Die Autoren möchte David Langenau danken für die großzügige Bereitstellung von Aquarium Raum; Eric Stone, John C. Moore und Qin Tang für Hilfe bei Zebrafisch Wartung und Reagenzien, und Anne Robertson und Elliott Hagedorn aus Leonard Zon Labor für die Beschaffung der hier verwendeten Zebrafisch-Stamm. Sie möchte auch Octavio Hurtado für Ratschläge, photolithographische Techniken zu danken. FE wurde durch Stipendien aus Shriner es Krankenhaus für Kinder und der amerikanischen Australian Association finanziert. Diese Arbeit wurde von NIH finanziert GM92804 zu gewähren.

Mikroinjektion der Larven wurde von der Massachusetts General Hospital Unterausschuss für Forschung Animal Care unter Protokoll 2011N000127 genehmigt.
1. Gerät Fertigung
Hinweis: Alle Computer-gestützte (CAD) Zeichnungsdateien verwendet Photolithographie-Masken, die hier beschriebenen entwerfen (Abbildung 1) sind zum Download zur Verfügung. Siehe Tabelle der Materialien für Links.
<ol><li>Den master-Form-Wafer im Reinraum Klasse 1.000 mit Standardtechniken photolithographische7zu fabrizieren. Für die Mikrostruktur Arrays und Kanäle Muster der Epoxy-basierte negativer Photoresist nacheinander in 3 Schichten mit 3 separaten Masken, gemäß den Anweisungen des Herstellers: 100 µm für die flachen Features, 200 µm für die mittlere Features und 400 µm für die Tiefe verfügt. Für das Bildverarbeitungsgerät Schichten Muster zwei mit 400 µm für die flachen Features und 600 µm für die tiefen-Features.</li>
	<li>Kleben Sie den fertige Wafer auf der Basis eines 15 cm Petrischale für das Gießen (Abbildung 2).</li>
</ol>2. Vorbereitung von mikrostrukturierten Oberflächen Arrays - PDMS
<ol><li>Um nutzbare Geräte zu machen, werfen Sie Polydimethylsiloxan (PDMS), mit dem Meister Wafer als Form. 50 g PDMS Monomer mit 5 g des Initiators zu kombinieren und mischen in einem Kunststoff mit einem Gewicht von Schüssel mit einer Gabel aus Kunststoff.</li>
	<li>Gießen Sie die Mischung vorsichtig über die Form.</li>
	<li>In einem Vakuum Exsikkator bei 16-25 InHg (54-85 kPa) für 1 h entgasen.</li>
	<li>Um die PDMS zu heilen, Backen Sie bei 65 ° C für mindestens 3 h. Die PDMS sollte auf eine feste, aber flexible solide heilen.</li>
	<li>Schneiden Sie vorsichtig um das Gerät auf dem master Wafer mit einem Skalpell, sicherstellen, dass den Kontakt zwischen der Spitze des Skalpells und der Wafer-Oberfläche zu behalten. Mit Pinzette, Schälen der PDMS-Replikat vom Wafer und Übertragung auf eine saubere 10 cm Petrischale, Funktion Seite nach oben (Abbildung 3).</li>
	<li>Behandeln Sie das Gerät mit Sauerstoffplasma mit einem Plasma-Ofen für 35 s, Hydrophobie zu reduzieren.</li>
	<li>Deckel mit Zebrafish Embryos (E3)-haltigem Medium 168 mg/L von Ethyl-3-Aminobenoate-Methanesulfonate (MS-222, pH 7,5). Entfernen Sie alle Bläschen aus tieferen Funktionen von fließenden Wasser über die Oberfläche des Gerätes mit einer Transferpipette.</li>
</ol>3. Vorbereitung der mikrostrukturierte Oberfläche Arrays - Agarose
<ol><li>Um eine Negativform PDMS zu machen, zuerst behandeln Sie eine PDMS-Gerät mit Sauerstoffplasma.</li>
	<li>
Behandeln Sie das PDMS-Gerät mit 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) Silan Dampf eine inerte Oberfläche8erstellen. Kurz:
	<ol>
<li>Ort der PDMS behandelten Feature-Seite nach oben in einer Vakuumkammer in einer Dampfhaube sein.</li>
		<li>Neben dem PDMS legen eine kleine offene Glas oder Aluminium-Schale und sorgfältig pipette 200 µL des PFDTS (98 % Silan) in die Schüssel. Achtung: PFDTS Silan ist sehr volatil, reagiert heftig mit Wasser, ist brennbar und verursacht schwere Haut- und Schäden auf Kontakt. Lesen Sie Muskel-und Skeletterkrankungen im Detail vor Gebrauch.</li>
		<li>Schließen Sie die Vakuumkammer und gelten Sie Vakuum für 15-30 Minuten, oder bis die PFDTS Silan vollständig verdunstet ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stellen Sie das Gerät in einer Petrischale und als eine Form für frische PDMS, wie in Schritt 2.1-2.3 beschrieben.</li>
	<li>Backen bei 65 ° C für mindestens 3 h, dann schälen die gesamte Schicht frischen PDMS vom behandelten Gerät und in einer frischen Petrischale. Dies dann als eine Negativform einsetzbar, um Agarose zu werfen.</li>
	<li>Um die Agarose vorzubereiten, Kochen Sie eine 2 % ige Lösung von niedrigen gelierende Temperatur Agarose in E3 in der Mikrowelle bis die Agarose vollständig aufgelöst ist.</li>
	<li>Die Negativform PDMS übergießen Sie heißen Agarose und entfernen Sie alle Luftblasen in der Agarose für das Gerät durch fließende heißen Agarose über die Features mit einer Transferpipette.</li>
	<li>Sobald Bläschen entfernt werden, im Kühlschrank bei 4 ° C die Agarose festlegen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Agarose-Block aus der Negativform PDMS durch Verformung der PDMS aus unterhalb von hand, übertragen Sie die Agarose-Block auf eine neue Petrischale und nass mit E3 mit MS-222.</li>
