Los autores desean agradecer a David Langenau por generosamente proporciona espacio de acuario; Eric Stone, John C. Moore y Qin Tang para ayudar a mantenimiento de pez cebra y reactivos y Anne Robertson y Elliott Hagedorn del laboratorio de Leonard Zon para procurar la variedad de pez cebra utilizada aquí. También le gustaría agradecer a Octavio Hurtado para asesoramiento sobre técnicas photolithographic. FE fue financiado por becas del Hospital de Shriner para los niños y la Asociación Americana de Australia. Este trabajo fue financiado por los NIH grant GM92804.

Microinyección de larvas fue aprobado por la Subcomisión de Hospital General de Massachusetts en investigación Animal cuidado bajo protocolo 2011N000127.
1. fabricación de dispositivo
Nota: Todos asistida por ordenador (CAD) archivos para diseñar máscaras de fotolitografía aquí descritos (figura 1) están disponibles para su descarga. Véase tabla de materiales para los enlaces.
<ol><li>Fabricación de la oblea del molde principal en una sala limpia de clase 1.000 utilizando técnicas photolithographic estándar7. De los canales y arreglos de discos de microestructura, patrón el photoresist negativo epoxy-basado secuencialmente en 3 capas con 3 máscaras separadas, según las instrucciones del fabricante: 100 μm para las características superficiales, 200 μm para las características de medio y 400 μm para las características profundas. Para el dispositivo de proyección de imagen, patrón de dos capas con 400 μm para las características superficiales y 600 μm para las características de profundidad.</li>
	<li>La oblea completa a la base de una placa de Petri para el bastidor (figura 2) de 15 cm de cinta.</li>
</ol>2. preparación de matrices superficie microestructuradas - PDMS
<ol><li>Para hacer que los dispositivos utilizables, la fundición de polidimetilsiloxano (PDMS), mediante la oblea del maestro como un molde. 50 g de monómero PDMS se combinan con 5 g de iniciador y homogeneizar en un plato de pesaje con un tenedor de plástico de plástico.</li>
	<li>Vierte cuidadosamente la mezcla sobre el molde.</li>
	<li>Degas en un desecador de vacío en 16-25 inHg (54-85 kPa) durante 1 hora.</li>
	<li>Para curar el PDMS, cuece al horno a 65 ° C durante al menos 3 horas. El PDMS debe curar a un sólido firme pero flexible.</li>
	<li>Corte con cuidado alrededor del dispositivo en la oblea del maestro con un bisturí, asegurándose de mantener contacto entre la punta del bisturí y la superficie de la oblea. Con unas pinzas, quite la réplica PDMS de la oblea y la transferencia a un limpio 10 cm plato de Petri, lado de la característica (figura 3).</li>
	<li>Tratar el dispositivo con plasma de oxígeno usando un horno de plasma de 35 s para reducir la hidrofobicidad.</li>
	<li>Cubrir con medio de embrión de pez cebra (E3) que contiene 168 mg/L de metanosulfonato de etilo 3-aminobenoate (MS-222, pH 7.5). Quite las burbujas de las características más por las corrientes de agua sobre la superficie del dispositivo usando una pipeta de transferencia.</li>
</ol>3. preparación de matrices superficie microestructuradas - agarosa
<ol><li>Para hacer un molde negativo de PDMS, tratar en primer lugar un dispositivo PDMS con plasma de oxígeno.</li>
	<li>
Tratar el dispositivo PDMS con 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) vapor de silano para crear una superficie inerte8. Brevemente:
	<ol>
<li>Lugar el PDMS ser tratada característica hacia arriba en una cámara de vacío en una campana de humos.</li>
		<li>Al lado de los PDMS, coloque un pequeño recipiente de vidrio o aluminio abierto y cuidadosamente pipetee 200 μL de PFDTS (silano 98%) en el plato. PRECAUCIÓN: PFDTS silano es altamente volátil, reacciona violentamente con el agua, es inflamable y causa daño severo de la piel y los ojos al contacto. Leer MSDS en detalle antes de su uso.</li>
		<li>Cierre la cámara de vacío y aplique vacío durante 15-30 minutos, o hasta que el silano PFDTS se evapora completamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque el dispositivo en una caja Petri y utilizar como molde para PDMS fresco, preparado como se describe en el paso 2.1-2.3.</li>
	<li>Cueza al horno a 65 ° C durante al menos 3 h, luego pelar toda la capa de PDMS fresca desde el dispositivo de tratamiento y en un fresco plato de Petri. Esto puede entonces usarse como molde negativo a agarosa.</li>
