai valori misurati FI all'interno della regione. Quindi, normalizzare le misure FI corrette dividendo per la media, sfondo corretto FI dei primi 9 fotogrammi prima di fotoattivazione. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). Nota: Il grafico ΔF/F in funzione del tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Distanza
	<ol>
<li>Ottenere la x e y le coordinate del centro della regione di fotoattivazione.<ol>
<li>Per determinare gli assi x e y le coordinate del centro della regione fotoattivazione, selezionare maschera per evidenziare la regione che era fotoattivazione. Una volta evidenziata la regione di fotoattivazione, selezionare Analyze | Mascherare le statistiche | Centro della zona ed esportare i valori.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determinare gli assi x e y coordinate per la sonda fluorescente di interesse per ogni punto di tempo. Questo è tipicamente realizzato attraverso manuali o automatizzate delle particelle di rilevamento.<ol>
<li>Per determinare gli assi x e y coordinate della sonda fluorescente di interesse, selezionare Manuale Particle Tracking e cliccare sulla sonda fluorescente di interesse nel corso del tempo. Una volta che sono stati monitorati tutti i punti di tempo, selezionare Analyze | Mascherare le statistiche | Centro della zona ed esportare i valori.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcolare la distanza tra la proteina fluorescente di interesse e il centro della regione di fotoattivazione per ciascun punto di tempo usando l'equazione: distanza = √ ((x2x -1)2+ (y2y -1)2), in cui x2 e y2 sono le coordinate della proteina fluorescente di interesse e x1 e1 di y sono le coordinate del centro della regione di fotoattivazione.</li>
		<li>Grafico della distanza in funzione del tempo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse.">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).</li><li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Synapse+Formation:+Cell+Polarity+During+T+Cell-APC+Interaction.">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading:+A+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT.">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li><li>Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Function+of+the+Immunological+Synapse+from+Studies+with+Supported+Planar+Bilayers.">Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers.</a> Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).</li><li>Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. 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J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+diacylglycerol+drives+the+polarization+of+the+microtubule-organizing+center+in+T+cells.">Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells.</a> Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).</li><li>Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+variable+hinge+region+of+novel+PKCs+determines+localization+to+distinct+regions+of+the+immunological+synapse.">The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse.</a> PLoS One. 9, 1-8 (2014).</li><li>Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+T+cell+receptor+binding+to+peptide-MHC:+evidence+for+a+general+mechanism+of+molecular+scanning.">Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).</li><li>Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-A2-peptide+complexes:+refolding+and+crystallization+of+molecules+expressed+in+Escherichia+coli+and+complexed+with+single+antigenic+peptides.">HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).</li><li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells.">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).</li><li>Nguyen Duc, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Generalizable+Platform+for+the+Photoactivation+of+Cell+Surface+Receptors.">A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors.</a> ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).</li><li>Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling.">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration.">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+improved+light-induced+dimer+(iLID)+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins.">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).</li><li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+cell+function+using+engineered+photoreceptors.">Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors.</a> Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).</li><li>Grusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+precise+activation+of+engineered+receptor+tyrosine+kinases+by+light.">Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light.</a> EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage.">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Negli ultimi anni, la luce è emerso come un ottimo strumento per l'attivazione spatiotemporally controllata dei processi cellulari. Sono state sviluppate varie metodologie, ciascuno con associati vantaggi e svantaggi. Il sistema descritto qui, che è basato su decaging di ligandi extracellulari, immobilizzati, è ideale per l'analisi delle risposte di segnalazione rapide, subcellulare, polarizzate. Questo approccio è stato applicato per esaminare è formazione in cellule di T, come descritto in precedenza. Inoltre, sono state progettate in gabbia ligandi per altri recettori, che ci permette di applicare la stessa strategia per valutare la segnalazione inibitoria in cellule naturali uccisione e lo spostamento nucleare del fattore di trascrizione NF-κB in risposta a pedaggio come recettore segnalazione di14,15.