</ol>4. Vorbereitung der PDMS Imaging-Geräte
<ol><li>Um nutzbare Geräte zu machen, werfen Sie PDMS, mit dem Meister Wafer als Form. Kombinieren Sie 50 g PDMS Monomer mit 5 g der Initiator (gleiche wie in Schritt 2.1 verwendet) und Mischung gründlich in einem Kunststoff mit einem Gewicht von Schüssel mit einer Gabel aus Kunststoff.</li>
	<li>Gießen Sie die Mischung vorsichtig über die Form.</li>
	<li>In einem Vakuum Exsikkator bei 16-25 InHg (54-85 kPa) für 1 h entgasen.</li>
	<li>Um die PDMS zu heilen, Backen Sie bei 65 ° C für mindestens 3 h. Die PDMS sollte auf eine feste, aber flexible solide heilen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Geräte aus dem Master-Wafer und Häfen mit einem 1,5 mm Schlag ausstanzen.</li>
	<li>Behandeln die Geräte und einem Glasboden 6-Well gut mit Sauerstoffplasma für 35 Platte s, wie unter Punkt 2.6 beschrieben.</li>
	<li>Verbinden Sie ein Gerät Feature-Side-Down zu jedem Glas Deckglas des 6-Well-Platte, indem es auf eine Herdplatte 85 ° C für 10 min. Hinweis: Zur Bestätigung der erfolgreichen Verklebung Druck fest auf der einen Seite des verbundenen Geräts mit Pinzette. Das Gerät sollte an den Glas-Deckglas bleiben.</li>
</ol>5. Zebrafisch-Kultur
<ol><li>Kultur-Zebrafisch-Embryonen bis 2 Dpf mit Standardtechniken3.</li>
	<li>Dechorionate Embryonen mit Zange oder 1 mg/mL Protease mischen (siehe Materialtabelle)3 mindestens 30-60 Minuten vor der Verladung auf Gerät, damit sie sich zu begradigen.</li>
	<li>Betäuben Sie Embryonen mit (168 mg/L) MS-222 (pH 7,5) durch Zugabe von 25 X 1 mL Stammlösung auf der E3 in der Petrischale.</li>
</ol>6. Ausrichtung der Zebrafisch auf mikrostrukturierte Oberfläche - Divot-Arrays
<ol><li>Vorbereiten des PDMS-Blocks aus Schritt 2.7 (Abbildung 3A) in der Petrischale, derart, dass sie durch eine dünne (1-2 mm) Schicht von E3, fällt die einfachere Handhabung der Embryonen erlaubt.</li>
	<li>Übertragen Sie erforderliche Anzahl von Embryonen (in der Regel 10-20 pro Zustand) auf die Oberfläche des PDMS-Blocks mit einer Transferpipette.</li>
	<li>Mit einem Tool Mikromanipulation (Haar Schleife o.ä.), schieben Sie die Embryonen in mikrostrukturierten Divots (Abb. 3A). Verwendung von Divots eignet sich besonders für dorsalen und ventralen Orientierungen. Hinweis: Für die Divots mit einer strengeren passen (dorsale und ventrale), versuchen die Embryonen auf der Oberfläche des Blocks parallel zu den Divot zu positionieren und dann Rollen sie mit einer Haar-Schleife in Position. Schob sie tiefer in das Divot hilft um sie stabil zu halten.</li>
</ol>7. Orientierung der Zebrafisch auf mikrostrukturierte Oberfläche - mikrostrukturierten Kanäle
<ol><li>Gemustert mit mikrostrukturierten Kanäle (Abb. 3 b) mit einer Transferpipette, bis das Niveau der E3 unter den Rand des Blocks fällt, aber noch vorhanden, in das Reservoir und Kanäle und in einer dünnen Schicht auf die PDMS ist PDMS-Block ziehen Sie E3 ab.</li>
	<li>Übertragen Sie 10 Embryonen aus Schritt 5.3 in das Reservoir mit einer Transferpipette, ohne dabei die Kanten zu überlaufen.</li>
	<li>Mit einer Haar-Schleife, manipulieren Sie jeder Embryo in den Trichter am Eingang des entsprechenden Kanals zu und orientieren Sie, so dass der Kopf des Embryos in Richtung des Kanals ist und der Embryo die entsprechende Ausrichtung beim Eintritt in den Kanal hat.</li>
	<li>Schieben Sie jedes Embryo ab der Kanal mit einer Haar-Schleife, bis es die orientierende Microfeatures in die Kanalwände, die helfen erreicht, um es in Position zu halten. Nutzung von mikrostrukturierten Kanälen empfiehlt sich besonders für die seitliche Ausrichtung. Hinweis: Um Embryo während Mikroinjektion zu reduzieren, versuchen Sie Anpassung der Höhe der Oberflächenspannung durch E3 aus dem Behälter ziehen.</li>
</ol>8. die Mikroinjektion Zebrafisch
<ol><li>
Mikroinjektion Nadel vorbereiten.
	<ol>
<li>Borosilikatglas Microcapillary Nadeln mit einer Mikropipette Puller als zuvor beschriebenen4zu machen. Die daraus resultierende Nadeln sollten bis zu einem Punkt an einem Ende mit einer konischen Länge von ca. 10 mm abgeschrägt werden.</li>
		<li>Bereiten Sie Lösung injiziert werden, in diesem Fall 100 nM Lockstoffgradient (N-Formylmethionine-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) oder Leukotrien B4 (LTB4)) und 100 nM 70 kDa Rhodamine Dextran Tracer mit PBS-Puffer.</li>
		<li>Laden Sie 5 µL der Lösung in die Nadel mit einer fein konische Pipette Tipp (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Montieren Sie die Nadel in einem Mikromanipulator auf magnetische Stativ montiert und angeschlossen an eine Picopump Microinjector.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Brechen Sie die Spitze der Nadel in einem 45 °-Winkel durch Kneifen die kegelförmige Spitze mit der Pinzette.</li>