	<li>Para preparar la agarosa, hervir una solución de 2% de baja agarosa temperatura gelificación en E3 en el microondas hasta que la agarosa se disuelva completamente.</li>
	<li>Verter la agarosa caliente sobre el molde negativo de PDMS y eliminar las posibles burbujas en la agarosa cubriendo el dispositivo por agarosa caliente que fluye sobre las características con una pipeta de transferencia.</li>
	<li>Una vez que las burbujas se quitan, refrigerar a 4 ° C para establecer la agarosa.</li>
	<li>Desmoldar el bloque de agarosa negativo PDMS deformando el PDMS de debajo con la mano, transferir el bloque de agarosa a una nueva placa de Petri y mojado con E3 con MS-222.</li>
</ol>4. elaboración de PDMS dispositivos de imágenes
<ol><li>Para hacer que los dispositivos utilizables, la fundición de PDMS, uso de la oblea del maestro como un molde. 50 g de monómero PDMS se combinan con 5 g de iniciador (el mismo que utilizan en el paso 2.1) y mezclar cuidadosamente en un plástico plato de pesaje con un tenedor de plástico.</li>
	<li>Vierte cuidadosamente la mezcla sobre el molde.</li>
	<li>Degas en un desecador de vacío en 16-25 inHg (54-85 kPa) durante 1 hora.</li>
	<li>Para curar el PDMS, cuece al horno a 65 ° C durante al menos 3 horas. El PDMS debe curar a un sólido firme pero flexible.</li>
	<li>Cortar los dispositivos de la oblea del maestro y perfore puertos mediante un golpe de 1,5 mm.</li>
	<li>Tratar los dispositivos y un fondo de cristal 6-bien bien la placa con plasma de oxígeno para 35 s, como se describe en el paso 2.6.</li>
	<li>Enlazar un dispositivo característica hacia abajo a cada cubreobjetos de cristal de la placa de la pozo 6 colocando sobre una placa de 85 ° C durante 10 minutos. Nota: Para confirmar la vinculación exitosa, aplique una presión firme al lado del servidumbre dispositivo usando fórceps. El dispositivo debe permanecer pegado al vidrio cubreobjetos.</li>
</ol>5. pez cebra cultura
<ol><li>Embriones de pez cebra de cultura para 2 PD utilizando técnicas estándar3.</li>
	<li>Dechorionate embriones utilizando fórceps o 1 mg/mL de proteasa la mezcla (ver la tabla de materiales)3 por lo menos 30-60 minutos antes de cargar en el dispositivo, para que puedan enderezar.</li>
	<li>Anestesie embriones con solución stock (168 mg/L) MS-222 (pH 7.5), añadir 1 mL de 25 X a la E3 en su placa de Petri.</li>
</ol>6. orientación del pez cebra en superficie microestructurada - arreglos de discos de hierba
<ol><li>Preparar el bloque PDMS de paso 2.7 (Figura 3A) en su placa de Petri que está cubierto por una capa delgada (1-2 mm) de E3, que permite la fácil manipulación de los embriones.</li>
	<li>Transferencia número de embriones (generalmente 10-20 por condición) sobre la superficie del bloque PDMS con una pipeta de transferencia.</li>
	<li>Utilizando una herramienta de micromanipulación (lazo del pelo o similar), introduzca los embriones de los divots microestructuradas (Figura 3A). Uso de chuletas es particularmente adecuada a las orientaciones de la dorsales y ventrales. Nota: Para las chuletas con un mayor ajuste (dorsal y ventral), trate de colocar los embriones en la superficie del bloque en paralelo a la hierba y luego los balanceo en posición usando un lazo del pelo. Empujándolos más profundos en la hierba ayudará a mantenerlos estables.</li>
</ol>7. orientación del pez cebra en superficie microestructurada - canales microestructurados
<ol><li>Extraer el bloque PDMS estampado con microestructurada canales (figura 3B) utilizando una pipeta de transferencia hasta el nivel de E3 cae por debajo del borde del bloque, pero aún está presente en el embalse y canales y en una capa delgada en el PDMS a E3.</li>
	<li>Transferencia 10 embriones de paso 5.3 en el depósito usando una pipeta de transferencia, teniendo cuidado de no desbordar los bordes.</li>
	<li>Usando un lazo del pelo, manipular cada embrión en el embudo a la entrada de la canal y orientar de tal manera que la cabeza del embrión es hacia el canal y el embrión tiene la orientación adecuada al entrar en el canal.</li>
	<li>Deslice cada embrión por el canal usando un lazo del pelo hasta llegar a la orientación microfeatures en las paredes del canal que ayudan a mantener en su lugar. Particularmente se recomienda el uso de canales microestructurados para la orientación lateral. Nota: Para reducir el deslizamiento durante la microinyección de embriones, trate de ajustar la cantidad de tensión superficial dibujando E3 del depósito.</li>
