P.E. is supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 and the Graduate School of the Technische Universit&#228;t M&#252;nchen (TUM-GS). G.P. was supported by TUM-GS. L.T. is supported by an EMBO fellowship (EMBO ALTF 108-2013). D.P.'s work on zebrafish was supported by the DFG through the Sonderforschungsbereich "Molecular Mechanisms of Neurodegeneration" (SFB 596); the Center for Integrated Protein Sciences (Munich) and the European Community's Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under Grant agreement no. 200611 (MEMOSAD). He is currently a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow and was supported by a fellowship from the German Academy of Sciences Leopoldina. L.G. is supported by funding from the DFG through SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits", Project A11. 
We are grateful to Kristina Wullimann for maintaining our fish facility, Yvonne Hufnagel for technical support and Thomas Misgeld for comments on the manuscript. We are grateful to R. K&#246;ster (Technische Universit&#228;t Braunschweig) for providing the M1 Medusa vector (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) from which we cloned out Centrin-YFP and S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for providing the 14xUAS:MA-cerulean cassette which we used to generate the reporter construct to make CentrinFish. We further thank S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for the Otx2:Gal4 transgenic line, A. Sagasti for the Sensory:Gal4-VP16 construct (UCLA) and M. Nonet (Washington University in St. Louis) for the pCold Heart Tol2 vector. We acknowledge Bettina Schmid, Alexander Hruscha and Christian Haass (German Center for Neurodegenerative Diseases Munich - DZNE) for contributing to the development of MitoFish.

The authors have nothing to disclose.

Hier zeigen wir die Vielseitigkeit des Gal4-UAS - Expressionssystem zur fluoreszenz tag Mitochondrien Zentrosomen und die Zellmembranen von spezifischen Zelltypen in vivo in Zebrabärbling - Embryonen. Viele fluoreszierende Fusionsproteine ​​, die andere Organellen oder subzellulärer Strukturen beschriften kann in der veröffentlichten Literatur zu finden und kann von dem jeweiligen Labor, kommerziellen Quellen oder nichtkommerziellen Plasmid Hinterlegungsstellen (zB Addgene) erhalten werden. Zu entwerfen, müssen ein neues fluoreszierendes Fusionsprotein, mehrere Parameter berücksichtigt werden, darunter die FP zu verwenden, und ob die FP am Amino- oder Carboxy-Terminus des Proteins von Interesse zu fusionieren. Für eine gründlichere Diskussion über fluoreszierende Fusionsproteine ​​zu erzeugen, werden die Leser zu ausführlichen Artikel über das Thema 49-51 bezeichnet. Wir heben drei Strategien zur Erreichung Co-Expression von Fusionsproteinen UAS-driven Transgene verwenden. Mehrere, separate UAS Reporterkonstrukte erlauben verschiedene bestehende Reporter für die Kombination von Konstrukten ohne die Notwendigkeit von zusätzlichen Klonen. Reporter-Expressionsniveaus kann auch unabhängig titriert werden. Allerdings höhere Co-Expression erreicht werden, wenn entweder mehrere UAS Kassetten oder eine bidirektionale UAS-Kassette auf einem einzigen Konstrukt verwendet werden. Da FPs als Tags verwendet werden, ist es relativ einfach, die Co-Expression zu verifizieren. Es sollte beachtet werden , dass andere Verfahren für Multi-cistronische Expression auch existieren, einschließlich der Verwendung von internal ribosomal entry Seiten 40 und viralen 2A Peptide 52,53. Als Alternative zu DNA basierten Konstrukten in vitro transkribiert verkappte mRNA verwendet werden können , fluoreszierende Fusionsproteine ​​zu exprimieren subzellulären Strukturen 1,4,8 zu etikettieren. Der Nachteil dieses Ansatzes ist jedoch, dass die Expression in den ersten Tagen der Entwicklung begrenzt ist, und wird die Zelle oder das Gewebe nicht spezifisch. Unabhängig von der gewählten Methode Fusionsproteine ​​zu exprimieren, ist es entscheidendum sicherzustellen, dass die Expressionsniveaus den physiologischen Zustand der Zellen führen nicht zu einer nicht-spezifischen Kennzeichnung und Kompromisse. In dieser Hinsicht kann die Verstärkung der Expression des Reportergens inhärent in dem Gal4-UAS