	<li>Passen Sie Injektion Bolus Größe 1 nL durch die Einspritzzeit auf dem Picopump Controller einstellen.</li>
	<li>Stellen Sie den Winkel der Mikroinjektion Nadel. Ein Nadel-Winkel von 45° auf die Mikromanipulation Controller ist im Allgemeinen ein guter Ausgangspunkt, mit der Nadel parallel zu der Länge des Embryos. Ein steilerer Winkel kann verwendet werden, um die seitliche Bewegung des Embryos während der Mikroinjektion zu minimieren.</li>
	<li>Steuerung der Petrischale mit der linken Hand und die Nadel Mikromanipulator mit dem Recht, bringen Sie die Nadel so nah wie möglich an den vorgesehenen Ort der Mikroinjektion, in diesem Fall die Gleichheitspartei Vesikel. Hinweis: Die Gleichheitspartei Vesikel kann als längliche Organ posterior für das Auge mit zwei kleineren ausgeprägte dunkle längliche Strukturen (Otolithen) identifiziert werden.</li>
	<li>Mit dem Mikromanipulation Controller durchdringen Sie das Zielgewebe (in diesem Fall die Gleichheitspartei Vesikel) zu, so dass die Spitze der Nadel in die Blase und injizieren Sie die voreingestellte Lautstärke mit der Picopump-Fuß-Schalter. Hinweis: Wenn das Gewebe eindringen widersteht, möglichst leichtes Klopfen des Mikromanipulation Controller Knopfes.</li>
	<li>Um die Embryonen zu lösen, fließen Sie E3 über die Oberfläche von oben nach unten mit einer Transferpipette oder durch Schütteln das Gericht, dass die Embryonen in die umliegenden E3 freigesetzt werden.</li>
	<li>Übertragen Sie die Embryonen ohne MS-222 mit einer Transferpipette auf eine Erholung Schüssel mit E3.</li>
</ol>9. screening von Embryonen mit dem PDMS Imaging-Gerät
<ol><li>Erstklassige Gerät aus Schritt 4.7 durch fließende E3 (+ MS-222) durch den Hafen. Dies kann mit einer 1.000 µL Pipette oder eine schmale Spitze Transferpipette.</li>
	<li>Füllen Sie den Brunnen mit E3 + MS-222, bis das Gerät bedeckt ist.</li>
	<li>Liefern Sie 4 injizierte Embryonen von 8.7 Schritt in jeder gut mit einer Transferpipette. Embryonen können vorher betäubt werden bei Bedarf durch Inkubation in E3 + MS-222 für 1 – 2 min. vor dem Laden (Schritt 5.3).</li>
	<li>Mit einem Tool Mikromanipulation (Haar Schleife o.ä.), richten Sie die Embryonen an den Eingängen der bildgebenden Kanäle in der gewünschten Richtung (Tail-erste oder kopfüber, abhängig vom verwendeten Gerät), und schieben Sie sie teilweise in das Gerät (Abb. 4A). Damit sie gleichmäßig in das Gerät zu ziehen.</li>
	<li>Zeichnen Sie E3 durch das Gerät aus dem Hafen mit 1.000 µL Pipette oder Transferpipette, bis die Embryonen in die Kanäle in der richtigen Ausrichtung für imaging (Abbildung 4 b) gezeichnet werden. Hinweis: Achten Sie darauf, die Embryonen über den Fang Punkt zu saugen, wird die Embryonen schädigen und ihre Ausrichtung ändern.</li>
	<li>Übertragen Sie Well-Platte auf Mikroskop für imaging (Abbildung 4).</li>
	<li>
Bild mit einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop.
	<ol>
<li>Einstellen Sie Vergrößerung durch Auswahl der entsprechenden Objektiv. 10 X ist in der Regel eine nützliche Vergrößerung für imaging Zebrafisch Neutrophilenzahl Migration.</li>
		<li>Einstellen Sie Intensität der Lichtquelle und Belichtungszeit für jeden Kanal so, dass jedes Signal klar, aber nicht gesättigt ist.</li>
		<li>Die Aufnahmen Sie für jeden Kanal. Hier verwendeten wir grünes fluoreszierendes Protein (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) und Kanäle übertragen. Mehrkanal-Bilder können während der Post-Processing kombiniert werden (Abbildung 4 b-Ich).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Hier beschreiben wir die Verwendung von Geräten wir vor kurzem entwickelt, um 2 Dpf Zebrafisch Mikroinjektion5erleichtern und stellen eine einfache Agarose-freie Halterung für die komfortable Darstellung von Embryonen. Diese Werkzeuge markieren Sie das Dienstprogramm photolithographische Techniken für die Herstellung von Geräten nützlich für Zebrafisch-Techniken.
Wir haben gefunden MSA Geräte besonders nützlich für die Injektion von Zellen oder Partikel anfällig für Aggregation innerhalb der Mikroinjektion Nadel, wie Pilz Konidien oder menschlichen Krebszellen, die eine größere Bohrung Nadel für die Lieferung benötigen. Injektion in die Gleichheitspartei Vesikel (Abbildung 4) stellt eine besondere Herausforderung als Embryonen oft beim Kontakt mit der Nadel Rollen. Wir finden dass die Verwendung von mikrostrukturierten Kanälen, orientieren und stabilisieren der Zebrabärbling in eine seitliche, Ausrichtung stark verbessert, den Durchsatz und die Genauigkeit dieser Technik in unseren Händen.
Für schnelle Aufnahmen von seitlich ausgerichteten Zebrafisch zu verschiedenen Zeitpunkten, z. B. Beurteilung der Neutrophilen Rekrutierung oder Xenograft Metastasen, erhöht die Vermeidung von Agarose Montage Kohärenz zwischen den Embryonen und geringere Chancen auf Transportschäden Post-imaging-Rettung. Auch diese Geräte zeigen, Versprechen für längere Zeit verfallen Bildgebung und wurden verwendet, um erfolgreich zu erobern, Mehrkanal, multiplane Bilder mit minimaler Fisch Bewegung über 12 h. Weil sie nicht durch Agarose eingeschränkt sind, aktive Dehnung der Larven während dieser Periode (~ 300 µm aus 54-78 hpf)11 ist nicht eingeschränkt und kann normal fortfahren.