</ol>8. microinyección del pez cebra
<ol><li>
Preparar la aguja de la microinyección.
	<ol>
<li>Hacer el vidrio de borosilicate microcapillary agujas usando un extractor de micropipeta como se describió anteriormente4. Las agujas resultantes deben ser afiladas a un punto en un extremo, con una forma cónica longitud de aproximadamente 10 mm.</li>
		<li>Preparar la solución que se inyecta, en este caso 100 nM chemoattractant (N-formilmetionina-leucina-fenilalanina (fMLP) o leucotrieno B4 (LTB4)) y 100 nM de 70 kDa trazador de dextrano de rodamina en PBS.</li>
		<li>5 μl de solución de carga dentro de la aguja con una pipeta fina afilada punta (véase tabla de materiales).</li>
		<li>Monte la aguja en un micromanipulador montados en un soporte magnético y conectado a una microinyectora picopump.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Romper la punta de la aguja a un ángulo de 45 ° por pellizcar la punta cónica con fórceps.</li>
	<li>Ajustar tamaño de bolo de inyección 1 nL ajustando el tiempo de inyección en el controlador picopump.</li>
	<li>Ajuste el ángulo de la aguja de la microinyección. Un ángulo de la aguja de 45 ° en el controlador de micromanipulación es generalmente un buen punto de partida, con la aguja paralela a la longitud del embrión. Un ángulo más escarpado puede utilizarse para minimizar el movimiento lateral del embrión durante la microinyección.</li>
	<li>Control de la placa de Petri con la mano izquierda y el micromanipulador de aguja con la derecha, llevar la aguja lo más cerca posible al sitio previsto de la microinyección, en este caso la vesícula ótica. Nota: La vesícula ótica puede ser identificada como el órgano oblongo posterior a la vista que contiene dos más pequeñas oscuras oblongas estructuras distintas (otolitos).</li>
	<li>Utilizar el controlador de micromanipulación, penetrar en el tejido objetivo (en este caso la vesícula ótica) tal que la punta de la aguja está dentro de la vesícula e inyectar el volumen preestablecido mediante el pedal de picopump. Nota: Si el tejido resiste la penetración, prueba golpeando suavemente la perilla del regulador de micromanipulación.</li>
	<li>Para liberar los embriones, flujo E3 sobre la superficie de arriba hacia abajo utilizando una pipeta de transferencia, o agitando el plato que los embriones se liberan en el E3 circundante.</li>
	<li>Transfiera los embriones a un plato de recuperación del E3 sin MS-222 con una pipeta de transferencia.</li>
</ol>9. cribado de embriones utilizando el dispositivo de la proyección de imagen de PDMS
<ol><li>Preparar el dispositivo de paso 4.7 flujo E3 (+ MS-222) a través del puerto. Esto puede hacerse utilizando una pipeta de 1000 μl o una pipeta de punta estrecha.</li>
	<li>Llenar el pozo con E3 + MS-222 hasta el aparato.</li>
	<li>Entregar 4 embriones inyectados de paso 8.7 en cada pocillo con una pipeta de transferencia. Embriones se puede previamente anestesiados si desean incubar en E3 + MS-222 1-2 min antes de la carga (paso 5.3).</li>
	<li>Utilizando una herramienta de micromanipulación (lazo del pelo o similar), acomode los embriones en las entradas de los canales de proyección de imagen en la orientación deseada (primero de cola o cefálico, dependiendo del dispositivo utilizado) y empujar parcialmente en el dispositivo (Figura 4A). Esto le ayudará a dibujar en el dispositivo de manera uniforme.</li>
	<li>Dibujar E3 a través del dispositivo desde el puerto con una pipeta o pipeta μL 1.000 hasta que los embriones son introducidos a los canales en la orientación correcta para la proyección de imagen (Figura 4B). Nota: Tenga cuidado de no aspirar los embriones más allá del punto de captura, esto dañará los embriones y cambiar su orientación.</li>
	<li>Transferir la placa de la pozo al microscopio para la proyección de imagen (figura 4).</li>
	<li>
Imagen con un microscopio fluorescente invertido.
	<ol>
<li>Ajustar magnificación seleccionando la lente adecuada. 10 X es generalmente un aumento útil para migración neutrófilo pez cebra la proyección de imagen.</li>