System 27 problematisch sein, beispielsweise als cytosolische Kennzeichnung manifestieren , auch wenn der FP zu einer bestimmten Organelle ausgerichtet ist. Wenn vorhanden, sollten Antikörper verwendet werden, um zu überprüfen, ob die Expression erhaltenen Muster von Fusionsproteinen, die endogene Situation widerspiegeln. In einigen Fällen kann die Injektion von niedrig (er) DNA-Konzentrationen konnte das Problem der Fehllokalisierung des Fusionsproteins zu mildern. Alternativ Vektoren mit einer geringen Anzahl von UAS Wiederholungen könnte helfen , die Konzentration Transgen - Expression 30 bis titrieren nach unten. Ähnlich wird für den Aktivator Gal4-VP16, modifizierte Versionen existieren, das die Expression berichtet vergleichsweise schwach zu treiben und sind daher weniger toxisch 30,33. Wenn mis-Lokalisierung des Fusionsproteins besteht trotz Bemühungen dow titrierenn Transgen-Expressionsniveaus, kann es notwendig sein, die Gal4-UAS-System zu verzichten und Antriebs Expression durch Promotorelemente direkt. Die stabilen transgenen Linien, MitoFish 10 und CentrinFish 12, beschreiben wir in diesem Manuskript wurden mit 14xUAS Kassetten gemacht. Wir halten diese Zeilen im Hintergrund von Gal4 Treiberleitungen Veränderungen über Generationen hinweg in Ausdruck zu erfassen, da Reporter Linien mit mehreren UAS wiederholt berichtet , wurden zum Schweigen zu bringen 54 anfällig zu sein. Wir haben keine Beweise für die drei Generationen zum Schweigen zu bringen über gesehen wir die CentrinFish ausgebreitet haben. Wir haben jedoch bunten Ausdruck in MitoFish und deshalb stringent wählen Embryonen mit &#39;voll&#39;, starke Ausdrucksebenen für zukünftige Generationen zu verbreiten gesehen. Die aktuelle Literatur legt nahe, dass Expressionsvektoren mit 5xUAS Wiederholungen könnte eine Alternative zur Erzeugung von stabilen transgenen Linien sein - der Reporterangetrieben hoch genug Ebenen 30 und die vergleichsweise geringe Anzahl von UAS wiederholt kann es weniger machen anfällig für Transgen - Silencing, obwohl sich nicht wiederholende UAS Wiederholungen weniger angeblich sogar über 54 anfällig. Die Palette der FPs derzeit verfügbaren Tag Organellen oder anderen subzellulärer Strukturen ist sehr breit 55. Wenn eine bestimmte FP als Tag der Auswahl Überlegung sollte auf die folgenden Parameter angegeben werden: Erstens, um die Anregungs- und Emissionsspektren des FP bestimmen für seine Visualisierung erforderlich, um die spezifische Laserlinie sowie die Anregungs- und Emissionsfiltern. Zweitens, die Helligkeit und Photostabilität des FP. Dritte, mit dem die Geschwindigkeit reift der FP folgende Übersetzung. Viertens, ob die FP hat eine Tendenz, in Fusionen zu aggregieren. In Bezug auf den letzten Parameter sollte darauf Experimente ausgeübt und Kontrolle sollte die Eignung jedes FP für bestimmte Experimente zu testen, durchgeführt werden. Zum Beispiel, während die Wiederd FPs mCherry und DsRed sind weit verbreitet, sie 56 Berichten zufolge Aggregate in bestimmten Fusionen bilden. Wir haben TagRFP-T 57, eine photostabile Variante TagRFP, fand eine gute Leistung , wenn an die Mitochondrien zielgerichtet und an Zellmembranen (nicht veröffentlichte Beobachtungen). Wenn mehrere Organellen müssen gleichzeitig visualisiert werden, FPs mit nicht-überlappenden Spektren verwendet werden soll. Wir haben erfolgreich Kombinationen von Cyan FPs (GFP und Cerulean) und YFP (Abbildungen 2-4) verwendet. Durch die Ausnutzung der gesamten Spektralbereich von blau bis zum nahen Infrarot, kann man deutlich die Anzahl der subzellulärer Strukturen erweitern , die gleichzeitig 2 sichtbar gemacht werden kann. Zusätzlich zu dem herkömmlichen FPs, photoaktivierbare FPs sind besonders nützlich Organell Dynamik Sonde, beispielsweise die Verwendung des FP Kaede 58 das Schicksal einzelner Mitochondrien zu verfolgen. Welche Mikroskopietechnik - Weitfeld oder konfokalen - ist diegeeignet für Abbildungs ​​hängt von einer Reihe von Faktoren ab, die Lage der Zellen, einschließlich mit dem spezifischen subzellulären oder zelluläre Ereignisse zu erwarten abgebildet werden und die Geschwindigkeit werden. Weitfeldmikroskopie ist die bevorzugte Modalität in den oberflächlichen Lagen und spärlich