Die wichtigsten Schritte bei der Vorbereitung und Einsatz dieser Werkzeuge gelten für die Nutzung der meisten PDMS basierte Mikrofluidik-Geräte: Geräte müssen gründlich benetzt sein und Luftblasen zu vermeiden. Um solche Probleme zu vermeiden, die Geräte in E3 nass sofort nachdem sie hergestellt sind, während die Oberfläche Hydrophilie verliehen durch Plasmabehandlung Sauerstoff noch vorhanden ist. Nachbehandlung mit Sauerstoffplasma kann auch verwendet werden, vorübergehend Hydrophilie Alter PDMS-Geräten wiederherstellen.
Die präzise Geometrien verwendet hier nutzen Sie die hohe Auflösung des photolithographische Techniken, sondern die aktuellen Entwürfe Grenze Verwendung an Zebrafish während der zweite Tag nach Befruchtung. Re-design der Geometrien basierend auf der aktuellen Plattform würde die erfolgreiche Ausrichtung der Dpf 1 und 3 Dpf für die Mikroinjektion ermöglichen. Ausrichtung der mehr Auftrieb 4 Dpf Larven mit überhöhten Schwimmblase würde wahrscheinlich schwieriger sein und eng anliegende Geometrien in Kombination mit höheren Wasser Spannung erfordern. Komplexe Geräte, die Integration von Flow oder Vakuum könnten einen alternativen Ansatz auf eine breitere Palette von Entwicklungsstadien anwendbar, aber müssten auch Einsatz von Pumpen und Schläuche, steigende Kosten und Gefahr des Geräteausfall.
PDMS ist eine kostengünstige, nützliche Material für die Herstellung von Geräten wie den hier beschriebenen Biokompatibilität, Transparenz und Wiederverwendbarkeit. Ein Nachteil bei der Verwendung von PDMS Vorrichtungen für Zebrafisch ist Hydrophobie, die Wartung der flachen Schichten der E3 auf der Oberfläche des Gerätes schwer machen kann. Dieses Problem kann vermieden werden, durch die Mikroinjektion Geräte in Agarose, gießen, obwohl dies die Wiederverwendbarkeit schränkt und die Anfälligkeit der Geräte erhöht. Eine bevorzugte Alternative wäre Identifikation einer biokompatiblen Oberflächenbehandlung, die die Hydrophilie von PDMS12oder Verwendung einer geeigneten Kunststoff-Substrat erhöht.
Aktuelle Methoden für die Mikroinjektion Zebrafisch auf 2 Dpf verwenden entweder Wasser Spannung4 oder einfache Kanäle in Agarose mit kommerziellen Formen zu immobilisieren und positionieren Sie die Larven gegossen. Diese Ansätze bieten begrenzte Kontrolle der Orientierung und können durch die schnelle Trocknung von Embryonen erschwert werden. Die Mikrostrukturen integriert die Divots und Kanäle verwendet werden, hier sollen orientieren und die Larven ohne völlig abhängig von Wasser-Spannung, wodurch das Risiko der Trocknung zu immobilisieren. Divots gemacht mit 3D gedruckten Formen wurden zuvor für die Ausrichtung der Embryonen für bildgebende Zwecke13, obwohl die Tiefe dieser Divots sie unzugänglich für die Mikroinjektion machte verwendet.
Verwendung von mikrofluidischen Systemen für die Zebrafisch Bildgebung immer häufiger14. Mehreren durchströmten Systemen wurden entwickelt, um die Beobachtung der Zebrafisch-Entwicklung im Laufe der Zeit mit der Fähigkeit, Verbindungen auf Nachfrage15,16,17einführen zu lassen. Komplexere Geräte wurden Array Embryonen während noch innerhalb ihrer Chorion konzipiert, bietet eine einfache sphärische Geometrie, die leicht manipuliert werden kann mit relativ hohen Durchsatz in diese Systeme18,19. Mehrere Gruppen haben Plattformen für Anordnung und imaging Larvenstadium Zebrafisch in verschiedenen Ausrichtungen6,20, das benutzerfreundlichste Wesen der passiven Mikropumpe getrieben "ZEBRA"-System, entwickelt von Beebe Lab6 entwickelt. . Im Gegensatz zum ZEBRA Saug, erzeugte mit einer Standardüberweisung Pipette nutzt das Gerät, das wir beschreiben hier, ziehen die Larven in die Kanäle, während parallel als sequentielle Laden der Larven ermöglicht Rettung der einzelnen Larven von Post-imaging Anwendung positiven Flow über den gleichen Port. Unser Ansatz erfordert darüber hinaus einen geringeren Platzbedarf, PDMS Vorrichtungen zu konventionellen Glasboden 6-Well-Platten für die Bildgebung verklebt werden können.
Das aktuelle experimentelle Design nutzt separate Geräte für die Mikroinjektion und imaging, in erster Linie, so dass sie mit herkömmlichen Microinjection Ausrüstung und Standard einsetzbar sind invertiert Mikroskope. Mikrofluidische Ansätze zur automatisierten Mikroinjektion Zebrafisch-Eier bereits existieren21, und in Kombination mit "Fischfalle" Typmethoden für hochpräzise Anordnung und Ausrichtung der Larven20, es ist absehbar, dass Geräte integrieren automatisierte Larven Injektion und Bildgebung können auch eines Tages Wirklichkeit.