		<li>Ajuste intensidad fuente de luz y tiempo de exposición para cada canal de modo que cada señal es clara, pero no saturado.</li>
		<li>Captura de imágenes para cada canal. Aquí, se utilizaron proteína verde fluorescente (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), rojo de Texas (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) y canales de transmisión. Imágenes multicanales pueden combinarse durante el procesamiento posterior (Figura 4B-I).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Novel+Cancer+Therapies+Using+Chemical+Genetics+and+Zebrafish.">Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish.</a> Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Ellett, F., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructured+Surface+Arrays+for+Injection+of+Zebrafish+Larvae.">Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).</li><li>Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Entrapment+By+Restriction+Array+(ZEBRA)+device:+a+low-cost,+agarose-free+zebrafish+mounting+technique+for+automated+imaging.">Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging.</a> Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).</li><li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices.">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li><li>Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+elastomeric+high-aspect-ratio+microstructures+using+polydimethylsiloxane+(PDMS)+double+casting+technique.">Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique.</a> Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).</li><li>Bhuiyan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+phenylacetic+acid+metabolism+influences+infection+outcome+through+a+direct+effect+on+neutrophil+chemotaxis.">Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).</li><li>Henry, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhagoSight:+an+open-source+MATLAB&#174;+package+for+the+analysis+of+fluorescent+neutrophil+and+macrophage+migration+in+a+zebrafish+model.">PhagoSight: an open-source MATLAB&#174; package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model.</a> PloS one. 8 (8), e72636 (2013).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Hemmil&#228;, S., Cauich-Rodr&#237;guez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+simple,+and+cost-effective+treatments+to+achieve+long-term+hydrophilic+PDMS+surfaces.">Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces.</a> Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish-on-a-chip:+microfluidics+for+zebrafish+research.">Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research.</a> Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).</li><li>Wielhouwer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryo+development+in+a+microfluidic+flow-through+system.">Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system.</a> Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).</li><li>Shen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+student+team+in+a+University+of+Michigan+biomedical+engineering+design+course+constructs+a+microfluidic+bioreactor+for+studies+of+zebrafish+development.">A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development.</a> Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+a+chip:+a+novel+platform+for+real-time+monitoring+of+drug-induced+developmental+toxicity.">Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity.</a> PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+embryo+array+for+automated+trapping,+immobilization+and+microperfusion+of+zebrafish+embryos.">Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos.</a> PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+on+chips:+Microfluidic+living+embryo+array+for+accelerated+in+vivo+angiogenesis+assays.">Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays.</a> Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+brain-wide+activity+in+awake+and+drug-responsive+vertebrates.">High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates.</a> Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).</li><li>Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+in+a+microfluidic+format+using+flexible+and+compliant+channels+and+electroosmotic+dosage+control.">Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control.</a> Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).</li></ol>