markierten Proben. Es bietet eine Foto-Toxizität und Bildgebung mit hoher Geschwindigkeit zu einem vernünftigen Preis. Wenn jedoch Bildgebung in nicht-oberflächliche Teile der Zebrabärbling durchgeführt werden muss, in dicht markierten Proben oder dreidimensionale Information, konfokale oder eine andere Form des optischen Schneidens Mikroskopie zu gewinnen wird die Methode der Wahl. Unabhängig davon, welche zellulären oder subzellulären Struktur überwacht wird, gibt es oft ein Kompromiss zwischen das bestmögliche Bild zu erwerben und die Probe am Leben und in einem guten physiologischen Zustand für wiederholte Zeitraffer-Bildgebung zu halten. Photo-Toxizität können als Veränderungen manifestieren im Verhalten von Organellen, aberrant Morphologie von Zellen oder sogar ZellTod. Schlüssel zur Verringerung Photobleaching und Phototoxizität für beide Breitfeld und der konfokalen Mikroskopie ist es, die höchstmögliche, Licht, um Bilder zu erwerben. In dieser Hinsicht Ziele mit möglichst hoher NA sind Schlüssel die Menge des Fluoreszenzsignals zu maximieren, die gesammelt werden können. Für die konfokale Mikroskopie kann eine Anzahl von Parametern für die Verwendung niedrigerer Laserleistung zu kompensieren, werden eingestellt. Detektoren mit höherer Quantenwirkungsgrad zu herkömmlichen PMTs verglichen, beispielsweise Galliumarsenid - Phosphid - Detektoren kann diese emittierten Photonen sind eher erkannt werden , um sicherzustellen , verwendet werden. Alternativ oder zusätzlich höher Dynode Spannungen können in der PMT angewendet werden, um die Empfindlichkeit der Detektoren erhöhen. Die konfokale Blende (Pinhole) kann geöffnet werden, für die Sammlung von mehr Fluoreszenzsignal zu ermöglichen, wenn auch mit einem Verlust von axialen Auflösung. Um die Proben so wenig Licht wie möglich aussetzen, Scannen sollte, dass die Verweilzeit bei hohen Geschwindigkeiten so getan werden,der Laser pro Pixel ist gering. Scanning bei niedrigeren räumlichen Auflösung hat auch den Effekt, daß die Geschwindigkeit der Abtastung erhöht wird. Imaging weniger häufig hat den zusätzlichen Vorteil, dass die Probe auf weniger Licht ausgesetzt wird, sollte jedoch nur berücksichtigt werden, wenn sie nicht die umfassende Beprobung der untersuchten Prozesse nicht beeinträchtigt. Als Alternative Drehscheiben-konfokale Mikroskope und konfokale Mikroskope, die mit einem so genannten &quot;Resonanz &#39;Scanner ausgestattet sind, bieten die Möglichkeit für schnelles Scannen. Beide Modalitäten haben den Vorteil, dass sie schneller und weniger phototoxische als &quot;klassische&quot;, Punkt-Scanning-konfokalen Mikroskopen. Allerdings sind sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskopen begrenzteren in z-Auflösung und kann nicht so tief in das Gewebe als Punkt-Scanning-konfokale Mikroskope eindringen. In ähnlicher Weise kann die Anwendung von Resonanzscanner konfokale Mikroskope wie die sehr kurze Pixelverweilzeit begrenzt wird zu einer schlechteren Bildqualität führen, die konnte,wiederum schließt die Detektion von subzellulären Ereignisse (zB binäre Bilder mit reduziertem Signal-to-noise). Schließlich, während Weitfeld und konfokaler Bildgebung hier hervorgehoben werden, andere Formen der Lichtmikroskopie wie Zwei-Photonen - 59 und Lichtmikroskopie Blatt 60 könnte besser geeignet für bestimmte Fragen sein. Zwei-Photonen-Mikroskopie wird durch die gleichzeitige Absorption von zwei Photonen im infraroten Bereich des Lichtspektrums auf der Anregung eines Fluorophors basiert. Gemeinsam mit der konfokalen Mikroskopie, verwendet es Punkt Scannen von Bildern von der Probe zu erfassen und hat optische Sektionierung Fähigkeiten aufgrund der Nichtlinearität der Zweiphotonenanregung. Die Verwendung von Licht langer Wellenlänge zur Anregung Fluorophor ermöglicht Abbildungstiefen mehreren hundert Mikrometern von der Oberfläche. Des Weiteren die Beschränkung der Anregung zu einem kleinen Abbildungsvolumen verhindert, Photobleaching und Phototoxizität außerhalb der Brennebene. Allerdings sind nicht alle FPs haben eine hohe Multiphotonenabsorption Querschnitte, ein Problem, das besonders weit verbreitet in roten FPs ist. Darüber hinaus, um eine einzelne Infrarot-Wellenlängen finden gleichzeitig mehrere