Zebrafisch entstanden als ein leistungsfähiges Modell für viele Bereiche, von der grundlegenden Entwicklungsbiologie, umfangreiche genetische Studien und chemische Bildschirme1,2. Routinemäßige genetische Manipulationen, wie gen-Überexpression, Zuschlag, CRISPR/Cas9 Mutagenese und Transgenese verlassen sich auf Mikroinjektion von genetischem Material in der einzelligen Zygote, die zur Entwicklung von einfachen, leicht zu bedienende, kommerziell geführt hat verfügbare Tools zur Ausrichtung und Stabilisierung von Eiern für Injektion3. Andere Ansätze, wie z.B. Transplantation und Infektion, erfordern oft Mikroinjektion in späteren Embryonen und Larven mit größeren Spurweite Kapillare Nadeln4. Verwendung von größeren g-Nadeln stellt jedoch erhebliche technische Herausforderungen, da es immer schwieriger, das Zielgewebe zu durchdringen, ohne Drücken oder Rollen des Embryos ist. Unter diesen Bedingungen kann Einholung der entsprechenden Wasser Spannung erforderlich, um den Embryo zu stabilisieren, während Trocknung während des Verfahrens zu vermeiden schwierig ist und die Embryonen nicht ideal für die Injektion in das Zielgewebe orientieren.
Nach Mikroinjektion ist es oft sinnvoll, Bildschirm injizierte Embryonen diejenigen auswählen, die erfolgreich injiziert wurde und Bilder von den ersten Zeitpunkt zu erfassen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir eine Reihe von mikrostrukturierter Apparate entwickelt, die helfen, um 2 Dpf Embryonen in verschiedenen Ausrichtungen Mikroinjektion5, sowohl für schnelle Image-basierten Screening nach der Injektion zu stabilisieren.
Um ausreichende strukturelle Auflösung in diesen Geräten zu erhalten, haben wir photolithographische Techniken verwendet. In mikroelektronischen Industrie und mehr vor kurzem hochgerechnet auf mikrofluidischen Fertigung allgemein verwendet, können diese Ansätze vertikale Strukturen von 1-1.000 µm, einer Skala gut geeignet zur Manipulation von Zebrafisch-Embryonen und Larven bis hin erreichen. Alle Geräte wurden hergestellt mit Polydimethylsiloxan (PDMS), die billig, körperlich robust, biologisch inert und transparent ist.
Mikrostrukturierte Oberfläche Arrays (MSAs) wurden als Blöcke von PDMS mit einer gemusterten Oberfläche formatiert, analog zu der einfache Kanäle in Agarose Blöcken gebräuchlich für Ei Mikroinjektion. Nach der Injektion Screening können 6 imaging-Geräte in ein standard Glasboden-6-Well-Platte angeordnet. Diese Geräte eignen sich für einfache Befüllung von Embryonen, während der Entlade Verfahren bequem Rettung von bestimmten Embryonen, Erleichterung ermöglicht Image-basierte screening Ansätze in benutzerfreundlicher Weise als diese Geräte zuvor erarbeiteten die Beebe-Labor-6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dow Corning Sylgard 184&#160; Polydimethylsiloxane (PDMS)&#160;</td>
			<td>Ellsworth Adhsives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9414-10G</td>
			<td>For casting agarose devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFDTS silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>For casting of negative PDMS molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To anesthetize&#160; zebrafish&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1818</td>
			<td>To trace microinjections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4 (LTB4)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>20110</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3506-50MG</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm Petri dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-757-148</td>
			<td>For Casting from the master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom 6-well plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P06G-0-20-F</td>
			<td>For imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass microcapillaries</td>
			<td>World Scientific Instruments</td>
			<td>TW-100-4</td>
			<td>For microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td>For transferring zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>For loading the microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15111-15</td>
			<td>To punch ports in PDMS imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.&#160;11 Scalpel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td>For cutting PDMS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-10</td>
			<td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marzhauser Micromanipulator</td>
			<td>ASI&#160;</td>
			<td>MM33-R</td>
			<td>For manipulating microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>MSC</td>
			<td>SPI - 87242624</td>
			<td>For mounting micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-3 Picopump controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>To control microinjection volume and timing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS inverted fluorescent microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EVOS FL</td>
			<td>To image injected embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>For visualizing microinjecion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>Download AutoCAD files from: https://dx-doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