In questo protocollo, stimolatori ligandi sono immobilizzati per garantire che rimangano come stazionaria, polarizzata fonte di stimolo per tutta la durata dell'esperimento imaging. Questo approccio è adatto per gli studi di polarizzazione cellulare. Dovrebbe essere notato tuttavia, che l'approccio di fotoattivazione TCR si adatta facilmente per attivazione temporaneamente controllata delle cellule di T su lipidici supportati. Ovviamente, uno non può raggiungere la stimolazione sostenuta, polarizzata in questo contesto. Tuttavia, questo può essere inutile, dato gli obiettivi sperimentali.
Il sistema è anche abbastanza flessibile per quanto riguarda la sorgente di luce UV per decaging. Attualmente, una lampada Hg W 100 viene utilizzato per l'illuminazione concentrata, tuttavia un laser pulsato azoto (ns 4 di larghezza di impulso, impulso energia 120 mJ), è stato utilizzato in precedenza6. A volte, un palmare lampada UV (365 nm, 4 W) è stato posizionato sopra il campione di imaging per decage più grandi regioni del ligando photostimulatable. Le caratteristiche specifiche del sistema decaging in ogni caso dipenderà i requisiti tecnici dell'esperimento in questione.
Quando si implementa questo sistema, è importante confermare che le risposte osservate sono specifiche per l'evento di fotoattivazione e non il risultato dell'attivazione del recettore spurie o photodamage indotto da UV. Per escludere questi artefatti, due controlli di specificità possono essere eseguiti. In primo luogo, è possibile monitorare l'intensità di fluorescenza in cellule che non sono direttamente irradiati durante gli esperimenti di fotoattivazione. Se la superficie è correttamente in gabbia, apprezzabili risposte in queste cellule non dovrebbero essere osservate (ad esempio, Figura 5). In secondo luogo, gli esperimenti in cui T cellule sono UV-irradiati su superfici manca fuse ligandi possono essere eseguiti. Questo controllo è fondamentale per identificare gli effetti indotti da UV indipendenti fuse ligando (ad esempio, vedere riferimento 6). Durante l'ottimizzazione del sistema, è anche estremamente utile avere a portata di mano una risposta imaging cellulare robusta (ad es., Grb2-GFP reclutamento) che sia veloce e localizzata. Valutare le correlazioni tra eventi di segnale e fotoattivazione è molto più semplice se tali eventi sono spatiotemporally prossimale alla stimolazione del recettore.
Anche se l'approccio di fotoattivazione offre squisito spatiotemporal controllo su segnalazione del ricevitore, manca l'adattabilità accordata dal transfectable optogenetica sistemi16,17,18,19 ,20,21,22. Alcune proteine optogenetica sono anche photoreversible, fornendo il controllo condizionale che non è disponibile con l'approccio di fotoattivazione descritto qui. Nei sistemi di optogenetica, tuttavia, limitare la diffusione delle proteine di fotoattivazione è tecnicamente impegnativo. Questo complica l'analisi della segnalazione polarizzata, particolarmente in un contesto subcellulare.
Si dovrebbe anche notare che l'entità coinvolgente di questo sistema di fotoattivazione è una superficie di vetro, che non è possibile riassumere tutti gli aspetti di un'interazione cellula-cellula buona fede. Per ovviare a questo problema mantenendo il controllo spazio-temporale dell'iniziazione di segnale, i ricercatori hanno usato un sistema ottico trappola per portare un APC a contatto con una cellula di T, che permette per l'insorgenza di riarrangiamenti citoscheletrici e maturazione è di essere visualizzate in tempo reale23. Anche se questo sistema permette l'iniziazione precisa e la visualizzazione delle dinamiche del citoscheletro utilizzando un APC effettivo, esso è relativamente bassa velocità effettiva e non è compatibile con illuminazione TIRF, che incide negativamente la qualità dell'immagine.
In conclusione, il metodo descritto in questo protocollo fornisce controllo spazio-temporale del TCR-indotta di segnalazione all'interno della cellula T, in ultima analisi, permettendo per la delucidazione dei cambiamenti biochimici veloce dopo l'attivazione del TCR. Questo sistema ci fornisce un mezzo per capire meglio come gli eventi di segnalazione dopo l'attivazione di TCR promuovono la polarizzazione delle cellule T, IS formazione e, in definitiva, la consegna delle risposte effettrici.