unterschiedliche FPs erregt ist schwierig, Multi-Channel-Bildgebung umständlich macht. Lichtbogen-Mikroskopie verwendet eine dünne &quot;Blatt&quot; (typischerweise Dicke im Bereich von 2 bis 10 &amp; mgr; m) von Laserlicht, um die Probe anzuregen und detektiert Fluoreszenzsignale von dieser beleuchteten Brennebene in einem rechten Winkel eine empfindliche Kamera. Optische Schnitte wird durch die Beleuchtung einer einzigen Ebene zu einer Zeit erreicht. Diese Beschränkung des Anregungslichts verringert das Auftreten von Phototoxizität. Da Fluoreszenzsignale aus der gesamten beleuchteten Ebene gleichzeitig gesammelt werden, ist die Bildaufnahme deutlich schneller als Punktabtastung konfokale und Multiphotonen-Mikroskope. All diese Eigenschaften machen Lichtbogen-Mikroskopie besonders geeignet dynamische zelluläre Ereignisse zu Tomographie mit hoher Raum-Zeit-Auflösung ingroße Mengen von lebenden Proben. Tatsächlich wurde mit Hilfe von Licht-Blatt - Mikroskopie Zellschicksal im gesamten Zebrafischembryo umfassend während der ersten 24 Stunden der Entwicklung 61 verfolgt. Bei fortgesetzter Verbesserung bessere Abbildungspenetrations 62,63 und räumlicher Auflösung 64 ist es denkbar , dass Lichtbogendynamik Mikroskopie verwendet wird , um die Sonde nicht nur auf zellulärer als auch auf subzellulärer Ebene in ganz Zebrafischembryonen.

In - vivo - Bildgebung bietet eine direkte Visualisierung von zellulären Verhalten in der die meisten physiologischen Kontext. Die Transparenz der Genaktivität, deren schnelle und externe Entwicklung und eine reiche Auswahl an genetischen Werkzeugen , die Fluoreszenz - Markierung ermöglichen , sind alle auf den wachsenden Einsatz von In - vivo - Mikroskopie beigetragen , die Dynamik der wichtigsten Entwicklungsereignisse aufzuklären. Imaging - Studien von Entwicklung des Nervensystems in Zebrabärbling haben zum Beispiel unser Wissen über das Verhalten von neuralen Vorläuferzellen und das Schicksal ihrer Nachkommen einschließlich ihrer späteren Migration erweitert, Differenzierung und Schaltungsintegration 1-8. Die Bühne ist nun eingestellt, die subzellulären Dynamik zu untersuchen, diese zellulären Verhaltensweisen zugrunde liegen. Tatsächlich sind, Zebrabärbling bereits als Werkzeuge werden für die in vivo Zellbiologie ausgebeutet. Es ist nun möglich , die Mitochondrien zu visualisieren 9-11, Zentrosomen 2,8,12-14, Golgi 15, Die Mikrotubuli 4 und Aktin - Zytoskelett 16, Endosomen 17 und Komponenten des Apikalmembran komplexen 1.18 unter anderem subzellulärer Strukturen in Zebrafischembryonen in vivo. Bisher viel von dem, was über die Funktion dieser Organellen bekannt ist, kommt von ihrem Verhalten in kultivierten Zellen zu studieren. Während in - vitro - Studien enormen Einblick in die Zellbiologie ergeben haben, Zellen in Kultur repräsentieren nicht vollständig die Komplexität der in vivo - Situation und daher nicht notwendigerweise die Funktion und Dynamik subzellulärer Organellen in vivo widerspiegeln. Zebrabärbling - Embryonen bieten eine tragfähige in vivo alternative subzellulären Dynamik zu untersuchen. Da Vertebraten besitzen Zebrabärbling viele Organsysteme (beispielsweise neurale Netzhaut), die mit denen in Säugetierspezies gefunden homolog sind. Zusätzlich werden Genaktivität zunehmend eingesetzt, um menschliche Krankheiten zu modellieren 19,20 </snach oben&gt; (Mikrozephalie 21 und Leber 22 kongenitale Amaurose zB) einschließlich und auf die mitochondriale Funktion im Zusammenhang mit zentrosomalen Funktion (zB Parkinson - Krankheit 23, Tauopathies 10,24 und Barth - Syndrom 25). In - vivo - Bildgebung auf zellulärer und subzellulärer Ebene in diesen Fällen wird ein besseres Verständnis der Zellbiologie erlauben diese pathologischen Zustände zugrunde liegen. Das übergeordnete Ziel der hier beschriebenen Methoden ist es, eine umfassende Anleitung zur Verfügung zu stellen Organellen und andere subzellulärer Strukturen in Zebrafischembryonen in vivo Lichtmikroskopie zu untersuchen. Der gesamte Arbeitsablauf beteiligt bei der Visualisierung und Verfolgung von subzellulärer Strukturen in vivo beschrieben - von der genetischen Markierung Ansätze zur Erzeugung von transiente Expression und stabile transgene Fische und schließlich