Zebrafisch entstanden als ein leistungsfähiges Modell der verschiedenen menschlichen Krankheiten und ein nützliches Werkzeug für eine zunehmende Anzahl von experimentellen Studien über grundlegende Entwicklungsbiologie durch zu großen genetischen und chemischen Bildschirme. Allerdings setzen viele Experimente, insbesondere im Zusammenhang mit Infektionen und Xenograft Modelle auf Mikroinjektion und Bildgebung von Embryonen und Larven, die aufwändige Techniken sind, die Fähigkeit und Kompetenz erfordern. Um die Präzision und den Durchsatz des aktuellen Mikroinjektion Techniken zu verbessern, entwickelten wir eine Reihe von mikrostrukturierter Apparate zu orientieren und zu stabilisieren Zebrafisch-Embryonen im 2 Tage Post Düngung (Dpf) ventral, dorsal oder seitliche Ausrichtung vor der Verfahren. Um die Darstellung der Embryonen zu erleichtern, haben wir auch ein einfaches Gerät mit Kanälen, die 4 Zebrafisch seitlich parallel gegen ein Glas Deckglas orient entwickelt. Zusammen, belegen die Werkzeuge, die wir hier präsentieren die Wirksamkeit photolithographische Ansätze um nützliche Geräte für die Optimierung von Zebrafisch-Techniken zu generieren.