Los autores no declaran conflictos de interés.

Aquí, describimos el uso de los dispositivos recientemente desarrollado para facilitar 2 PD pez cebra microinyección5e introducir un dispositivo de montaje libre de agarosa simple imagen conveniente de embriones. Estas herramientas destacan la utilidad de técnicas photolithographic para la fabricación de dispositivos útiles para técnicas de pez cebra.
Hemos encontrado dispositivos MSA particularmente útil para la inyección de células o partículas tienden a la agregación dentro de la aguja de la microinyección, como conidios fúngicos o las células de cáncer humano, que requieren el uso de una aguja de calibre más grande para la entrega. Inyección en la vesícula ótica (figura 4) presenta un reto particular, como embriones a menudo al entrar en contacto con la aguja. Encontramos que el uso de canales microestructurados para orientar y estabilizar el pez cebra en un lateral orientación mejorado enormemente el rendimiento y la precisión de esta técnica en nuestras manos.
Para la proyección de imagen rápida del pez cebra lateralmente orientado en diferentes puntos temporales, tales como evaluación de reclutamiento neutrófilo o metástasis del xenoinjerto, evitando agarosa mayor consistencia de montaje entre embriones y reducidas posibilidades de daños durante la proyección de imagen rescate. Estos dispositivos también muestran prometedores para obtener imágenes de lapso de tiempo prolongado y se han utilizado con éxito captar imágenes multicanales, multiplano con movimiento de peces mínimo durante 12 h. Porque no están limitados por agarosa, elongación activa de las larvas durante este período (~ 300 μm de 54-78 hpf)11 es libre y puede continuar normalmente.
Los pasos más críticos en la preparación y el uso de estas herramientas son comunes al uso de la mayoría de los dispositivos microfluídicos PDMS base: los dispositivos deberán estar bien mojados y evitar burbujas. Para evitar tales problemas, moje los dispositivos en E3 inmediatamente después de que se fabrican, mientras que el hydrophilicity superficial conferida el tratamiento plasma de oxígeno aún está presente. Nuevo tratamiento con plasma de oxígeno también puede utilizarse para restablecer transitoriamente hidrofilicidad de dispositivos PDMS.
Las geometrías exactas utilizadas aquí toman ventaja de la alta resolución de photolithographic técnicas, pero el uso actual de límite de diseños de pez cebra durante el segundo día tras la fertilización. Diseño de geometrías basadas en la plataforma actual permitiría exitosa orientación de 1 PD y el PD 3 para microinyección. Orientación de más boyante 4 dpf larvas con infladas vejigas natatorias sería probablemente más difícil y requieren geometrías ajustados en combinación con la tensión más alta de agua. Dispositivos complejos integración de flujo o vacío podrían proporcionar una alternativa aplicable a una amplia gama de etapas de desarrollo, pero también requeriría el uso de bombas y tubería, aumentando el costo y el riesgo de falla del dispositivo.
PDMS es un material rentable, útil para la fabricación de dispositivos como los descritos aquí, proporcionando la biocompatibilidad, la transparencia y la reutilización. Una desventaja del uso de dispositivos PDMS para pez cebra es hidrofobicidad, lo que puede hacer difícil mantenimiento de capas poco profundas de E3 en la superficie del dispositivo. Este problema puede evitarse por los dispositivos de la microinyección de fundición en agarosa, aunque esto limita la reutilización y aumenta la fragilidad de los dispositivos. Una alternativa preferida sería la identificación de un tratamiento superficial biocompatible que aumenta la hidrofilicidad de PDMS12, o el uso de un sustrato plástico apropiado.
Métodos actuales para la microinyección de pez cebra en PD 2 utilizan agua tensión4 o simples canales emitidos en agarosa usando moldes comerciales para inmovilizar y colocar las larvas. Estos enfoques proporcionan un control limitado de la orientación y pueden complicarse por el secado rápido de los embriones. Las microestructuras integraron en las chuletas y canales utilizados aquí están diseñados para orientar e inmovilizar las larvas sin depender totalmente de la tensión del agua, reduciendo así el riesgo de sequía. Chuletas constituidas moldes impresas 3D se han utilizado previamente para la orientación de embriones para fines de13, aunque la profundidad de estas chuletas las hacía inaccesibles para microinyección.
Uso de sistemas de microfluidos para la proyección de imagen de pez cebra se está convirtiendo en cada vez más común14. Fluir-por los sistemas múltiples se han desarrollado para permitir una observación de desarrollo del pez cebra con el tiempo con la capacidad de introducir compuestos demanda15,16,17. Dispositivos más complejos han sido diseñados para embriones de matriz mientras que aún dentro de su corion, que proporciona una sencilla Geometría esférica que puede ser fácilmente manipulada con relativamente alto rendimiento en estos sistemas18,19. Varios grupos han desarrollado plataformas para colocar y pez cebra estado larvario en diferentes orientaciones6,20, siendo el más fácil de usar el microbomb pasivo sistema de "ZEBRA" desarrollada por el laboratorio Beebe6 la proyección de imagen . A diferencia del sistema de la cebra, el dispositivo que Describimos aquí utiliza succión, generado con una pipeta de transferencia estándar sacar las larvas en los canales, mientras que carga paralelo en lugar de secuencial de larvas permite rescate de larvas individuales de la proyección de imagen por aplicación de flujo positivo a través del mismo puerto. Además, nuestro enfoque requiere un espacio más pequeño, por lo que dispositivos PDMS pueden ser enlazados a placas de 6 pocillos convencional de fondo de cristal para la proyección de imagen.
El diseño experimental actual utiliza diferentes dispositivos para microinyección y principalmente por lo que pueden ser utilizados con el equipo de microinyección convencional y estándar de la proyección de imagen invertida microscopios. Enfoques de microfluidos para automatizado microinyección de huevos de pez cebra ya existen21, y en combinación con métodos de tipo de "trampa de peces" para matriz altamente preciso y la orientación de las larvas20, es previsible que los dispositivos de integración inyección larvas automatizada y la proyección de imagen también pueden un día convertirse en una realidad.