mit großem Feld und konfokale Mikroskopie auf Bildgebung. Während jedes dieser procedures von zahlreichen Zebrabärbling Laboratorien verwendet wird, die beschriebenen Protokolle werden optimiert und rationalisiert für die Dynamik subzellulärer Strukturen zu untersuchen. Zwei spezifische Aspekte der Arbeit hier beschriebenen rechtfertigen erwähnt: Erstens, die Verwendung des Gal4-UAS-Expressionssystems in verschiedenen Konfigurationen zu genetisch Etikett Organellen in bestimmten Zelltypen. Zweitens ist ein direkter Vergleich der Weitfeld und konfokale Mikroskopie Bild subzellulärer Strukturen in vivo. Aktuelle Strategien zur genetisch Label Organellen und andere subzellulärer Strukturen in Zebrabärbling entweder nutzen verkappte mRNA 1,4,8 oder DNA - basierte Konstrukte , wo Promotorelemente , die Expression von Fusionsproteinen 9,14,15 direkt fahren. In vitro transkribierten RNA gekappt Ergebnisse in schnelle und breite Ausdruck, das ist aber nicht gewebespezifisch. Zusätzlich verringern Expressionsniveaus im Laufe der Zeit als das verkappte RNA verdünnt wird oder abgebaut. Somit ist die Verwendung von RNA-basiertenKonstrukte zu Organell Dynamik in späteren Stadien in der Entwicklung beschränkt ist (in der Regel bis zu 3 Tage nach der Befruchtung) untersuchen. Diese Einschränkungen können durch die Verwendung von DNA-Konstrukten überwunden werden, wo räumliche und zeitliche Kontrolle der Expression durch spezifische Promotorelemente bestimmt wird. Wenn DNA - Konstrukte basieren in Kontext der Gal4-UAS - System wesentliche Verbesserungen an Transgen - Expressionsniveaus verwendet werden , werden 26,27 beobachtet. In diesem bipartite Expressionssystem, Zelltyp-spezifische Promotorelemente treiben, die Expression eines Transkriptionsaktivators Gal4, während Reportergenen stromabwärts von der Gal4-Bindungsstromaufwärts Aktivierungssequenz kloniert werden (UAS). Durch UAS Reporter mit entsprechenden Gal4 Treiber kombinieren, können die Expression auf bestimmte Zelltypen beschränkt werden, wodurch die Notwendigkeit umgangen werden jedes Mal zu klonen Reportergene hinter verschiedenen Promotoren eine spezifische Expressionsmuster gewünscht wird. Des Weiteren kann die Expression mehrerer UAS Reportergene seindurch einen einzigen Gal4 Aktivator angetrieben. Das Gal4-UAS-System stellt somit ein vielseitiges und flexibles genetischer Ansatz für subzelluläre Kennzeichnung. Breitfeld und konfokale Mikroskope sind die Arbeitstiere der meisten Laboratorien. Weitfeldsysteme typischerweise eine Bogenlampe als Lichtquelle verwenden, und das emittierte Licht mit einer empfindlichen Kamera erkennen, die am Ende des Lichtweges angeordnet ist. Diese Bildgebungsverfahren wird in der Regel auf dünne Proben beschränkt, wie Out-of Fokus Licht verschleiert im Fokus befindlichen Informationen in dickeren Proben. Die konfokale Mikroskope unterscheiden sich von Weitfeld - Systemen dadurch , dass sie gebaut werden Signale zu bevorzugen , die von der Fokusebene über diejenigen , die ihren Ursprung außerhalb des Fokus (dh &quot;optischen Schneidens&quot;) 28 stammen. Zu erreichen optischen Schneidens wird ein Pinhole im Emissionspfad in einer konjugierten Position zu der Punktlichtquelle angeordnet. Laser werden als Lichtquellen verwendet, und Signale werden mit Photomultipliern (PMTs) nachgewiesen. Praktisch wird ein LaserStrahl über die Probe Punkt-für-Punkt und der Fluoreszenzemission bei jedem Punkt (Pixel) swiped von der PMT detektiert wird. Hier Bild, das wir die gleichen subzellulärer Strukturen in Genaktivität leben beide mit großem Feld und konfokaler Mikroskopie mit einem direkten Vergleich der beiden Mikroskopie Modalitäten zur Verfügung zu stellen. Die zugrunde liegende Ziel solcher Vergleiche der Bereitstellung ist es, Richtlinien zu bieten für die am besten geeignete Mikroskopietechnik für die spezifische Frage auf der Hand entschieden haben. Mit Hilfe der beschriebenen Ansätze hier zeigen wir Gal4-UAS basiert die genetische Markierung der Mitochondrien und Zentrosomen. Diese Organellen sind in verschiedenen Zelltypen des Nervensystems und in Muskelzellen abzubildenden Verwendung Weitfeld und konfokale Mikroskopie die Eignung jedes Bildgebungsmodalität zu demonstrieren. Die hier beschriebenen Verfahren können leicht zur Untersuchung von anderen Organellen und subzellulären Strukturen im lebenden Zebrafischembryo angepasst werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose (2-hydroxyethylagarose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4018-10G</td>