Linfociti T (cellule T) gioca un ruolo centrale nell'immunità cellulare riconoscendo peptidi antigenici visualizzate nel contesto della superficie cellulare MHC. Riconoscimento dell'antigene, che è mediata dal TCR, spinge la differenziazione delle cellule T naive e promuove la consegna delle risposte citolitiche e comunicative di effettori. Impegno di TCR inoltre induce cambiamenti drammatici nell'architettura cellulare. In pochi minuti, le cellule T gloms sul lato della cella presentanti l'antigene (APC), formando un'interfaccia polarizzata, conosciuta come la sinapsi immunologica (IS)1,2. L'IS rafforza le risposte delle cellule T effettrici abilitando il direzionale rilascio di citochine o, nel caso dei linfociti T citotossici (CTL), proteine litiche che distruggono l'APC.
Impegno di TCR di pMHC induce la fosforilazione rapida di più molecole di adattatore a valle, compreso il Linker per le celle di attivazione di T (LAT), che in definitiva promuove robusto rimodellamento del citoscheletro sinaptica2. Corticale actina filamentosa (F-actina) unità delle cellule di T di diffusione sopra la superficie APC e poi si risolve in una struttura anulare caratterizzata da accumulo di F-actina alla periferia IS e svuotamento dal centro. Formazione di anello di F-actina è strettamente per il riorientamento del centro organizzatore dei microtubuli (MTOC, chiamato anche il centrosoma in cellule di T) ad una posizione appena sotto il centro dell'interfaccia. Entrambi gli eventi si verificano all'interno di minuti di riconoscimento iniziale dell'antigene e stabilire il contesto architettonico in cui gli eventi di attivazione successiva ed effettrici si ottiene una risposta.
Per studiare la formazione di IS, vari laboratori hanno sviluppato approcci in cui la APC è sostituito da una superficie di vetro che contiene immobilizzato TCR ligandi o supporta un bilayer del lipido che a sua volta contiene i ligandi3,4. T cellule formano IS-come contatti su queste superfici che possono essere imaged di microscopio a fluorescenza riflessione interna totale (TIRF) o microscopia confocale, permettendo studi ad alta risoluzione di attivazione delle cellule T iniziale e la formazione di IS.
Sebbene questi approcci hanno permesso per visualizzazione eccellente del è completamente assemblato, gran parte della legatura TCR:pMHC seguente segnalazione si verifica in pochi secondi, che complica gli sforzi per determinare la sequenza degli eventi che seguono l'attivazione TCR con precisione . Per ovviare a questo problema, è stato sviluppato un approccio di fotoattivazione, in cui fuse pMHC viene utilizzato per realizzare il controllo spazio-temporale di TCR attivazione5,6,7. In questo sistema, le cellule T sono attaccate alle superfici di vetro contenente pMHC di fuse che è non-stimolatori per il TCR, fino a quando irradiato con luce ultravioletta (UV). Irradiazione UV di una regione di graduate micron della superficie sotto la cellula T rimuove il photocage creando una zona di stimolatorio che possa essere riconosciuta dalle cellule T. Eventi successivi di segnalazione e il rimodellamento del citoscheletro sono quindi monitorati utilizzando reporter fluorescenti geneticamente codificato. Due versioni di fuse di peptidi antigenici, lepidottero del citocromo c88-103 (MCC) e ovoalbumina257-264 (OVA), che vengono presentati nel contesto della classe II MHC-Ek e la classe I di MHC H2-Kb, rispettivamente, sono stati sviluppato (Figura 1). Questo permette l'analisi di entrambi CD4+ T cellule specifiche per MCC-I-Ek (esprimendo il 5 C. C7, 2B4, o AND TCR) e CD8+ T cellule specifiche per OVA-H2-Kb (che esprimono TCR OT1).
Nell'ultimo decennio, l'approccio di fotoattivazione e formazione immagine di TCR è stata utilizzata per stabilire la precisa cinetica di TCR primi passi di segnalazione e anche per identificare i meccanismi molecolari che regolano polarizzata in rimodellamento del citoscheletro5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. ad esempio, il dosaggio è stato strumentale nel determinare tale centrosoma riorientamento verso l'APC è mediato da una sfumatura localizzata del lipido secondo messaggero diacilglicerolo centrato presso l'IS. Si prevede che questa metodologia continuerà ad essere prezioso per applicazioni che richiedono analisi di imaging ad alta risoluzione della funzione delle cellule T.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1152">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155361</td>
			<td style="width:443px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">20217</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td>Will be used to biotinylate proteins</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated Hb I-EK&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-MCC I-EK&#160;</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated &#945;H2-Kk antibody</td>
			<td style="width:211px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-OVA H2-Kb</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated KAVY H2-Db&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated ICAM1&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Hand held UV lamp</td>
			<td style="width:211px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">UVGL-25</td>
			<td>Lamp is held &#60; 1 cm from the sample.&#160; 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Olympus IX-81 OMAC TIRF system.</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Additional information about the imaging system can be found in Figure 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Mosaic digital diaphragm</td>
			<td style="width:211px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:379px;">Slidebook software</td>
			<td style="width:211px;">Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial and temporal control of t cell activation using a photoactivatable agonist