Pez cebra se han convertido en un poderoso modelo para muchos campos, de los estudios de desarrollo biología fundamental a escala genética y química pantallas1,2. Rutina manipulaciones genéticas, como la sobreexpresión del gen, caída, CRISPR/Cas9 mutagénesis y transgénesis dependen de microinyección de material genético en el zigoto unicelular, que ha llevado al desarrollo de simple, fácil de usar, comercialmente herramientas disponibles para orientar y estabilizar huevos para inyección3. Otros enfoques, como el trasplante y la infección, a menudo requieren microinyección en la posterior etapa embriones y larvas con mayor calibre capilar agujas4. Sin embargo, el uso de agujas de calibre más grandes presenta importantes retos técnicos, ya que es más difícil penetrar el tejido sin empujar o rodando el embrión. En estas condiciones, obteniendo la tensión de agua apropiada requerida para estabilizar el embrión mientras que evitar durante el procedimiento de secado es difícil y embriones no sean idealmente orientado para la inyección en el tejido diana.
Tras la microinyección, es a menudo útil embriones inyectados para seleccionar aquellos que han sido inyectados con éxito y para capturar imágenes del momento inicial de la pantalla. Para enfrentar estos desafíos, hemos desarrollado una gama de dispositivos microestructuradas que ayudan a estabilizar 2 embriones de dpf en varias orientaciones para microinyección5y para después de la inyección rápida proyección basada en imágenes.
Para obtener suficiente resolución estructural en estos dispositivos, utilizamos técnicas photolithographic. Se utilizan en las industrias microelectrónicas y más recientemente extrapolarse para la fabricación de microfluidos, estos enfoques pueden alcanzar estructuras verticales que van desde 1-1.000 μm, con una escala adecuada para manipulación de larvas y embriones de pez cebra. Todos los dispositivos fueron fabricados con polidimetilsiloxano (PDMS), que es barato, robusto físicamente, biológicamente inerte y transparente.
Arreglos de superficie microestructuradas (MSAs) fueron el formato de bloques de PDMS con una superficie modelada, análogo a los canales simple en bloques de agarosa utilizadas para microinyección de huevos. Para la investigación después de la inyección, 6 dispositivos de imágenes puede ser vestida en una placa de 6 pozos con fondo de cristal estándar. Estos dispositivos están diseñados para facilitar la carga de los embriones, mientras que el procedimiento de descarga convenientemente permite rescate de embriones específicos, facilitando imágenes evaluación enfoques de una manera más fácil de utilizar que los dispositivos desarrollado previamente por el Beebe laboratorio6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dow Corning Sylgard 184&#160; Polydimethylsiloxane (PDMS)&#160;</td>
			<td>Ellsworth Adhsives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9414-10G</td>
			<td>For casting agarose devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFDTS silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>For casting of negative PDMS molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To anesthetize&#160; zebrafish&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1818</td>
			<td>To trace microinjections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4 (LTB4)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>20110</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3506-50MG</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm Petri dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-757-148</td>
			<td>For Casting from the master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom 6-well plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P06G-0-20-F</td>
			<td>For imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass microcapillaries</td>
			<td>World Scientific Instruments</td>
			<td>TW-100-4</td>
			<td>For microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td>For transferring zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>For loading the microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15111-15</td>
			<td>To punch ports in PDMS imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.&#160;11 Scalpel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td>For cutting PDMS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-10</td>
			<td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marzhauser Micromanipulator</td>
			<td>ASI&#160;</td>
			<td>MM33-R</td>
			<td>For manipulating microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>MSC</td>
			<td>SPI - 87242624</td>
			<td>For mounting micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-3 Picopump controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>To control microinjection volume and timing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS inverted fluorescent microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EVOS FL</td>
			<td>To image injected embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>For visualizing microinjecion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>Download AutoCAD files from: https://dx-doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