			<td>Low-gelling temperature Type VII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block heater</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Thermomixer compact</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%&#160;</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>202967-50g</td>
			<td>To prepare 30x Danieau&#39;s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Retiga Exi Fast 1394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Coated Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Dumont - Fine Science Tools</td>
			<td>11252-50</td>
			<td>#5 Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000 Fluoview</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish heater</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>DH-35</td>
			<td>Heating ring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040-100G</td>
			<td>Tricaine (anesthetic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneClean kit</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>111001200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Culture Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-0-14-C</td>
			<td>35mm petri dish, 14mm microwell, No. 0 coverglass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass needles</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.&#160;</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>For microinjections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250g</td>
			<td>To prepare 30x Danieau&#39;s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning&#160;</td>
			<td>DCC000001242 150g</td>
			<td>Silicon dioxide grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>To maintain zebrafish embryos at 28.5&#8304; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7643-5kg</td>
			<td>To prepare 30x Danieau&#39;s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O &#160;&#160;Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230291-500g</td>
			<td>To prepare 30x Danieau&#39;s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>FemtoJet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>0.5-20uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Maerzhaeuser Wetzlar</td>
			<td>MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Intracel</td>
			<td>P/N 50-00XX-130-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>To transcribe PCS-Transposase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl BioXtra &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1kg</td>
			<td>To prepare 30x Danieau&#39;s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To measure DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Flaming/Brown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIR Apo 40x/0.80W&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Water-dipping-cone objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>PTU (prevents pigmentation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt AG&#160;</td>
			<td>821472</td>
			<td>92 x 16mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic molds&#160;</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td>For microinjections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas cover-with a hole</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tea-strainer (Plastic)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To collect zebrafish eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sarstedt AG&#160;</td>
			<td>86.1171</td>
			<td>3.5mL plastic transfer pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMPlanFI 100x/1.00W</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water-dipping-cone objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMPlanFLN 20x/0.50W&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water-dipping-cone objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (50x Stock)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water 