Linfociti T impegnano nella segnalazione rapida, polarizzati, che si verificano pochi minuti dopo l'attivazione del TCR. Ciò induce la formazione di sinapsi immunologica, una giunzione cellulare stereotipato che regola l'attivazione delle cellule T e direzionalmente gli obiettivi le risposte effettrici. Per studiare questi processi in modo efficace, è necessario un approccio imaging che è su misura per catturare le risposte veloci, polarizzate. Questo protocollo descrive tale sistema, che si basa su un fuse peptide-major istocompatibilità (pMHC) che è non-stimolatore fino a quando è esposto a luce ultravioletta. Decaging mirati di questo reagente durante gli esperimenti di videomicroscopia consente controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione di TCR e monitoraggio ad alta risoluzione delle successive risposte cellulari di riflessione interna totale (TIRF) imaging. Questo approccio è anche compatibile con le strategie di perturbazione genetici e farmacologici. In questo modo per il montaggio delle vie molecolari ben definite che collegano TCR segnalazione alla formazione delle strutture citoscheletriche polarizzate che sottendono la sinapsi immunologica.

L'approccio di fotoattivazione e imaging consente per l'osservazione e facile quantificazione delle risposte di segnalazione rapide, polarizzate. Per illustrare le sue capacità, riprodotta qui è un esperimento esaminando la spatiotemporal correlazione tra accumulo di TCR-indotta DAG e centrosoma riorientamento. 5 C. Gli scoppi di cella C7 T retrovirally sono state trasdotte con due reporter fluorescenti: un biosensore DAG contenente i domini di C1 tandem da chinasi di proteina C-θ collegata a GFP (C1-GFP) e RFP-tubulina per monitorare il centrosoma. Le cellule di T sono stati poi collegate a chambered coprioggetto contenente fuse MCC-I-Ek. C1-GFP era imaged usando microscopia elettronica TIRF e RFP-tubulina in epifluorescenza modalità. Come illustrato nella Figura 2, fotoattivazione localizzata della superficie sotto la cellula T induce l'accumulo di DAG nella zona irradiata. Questa è seguita in pochi secondi mediante la ridefinizione del centrosoma alla stessa regione.
Accumulo di C1-GFP può essere quantificato calcolando l'intensità di fluorescenza normalizzata, dopo correzione del fondo, al centro della regione di fotoattivazione nel tempo (Figura 3). Riorientamento centrosoma in risposta a fotoattivazione può essere quantificato calcolando la distanza tra il centrosoma e il centro della regione di fotoattivazione come funzione del tempo (Figura 4).
Questo metodo può essere utilizzato per esaminare una vasta gamma di risposte di segnalazione rapide, polarizzate, essenzialmente tutto ciò che possono essere monitorati utilizzando una sonda fluorescente. Ad esempio, TCR fotoattivazione è utilizzato per monitorare la formazione precoce di microcluster segnalazione utilizzando Grb2 fluorescente contrassegnati (Grb2-GFP) (Figura 5). Simile all'accumulo di DAG e centrosoma riorientamento risposte, Grb2-GFP polarizzazione si verifica poco dopo la fotoattivazione (Figura 5) e può essere quantificata utilizzando l'approccio di intensità di fluorescenza normalizzata.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig1.jpg"> Figura 1: Sistema di fotoattivazione utilizzando photocaged peptide MCC. (A) Photocaged strategia per peptide MCC. Un gruppo NPE è attaccato al residuo di lisina del peptide MCC. L'irradiazione UV provoca la rimozione di NPE, ripristino MCC alla sua forma originaria. (B) quando NPE è associato a MCC, il C. 5 C7 TCR Impossibile associare a MCC. Rimozione di NPE risultati come riconoscimento il 5 C. C7 TCR per il peptide nativo di MCC. (C) la strategia di photocaged è stata adattata per funzionare con cellule T CD8 +, in cui il peptide OVA photocaged viene utilizzata per attivare il TCR di OT-1 all'irradiazione UV.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig2.jpg"> Figura 2: Montaggio time-lapse di riorientamento di accumulo e centrosoma DAG seguendo la fotoattivazione di TCR in C. 5 Cellula di T C7. 5 C. Cella C7 esprimendo un biosensore DAG, contenente tandem C1-domini di PKC - fuso a GFP (C1-GFP) e Tag-RFP tubulina (RFP-Tub), un reporter fluorescente per il centrosoma. I montaggi illustrano la risposta polarizzata di 5C. Cellule di T di C7 nel corso del tempo. Testo e ovali gialli indicano il tempo e la posizione di fotoattivazione. Nel corso del tempo, C1-GFP si accumula alla regione di fotoattivazione, seguita da riorientamento centrosoma verso la regione di fotoattivazione. Barra della scala: 10 µm.