Pez cebra han emergido como un poderoso modelo de varias enfermedades humanas y una herramienta útil para una gama cada vez mayor de estudios experimentales, que abarca la biología del desarrollo fundamental a través de las pantallas genéticas y químicas a gran escala. Sin embargo, muchos experimentos, especialmente los relacionados con infección y modelos de xenoinjerto, dependen de la microinyección y la proyección de imagen de los embriones y larvas, que son técnicas laboriosas que requieren habilidades y conocimientos. Para mejorar la precisión y el rendimiento de las técnicas de microinyección actuales, hemos desarrollado una serie de dispositivos microestructuradas para orientar y estabilizar embriones de pez cebra en 2 días post fertilización (dpf) en posición ventral, dorsal o lateral antes del procedimiento. Para ayudar en la proyección de imagen de los embriones, también hemos diseñado un dispositivo simple con los canales que Oriente 4 pez cebra lateralmente en paralelo contra un cubreobjetos de vidrio. Juntos, las herramientas que presentamos aquí demuestran la efectividad de enfoques photolithographic generar dispositivos útiles para la optimización de las técnicas de pez cebra.

El enfoque descrito aquí muestra el diseño (figura 1) y la fabricación de dispositivos para el uso con 2 pez cebra de la PD, utilizando técnicas de (figura 3) litografía suave y photolithographic (figura 2). Este método permite la prueba rápida de muchas iteraciones de diseño y las modificaciones y alteraciones y optimización de dimensiones microestructura para uso con el pez cebra en otras etapas de desarrollo pueden ampliar su aplicación.
Se demuestra el uso de estos dispositivos para difíciles técnicas de microinyección y la proyección de imagen conveniente. La vesícula ótica (figura 4, blanco contorno discontinua) proporciona un sitio útil, inmune privilegiados y aislado para las pruebas de reclutamiento de neutrófilo en el pez cebra9. Para probar la capacidad de los neutrófilos de pez cebra para responder al estándar atrayentes, 100 nM de fMLP y LTB4 fueron microinyectados en las vesículas óticos de 2 embriones de pez cebra de dpf (figura 4F, J), utilizando el dispositivo de canal microestructuradas ( Figura 1) para estabilizar los embriones en la orientación lateral. Inyecciones fueron trazadas con alto peso molecular dextrano de rodamina y realizadas en embriones de Tg(mpx:EGFP) para facilitar la visualización de reclutamiento neutrófilo. Uninjected embriones (figura 4, H) y los embriones inyectados con rodamina solo (figura 4E, I) se utilizaron como controles negativos. Tras la microinyección, embriones fueron transferidos en el dispositivo de canal de proyección de imagen (figura 1A, B) y fotografiada con un microscopio fluorescente de EVOS (figura 4) en 30 minutos y 5 horas post inyección (figura 4- G y figura 4 H-K, respectivamente). Como se esperaba, un pequeño número de neutrófilos fluorescentes reclutaron a la vesícula ótica mock-inyecta en el punto temprano (figura 4I), probablemente debido a la selección mediada por el daño. Curiosamente, el rastreador de dextrano de rodamina se observó que se acumulan en los otolitos durante el experimento. Para ambos atrayentes (figura 4F, J), neutrófilos reclutados en números más altos, particularmente en respuesta a LTB4 (figura 4F).
Los resultados representativos que se muestra a continuación demuestran el uso acertado de este método para la microinyección y la proyección de imagen de pez cebra. En el contexto de análisis de reclutamiento de neutrófilos de pez cebra, aplicación de estos instrumentos en combinación con técnicas de imagen energizadas toda y sofisticado celular migración análisis10 puede proporcionar una plataforma útil para futuros experimentos en este campo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig1.jpg"> Figura 1: diseño del dibujo (CAD) de máscaras de fotolitografía asistido por ordenador. (A-C) Diseño CAD para chuletas superficie microestructuradas para colocación lateral (A), ventral (B) y dorsal (C) orientaciones. Diferentes líneas de colores representan CAD máscara diseños para diferentes características, con el μm 100 verde, azul 200 μm y alturas de característica de 400 μm rojo. Barra de escala = 500 μm. (D-F) diseño CAD para canales microestructurados para colocación lateral (D), ventral (E) y dorsal (F) orientaciones. Diferentes líneas de colores representan diseños de máscara para diferentes características, con el μm 100 verde, azul 200 μm y alturas de característica de 400 μm rojo. Barra de escala: 500 μm. (G-I) diseño de CAD para dispositivos diseñados para carga cefálico (G) o primera en cola (H e I) la proyección de imagen. Líneas azules representan características de 400 μm, mientras que las líneas rojas representan 600 μm características. Las flechas muestran la dirección en la que las larvas se cargan. Barra de escala = 200 μm. Esta figura ha sido modificada desde Ellett et al. 5 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig2.jpg"> Figura 2: principal oblea de silicona. (A) la sección superior de oblea maestro muestra características de orientación individuales larvas en chuletas. (B) sección de oblea maestro que muestra el diseño de canales microestructurados de fondo. Esta figura ha sido modificada desde Ellett et al. 5 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig3.jpg"> Figura 3: dispositivos de PDMS microestructuradas. (A) PDMS bloques de oblea maestro mostrando chuletas para orientar las larvas individuales. (B) PDMS bloque fundido de oblea maestro mostrando canales microestructurados. Esta figura ha sido modificada desde Ellett et al. 5 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig4.jpg"> Figura 4: resultados representativos: reclutamiento de neutrófilos de pez cebra después del nacimiento de microinyección de atrayentes en la vesícula ótica de la proyección de imagen. (A-B) Carga y montaje de embriones para la proyección de imagen. Dispositivo (A) el primero de cabeza con embriones listos para la carga, con el puerto indicado (flecha negra). (B) la carga de embriones después de que han sido elaborados en su posición (flecha amarilla). (C) placa de fondo de cristal de 6 pozos con dispositivos en microscopio de imágenes. Este formato permite la proyección de imagen de 4 lateralmente orientado a embriones por pozo (total 24 embriones), utilizando un microscopio invertido estándar. (D G) Neutrófilos (EGFP-verde) en un embrión (D) uninjected y siguiente vesícula ótica microinyección de dextrano de rodamina (flecha blanca rojo, abierto) solo (E), 100 nM LTB4 (F) y 100 nM fMLP (G) 30 min después de la inyección (mpi). (H K) Neutrófilos (EGFP-verde) de un embrión (H) uninjected y 5 h después de la vesícula ótica microinyección de dextrano de rodamina (flecha blanca rojo, abierto) solo (), 100 nM LTB4 (J) y 100 nM fMLP (K) 5 h post inyección ( HPI). Barra de escala = 200 μm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae at JoVE.com