Der hier beschriebene Ansatz zeigt die Konstruktion (Abbildung 1) und Herstellung von Geräten für den Einsatz mit 2 Dpf Zebrafisch, photolithographische (Abbildung 2) und weichen lithografischen (Abbildung 3) Techniken. Mit dieser Methode können Schnelltests vieler Design-Iterationen und Änderungen und Umbauten und Optimierung der Mikrostruktur Dimensionen für die Verwendung mit Zebrafisch auf anderen Stufen der Entwicklung ihrer Anwendung erweitern können.
Wir zeigen Einsatz dieser Geräte für anspruchsvolle Mikroinjektion Techniken und bequeme Imaging. Ohrenoperationen Vesikel (Abbildung 4, weiße gestrichelte Kontur) bietet eine nützlichste, immun-privilegierten und isolierte Website zum Testen von Neutrophilen Rekrutierung im Zebrafisch-9. Testen Sie die Fähigkeit der Zebrafisch Neutrophilen reagieren auf standard Chemoattractants, 100 nM fMLP und LTB4 waren in die Gleichheitspartei Vesikel 2 Dpf Zebrafish Embryos (Abbildung 4F, J), mikroinjiziert mit mikrostrukturierten Kanal Gerät ( Abbildung 1) Embryonen in die seitliche Ausrichtung zu stabilisieren. Injektionen wurden mit hohem Molekulargewicht Rhodamine Dextran verfolgt und in Tg(mpx:EGFP) Embryonen zur Visualisierung der Neutrophilen Rekrutierung Erleichterung durchgeführt. Uninjected Embryonen (Abbildung 4, H) und Embryonen injiziert mit Rhodamin allein (Abbildung 4E, I) als Negativkontrollen verwendet wurden. Nach Mikroinjektion, Embryonen wurden in das Bildverarbeitungsgerät Kanal (Abb. 1A, B) übertragen und in 30 min und 5 h Post Injektion abgebildet mit einem Fluoreszenz-Mikroskop EVOS (Abbildung 4) (Abbildung 4- G und Abbildung 4 H-K, beziehungsweise). Wie erwartet, eine kleine Anzahl von fluoreszierenden Neutrophilen zu Mock injiziert Gleichheitspartei Vesikels an die frühen Timepoint (Abbildung 4I), wahrscheinlich aufgrund von Schäden-vermittelten Rekrutierung rekrutiert. Interessanterweise wurde Rhodamine Dextran Tracer beobachtet während des Experiments in der Otolithen ansammeln. Für beide Chemoattractants (Abbildung 4F, J), Neutrophile rekrutierten sich in größerer Zahl, besonders in Erwiderung auf LTB4 (Abb. 4F).
Die repräsentativen Ergebnisse hier gezeigten zeigen den erfolgreichen Einsatz dieser Methode für die Mikroinjektion und Bildgebung Zebrafisch. Im Rahmen der Zebrafisch Neutrophilenzahl Rekrutierung Assays können Anwendung dieser Werkzeuge in Kombination mit detaillierten live bildgebende Verfahren und anspruchsvolle Zelle Migration Analyse10 eine nützliche Plattform für zukünftige Experimente auf diesem Gebiet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig1.jpg"> Abbildung 1: computerunterstütztes zeichnen (CAD) Gestaltung der Photolithographie Masken. (A-C) CAD-Konstruktion für mikrostrukturierte Oberfläche Divots im seitlichen (A), Ventral (B) und dorsalen (C) Orientierungen zu positionieren. Verschiedene farbige Linien repräsentieren CAD-Maske-Designs für verschiedene Funktionen, mit grünen 100 µm, blau 200 µm und roten 400 µm-Feature-Höhen. Maßstabsleiste = 500 µm. (D-F) CAD-Konstruktion für mikrostrukturierte Kanäle im seitlichen (D), Ventral (E) und dorsalen (F) Orientierungen zu positionieren. Verschiedene farbige Linien repräsentieren Maske Entwürfe für verschiedene Funktionen, mit grünen 100 µm, blau 200 µm und roten 400 µm-Feature-Höhen. Maßstabsleiste: 500 µm. (G-ich) CAD-Konstruktion für imaging-Geräte für Beladung kopfüber (G) oder Heck-erste (H und I). Blaue Linien stellen 400 µm Funktionen, während rote Linien 600 µm Funktionen darstellen. Pfeile zeigen die Richtung, in der Larven geladen werden. Maßstabsleiste = 200 µm. Diese Zahl wurde von Ellett Et Al. modifiziert 5 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig2.jpg"> Abbildung 2: Silikon master Wafer. (A) Oberteil master Wafer zeigt Funktionen für einzelne Larven in Divots orientieren. (B) unten Abschnitt master Wafers zeigt Design für mikrostrukturierte Kanäle. Diese Zahl verändert wurde, vom Ellett Et Al. 5 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig3.jpg"> Abbildung 3: mikrostrukturierte PDMS Geräte. (A) PDMS Block gegossen aus master Wafer Divots für die Orientierung der einzelnen Larven zeigen. (B) PDMS blockieren Besetzung von Meister Wafer mikrostrukturierte Kanäle zeigen. Diese Zahl wurde von Ellett Et Al. modifiziert 5 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig4.jpg"> Abbildung 4: repräsentative Ergebnisse: Imaging-Rekrutierung der Zebrafisch Neutrophilen nach Mikroinjektion Lieferung von Chemoattractants in die Gleichheitspartei Vesikel. (A-B) Be- und Montage Embryonen für die Bildgebung. (A) der Kopf-erste Gerät mit Embryonen geladen, mit der Port angegeben (schwarzer Pfeil). (B) der geladenen Embryonen, nachdem sie in Position (gelber Pfeil) gezeichnet worden sind. (C) 6-Well Glas-Bodenplatte mit imaging-Geräte am Mikroskop. Dieses Format ermöglicht imaging von 4 seitlich Embryonen pro Bohrloch (insgesamt 24 Embryonen), mit einem standard umgekehrtes Mikroskop orientiert. (D-G) Neutrophile (EGFP-grün) in einer uninjected (D) Embryo und folgenden Gleichheitspartei Vesikel Mikroinjektion von Rhodamin Dextran (rote, offene weiße Pfeilspitze) allein (E), 100 nM LTB4 (F) und 100 nM fMLP (G) 30 min Post Einspritzung (Mpi). (H-K) Neutrophile (EGFP-grün) in einem uninjected (H) Embryo und 5 h nach Ohrenoperationen Vesikel Mikroinjektion von Rhodamin Dextran (rote, offene weiße Pfeilspitze) allein (ich), 100 nM LTB4 (J) und 100 nM fMLP (K) 5 h Post Injektion () (HPI). Maßstabsleiste = 200 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen und Larven ist eine entscheidende, aber anspruchsvolle Technik in vielen Modellen der Zebrafisch. Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Microscale Tools zur Unterstützung bei der Stabilisierung und Ausrichtung der Zebrafisch für Mikroinjektion und Imaging.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen und Larven ist eine entscheidende, aber anspruchsvolle Technik in vielen Modellen der Zebrafisch. Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Microscale Tools zur Unterstützung bei der Stabilisierung und Ausrichtung der Zebrafisch für Mikroinjektion und Imaging.