			Stir vigorously at room temperature&#160; 
			Store at -20 oC in 1 ml aliquots 
			Use at 1x working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (20x Stock)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water 
			Add 2 ml 1M Tris base (pH9) 
			Adjust to pH 7&#160; 
			Store at -20 oC in 1 ml aliquots 
			Use at 1x working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danieau&#39;s Solution (30x Stock)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1740 mM&#160; NaCl&#160; 
			&#60;21 mM&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; KCl&#160; 
			12 mM&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;MgSO4.7H2O&#160; 
			18 mM&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Ca (NO3)2 
			150 mM&#160;&#160;&#160; HEPES buffer&#160; 
			Distilled water upto 1 L&#160; 
			Store at 4 oC&#160; 
			Use at 0.3x working solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Hier wird die Verwendung von Weitfeld und konfokale Mikroskopie Bild Mitochondrien und Zentrosomen in Genaktivität leben direkt verglichen und gegenübergestellt. Je nach Lage der Zellen in dem Organell Dynamik untersucht und die Eigenfrequenz der spezifischen subzellulären Ereignisse zu werden, im allgemeinen entweder Weitfeld oder konfokalen Mikroskopie ist die bessere Wahl. Wir abzubildenden Organellen in RB Neuronen auf der Oberfläche des Embryos und in Netzhautzellen befindet tiefer. Die oberflächliche Lage des RB - Neuronen zusammen mit ihren zweidimensionalen Geometrie machen sie zu guten Kandidaten für sowohl Weitfeld und konfokale Mikroskopie (Abbildung 2) abgebildet wird. Importieren von Bildern der konfokalen Mikroskopie ist jedoch deutlich langsamer und zu einer Unterschätzung der Dynamik von spezifischen subzellulären Ereignissen führen können (zB Bewegung der Mitochondrien, 2C, D </strong&gt;). Bilder von retinalen durch Weitfeldmikroskopie erfasst Zellen leiden unter schlechten Kontrast als Fluoreszenzsignale aus einem großen Volumen von Gewebe Detail in der Brennebene verdeckt. Hier wird die optische Sektionierung Fähigkeit der konfokalen Mikroskopie Ergebnisse in deutlich verbesserten Kontrast (Abbildung 3). Zu ermöglichen gleichzeitige Visualisierung von Organellen und Zellmembranen verwendeten wir das Gal4-UAS-System in drei verschiedenen Konfigurationen. Zunächst wird die UAS MitoFish Reporter Linie Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) wurde mde6 verwendet. Hier ermöglicht eine bidirektionale UAS gleichzeitige Expression von mitochondrial gezielte GFP und Membran gezielt YFP. In Kombination mit geeigneten Gal4 Treiberleitungen, bezeichnen MitoFish den Mitochondrien und Zellmembranen von RB sensorischen Neuronen (2A-C) oder Netzhautzellen (3A, B) mit CFP und YFP r<html> espectively. Zweitens zwei UAS - Konstrukte (UAS: mitoCFP und UAS: MA-YFP) wurden mit einem Gal4 Treiber Konstrukt kombiniert (Sensory: Gal4-VP16, sensorischen Neuronen-spezifischen Enhancer - Elemente aus der kleinen Insel-1 - Gen) 7 in transienten Injektionen. Das Mosaik Ausdruck, der im Allgemeinen aus diesen Injektionen ergibt erlaubt die Verfolgung einzelner Zellen über Tage (Abbildung 2E). Ein dritter Ansatz verwendet, um die Verwendung von zwei UAS-Kassetten, die jeweils die Expression einer anderen Fusionsproteins auf einem einzigen zusammenhängenden Konstrukts antreibt. Diese Strategie wurde verwendet , CentrinFish Tg (UAS: cetn4-YFP, UAS: MA-Cerulean) zu erzeugen tum1, in dem ein centrin4-YFP Fusions Etiketten Zentrosomen und Cerulean richtet sich an Zellmembranen. In Kombination mit speziellen Linien Gal4 Treiber die Zentrosomen und Zellmembranen von Retinazellen (3C, D) oder Muskelfasern (Abbildung 4) sind markiert. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53456/53456fig2.jpg" /> Abbildung 2: Mitochondrien in vivo in RB sensorischen Neuronen von embryonalen Zebrabärbling Bildgebung. RB sensorischen Neuronen im kaudalen Teil der Flossenfaltung von 2 dpf MitoFish abgebildet wurden mit einer NA von 0,80 Benutzer Apochromat 40x Wasser-Tauchen-Kegel Ziel, entweder durch Weitfeld (A) oder die konfokale (B) Mikroskopie. Panels auf der rechten Seite zeigen Detail der Region skizziert. C Weitfeld - Zeitraffer-Bilder von einer kleinen Region von Interesse in der peripheren Laube eines RB Neuron in 2 dpf MitoFish. Die Bewegung eines einzigen Mitochondrium (Pfeil in 0 &#39;&#39;) wurde über 100 s verfolgt; sechs Zeitpunkte werden angezeigt. Die Position des Mitochondrium in der vorhergehenden Zeitpunkt wird in magenta dargestellt. D die Position des beweglichen Mitochondrium in C </strong&gt; wird über die 100 sec Zeitfenster mit einer Abtastfrequenz von 1 Hz (hellrosa) aufgetragen. Die Position des gleichen Mitochondrium wurde zusätzlich mit einem künstlich abwärts abgetastet zeitlichen Auflösung von 0,05 Hz zu imitieren, die typische Erfassungsgeschwindigkeit eines konfokalen Mikroskops (magenta) aufgetragen. Die Magenta - kymograph nicht offenbaren die feinen ungerichtete Bewegungen des verfolgten Mitochondrium, die zu einer Unterschätzung seiner Dynamik. E Konfokalbilder eines RB sensorischen Neuronen bei 2 und 3 dpf führen würde. Die Markierung von einzelnen RB-Zellen und deren Mitochondrien wurde erreicht durch Co-Injektion eines sensorischen Neuronen-spezifischen Gal4-Treiber bauen zusammen mit zwei UAS Reporterkonstrukte, UAS: mitoCFP und UAS: MA-YFP, bei der Ein-Zell-Stadium und Screening für isolierte Doppel -markierten Zellen. Das Bild ist kontrast invertiert und einzelne Mitochondrien sind schematisch als Magentapunkte dargestellt. Maßstabsbalken A, B 20 &amp; mgr; m, C 2 &amp; mgr; m,E 50 &amp; mgr; m. Mitochondrial gezielte GFP (mitoCFP), Membran gezielte YFP (MA-YFP). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53456/53456fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53456/53456fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53456/53456fig3.jpg" /> Figur 3: Vergleich der Weitfeld und konfokale Mikroskopie zu Bildorganellen in vivo in der embryonalen Zebrabärbling Retina. OTX2 Promotorelemente treiben die Expression von GFP in den Mitochondrien und YFP in Zellmembranen (A und B) oder YFP in Zentrosomen und Cerulean in Zellmembranen (C und D) in der Netzhaut von 2 dpf Genaktivität. Um dieses Markierungsmuster zu erreichen, Otx2: Es wurden Gal4 transgene Fische entweder gekreuzt MitoFish (A und B) or CentrinFish (C und D). Verwendung von Weitfeld (A, C) und konfokaler (B, D) Mikroskopie A 40x Wassertauchkonus apochromatischen Objektiv (NA 0,80) wurde verwendet , um Bilder von der gleichen Region in jeder Netzhaut zu erfassen. Einfügungen in A und B zeigen Detail einer Region der inneren Kernschicht, einfügungen in C und D zeigen eine Zelle in M-Phase. Maßstabsbalken 20 um. Mitochondrial gezielte GFP (mitoCFP), Membran gezielte YFP (MA-YFP), centrin4-YFP (cetn4-YFP), Membran gezielte Cerulean (MA-Cerulean). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53456/53456fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53456/53456fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53456/53456fig4.jpg" /> Figur 4: Vergleich der Weitfeld und konfokaler Microscopy zu Bild Zentrosomen in vivo. Eine einzelne Muskelfaser mit fluoreszierend markierten Zellmembranen und Zentrosomen (Otx2: Gal4; CentrinFish) wurde unter Verwendung von Breitfeld abgebildet (A) und konfokale (B) Mikroskopie. In beiden Fällen wird ein 40x Wasser-Tauchen-Kegel Apochromat Objektiv (NA 0,80) verwendet. Maßstabsbalken 10 um. Centrin4-YFP (cetn4-YFP), Membran gezielte Cerulean (MA-Cerulean) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53456/53456fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53456/53456fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.5K Aufrufe.  Technische Universität München. Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy. 

Serie: Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

Mess Protein Stabilität in Wohnzebrafischembryonen unter Einsatz von Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Induktion von Hypoxie im lebenden Frosch und Zebrafisch Embryonen

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Verwendung von Immunolabeling, stabilen, dynamischen und im Entstehen begriffene Mikrotubuli in Zebrafish Embryos zu analysieren

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Folgenden endokardialen Gewebe Bewegungen über Zelle Ladungszustand des Zebrafish Embryos

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...