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Microinyección de embriones de pez cebra y larvas es una técnica difícil pero crucial en muchos modelos de pez cebra. Aquí, presentamos una gama de herramientas de microescala para ayudar en la estabilización y la orientación del pez cebra para la microinyección y la proyección de imagen.

Dispositivos microestructurados para microinyección optimizado y la proyección de imagen de larvas de pez cebra

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K vistas.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Microinyección de embriones de pez cebra y larvas es una técnica difícil pero crucial en muchos modelos de pez cebra. Aquí, presentamos una gama de herramientas de microescala para ayudar en la estabilización y la orientación del pez cebra para la microinyección y la proyección de imagen.

Video: Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

El seguimiento de las células en el pez cebra transgénico GFP-Uso del sistema de fotoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

In situ Hibridación en larvas y juveniles de pez cebra durante el desarrollo de Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the specific effects and mechanisms in zebrafish remain unclear. Alizarin red has a high affinity for calcium ions and can help visualize the bone and illustrate skeletal mineral mass. In this study, we aimed to detect lead acetate (PbAc)-induced bone loss in zebrafish larvae by using alizarin red staining. Zebrafish embryos were treated with a series of PbAc concentrations (0, 5, 10, 20 mg/L) between 2 and 120 h post fertilization. Whole-mount skeletal staining was conducted on larvae at 9 days post fertilization, and the total stained area was quantified using ImageJ software. The results indicated that the mineralized tissues were stained in red, and the stained area decreased significantly in the PbAc-exposure group, with a dose-dependent change in bone mineralization. This paper presents a staining protocol for investigating skeletal changes in PbAc-induced bone defects. The method can also be used in zebrafish larvae for the detection of bone loss induced by other chemicals.

Here, we have used alizarin red staining to show that lead acetate exposure causes a bone mass change in zebrafish larvae. This staining method can be adapted to the investigation of bone loss in zebrafish larvae loss induced by other hazardous toxicants.

Uso de tinción de rojo de alizarina para detectar la pérdida ósea inducida químicamente en larvas de pez cebra

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

Modificación genética de organoides cerebrales de primates

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of higher-order cognitive abilities in mammals, in particular, primates. Studying gene functions in primate brains is challenging due to technical and ethical reasons, but the establishment of the brain organoid technology has enabled the study of brain development in traditional primate models (e.g., rhesus macaque and common marmoset), as well as in previously experimentally inaccessible primate species (e.g., great apes), in an ethically justifiable and less technically demanding system. Moreover, human brain organoids allow the advanced investigation of neurodevelopmental and neurological disorders.
As brain organoids recapitulate many processes of brain development, they also represent a powerful tool to identify differences in, and to functionally compare, the genetic determinants underlying the brain development of various species in an evolutionary context. A great advantage of using organoids is the possibility to introduce genetic modifications, which permits the testing of gene functions. However, the introduction of such modifications is laborious and expensive. This paper describes a fast and cost-efficient approach to genetically modify cell populations within the ventricle-like structures of primate cerebral organoids, a subtype of brain organoids. This method combines a modified protocol for the reliable generation of cerebral organoids from human-, chimpanzee-, rhesus macaque-, and common marmoset-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) with a microinjection and electroporation approach. This provides an effective tool for the study of neurodevelopmental and evolutionary processes that can also be applied for disease modeling.

Autor destacado: Microinyección dirigida y electroporación de organoides cerebrales de primates para la modificación genética  

The electroporation of primate cerebral organoids provides a precise and efficient approach to introduce transient genetic modification(s) into different progenitor types and neurons in a model system close to primate (patho)physiological neocortex development. This allows the study of neurodevelopmental and evolutionary processes and can also be applied for disease modeling.

Microinyección dirigida y electroporación de organoides cerebrales de primates para la modificación genética

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of ...