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig3.jpg"> Figura 3: Quantificazione dell'accumulazione di DAG alla regione di fotoattivazione Accumulo di DAG, C1-GFP, presso la regione di fotoattivazione (a sinistra) può essere quantificato calcolando l'intensità di fluorescenza normalizzata, dopo correzione del fondo, presso la regione di fotoattivazione (cerchio giallo con ombreggiatura blu) nel corso del tempo. I dati sono normalizzati rispetto i nove fotogrammi ottenuti appena prima di fotoattivazione. Arricchimento di C1-GFP presso la regione di fotoattivazione può essere calcolato dalla divisione dell'intensità media di fluorescenza nella regione irradiata dall'intensità media di fluorescenza dell'intera cella, sfondo correzione seguente. L'equazione: ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)), in cui FI è l'intensità media di fluorescenza, può essere utilizzato per calcolare l'intensità di fluorescenza normalizzata. L'intensità di fluorescenza normalizzata alla regione di fotoattivazione può quindi essere graphed come funzione del tempo (a destra). Linea viola indica il tempo di fotoattivazione. Barra della scala: 10 µm.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig4.jpg"> Figura 4: Quantificazione del riorientamento centrosoma. Determinare le coordinate del centrosoma (RFP-Tub) nel tempo registrando manualmente il percorso del centrosoma verso la regione di fotoattivazione (freccia bianca) in ciascun punto di tempo (a sinistra). Determinare le coordinate del centro della regione di fotoattivazione (cerchio giallo). La distanza tra il centrosoma e il centro della regione di fotoattivazione può essere calcolata in ogni punto del tempo usando l'equazione per distanza = √ ((x2x -1)2+ (y2y -1)2), in cui x2 e y 2 la x e y coordinate per il centro della zona del centrosoma e X1e y1 sono x e y le coordinate del centro della regione di fotoattivazione. La distanza del centrosoma dal centro della regione di fotoattivazione in ogni momento punto può quindi essere graphed come funzione del tempo (a destra). Linea viola indica il tempo di fotoattivazione. Barra della scala: 10 µm.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig5.jpg"> Figura 5: Formazione di microcluster Grb2-GFP. (A) rappresentante C. 5 Cella C7 esprimendo fluorescente etichettati Grb2 (Grb2-GFP). I montaggi illustrano la risposta polarizzata di straordinario Grb2-GFP. Testo e ovali gialli indicano il tempo e la posizione di fotoattivazione. Nel corso del tempo, Grb2-GFP si accumula alla regione di fotoattivazione. (B) quantificazione dell'intensità di fluorescenza di Grb2-GFP presso la regione di fotoattivazione nel corso del tempo. N = 15 celle. (C) quantificazione dell'intensità di fluorescenza di Grb2-GFP in una regione di controllo all'esterno della zona di fotoattivazione. N = 15 celle.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig6.jpg"> Figura 6: Configurazione di microscopio per fotoattivazione e imaging TIRF. 488 nm e 561 nm laser sono utilizzati per TIRF ed epifluorescenza imaging delle sonde verde e rosse, rispettivamente. Luce UV per fotoattivazione è preso da una lampada a mercurio (Hg) collegata ad un sistema digitale a membrana in grado di illuminare regioni piccole, definito dall'utente. Luce da lampada Hg/diaframma viene riflessa sul campione da uno specchio di longpass posizionato sotto lo specchio dicroico che riflette i laser imaging. Lo specchio dicroico deve essere progettato per passare luce UV. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56655/56655fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse

Questo protocollo descrive un metodo basato su formazione immagine per attivare i linfociti T usando fuse peptide-MHC, consentendo un controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione delle cellule T.

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.2K Views.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Questo protocollo descrive un metodo basato su formazione immagine per attivare i linfociti T usando fuse peptide-MHC, consentendo un controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione delle cellule T.

Video: Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induzione di Graft-versus-host disease e<em&gt; In Vivo</em&gt; T monitoraggio cellulare Utilizzando un MHC-abbinato modello murino

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Antigen Presenting artificiale cellulare (AAPC) Attivazione mediata ed espansione delle cellule Natural Killer T

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Static Adesione saggio per lo Studio della integrina attivazione nei linfociti T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della barriera emato-encefalica Utilizzando spettroscopia di impedenza: un focus sui T Cell-endoteliale cellulare Interazione

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

Misura della T cellulare alloreattività Utilizzando Imaging Citometria a Flusso

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

Molto multiplo, la risoluzione super-risoluzione delle celle T utilizzando la madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Valutazione delle risposte a cellula T Zika Virus-specifici in organi di nuova di Ifnar1 infetti- / - Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...