Serie: Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Ganzer Berg Immunhistochemie in Zebrafisch Embryonen und Larven

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

In situ Hybridisierung in Zebrafischlarven und Jungfischen während der Mesonephrosentwicklung

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the specific effects and mechanisms in zebrafish remain unclear. Alizarin red has a high affinity for calcium ions and can help visualize the bone and illustrate skeletal mineral mass. In this study, we aimed to detect lead acetate (PbAc)-induced bone loss in zebrafish larvae by using alizarin red staining. Zebrafish embryos were treated with a series of PbAc concentrations (0, 5, 10, 20 mg/L) between 2 and 120 h post fertilization. Whole-mount skeletal staining was conducted on larvae at 9 days post fertilization, and the total stained area was quantified using ImageJ software. The results indicated that the mineralized tissues were stained in red, and the stained area decreased significantly in the PbAc-exposure group, with a dose-dependent change in bone mineralization. This paper presents a staining protocol for investigating skeletal changes in PbAc-induced bone defects. The method can also be used in zebrafish larvae for the detection of bone loss induced by other chemicals.

Here, we have used alizarin red staining to show that lead acetate exposure causes a bone mass change in zebrafish larvae. This staining method can be adapted to the investigation of bone loss in zebrafish larvae loss induced by other hazardous toxicants.

Verwendung von Alizarin-Rotfärbung zum Nachweis von chemisch induziertem Knochenverlust bei Zebrafischlarven

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

Genetische Modifikation von zerebralen Organoiden von Primaten

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of higher-order cognitive abilities in mammals, in particular, primates. Studying gene functions in primate brains is challenging due to technical and ethical reasons, but the establishment of the brain organoid technology has enabled the study of brain development in traditional primate models (e.g., rhesus macaque and common marmoset), as well as in previously experimentally inaccessible primate species (e.g., great apes), in an ethically justifiable and less technically demanding system. Moreover, human brain organoids allow the advanced investigation of neurodevelopmental and neurological disorders.
As brain organoids recapitulate many processes of brain development, they also represent a powerful tool to identify differences in, and to functionally compare, the genetic determinants underlying the brain development of various species in an evolutionary context. A great advantage of using organoids is the possibility to introduce genetic modifications, which permits the testing of gene functions. However, the introduction of such modifications is laborious and expensive. This paper describes a fast and cost-efficient approach to genetically modify cell populations within the ventricle-like structures of primate cerebral organoids, a subtype of brain organoids. This method combines a modified protocol for the reliable generation of cerebral organoids from human-, chimpanzee-, rhesus macaque-, and common marmoset-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) with a microinjection and electroporation approach. This provides an effective tool for the study of neurodevelopmental and evolutionary processes that can also be applied for disease modeling.

Autor im Rampenlicht: Gezielte Mikroinjektion und Elektroporation von zerebralen Organoiden von Primaten zur genetischen Veränderung  

The electroporation of primate cerebral organoids provides a precise and efficient approach to introduce transient genetic modification(s) into different progenitor types and neurons in a model system close to primate (patho)physiological neocortex development. This allows the study of neurodevelopmental and evolutionary processes and can also be applied for disease modeling.

Gezielte Mikroinjektion und Elektroporation von Hirnorganoiden von Primaten zur genetischen Modifikation

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of ...